JP2016500275A5 - - Google Patents

Claims (15)

1. 配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’−ｔ_ｎ’に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’を増幅するための、複数の増幅反応を含む方法であって、
   前記増幅反応の各々は、
   i． 配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む、左側の（フォワード）第１段階目のプライマーと、
   ii． 配列ｍ_ａ−Ｋ’−ｐ_ｃ’を含む、右側の（リバース）第１段階目のプライマーと、
   を用いて前記標的核酸配列を増幅して、第１の増幅産物を生成する第１段階目の増幅反応、及び
   iii． 配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む、左側の（フォワード）アダプタープライマーと、
   iv． 配列ａ_Ｌ’−ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’を含む、右側の（リバース）アダプタープライマーと、
   を用いて前記第１の増幅産物を増幅して、第２の増幅産物を生成する第２段階目の増幅反応を含み、
   ここで、
   ｔ_Ｖは、前記標的核酸配列における可変領域であり、
   ｐ_ｃは配列要素ｔ_Ｃと同一の配列を有し、かつｐ_ｃ’はｔ_Ｃ’に対する逆相補配列を有し、
   Ｋは配列要素ｋ_１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は配列要素ｋ_１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
   ここで、
   ｋ_１及びｋ_１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
   ｓ及びｓ’は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同一の配列であり、かつａ_Ｋ’の配列は配列要素ｋ_１’の配列と同一の配列であり、
   ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’はｍ_ａ−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
   ｐ_ｃ、ｐ_ｃ’、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
   ここで、
   前記複数の増幅反応の各々には、特有のプライマーのセットを用い、該プライマーのセットの各々において、
   ｋ_１は、他のプライマーセットのｋ_１と異なるものである、
   及び／又は
   ｋ_１’は、他のプライマーセットのｋ_１’と異なるものである。
2. Ｋは３’末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、かつＫ’は３’末端配列ｋ_１’−ｋ_２’−ｓ’を含み、
   ここで、ｋ_２の長さ及びｋ_２’の長さは、それぞれ独立して、２から７ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋ及びａ_Ｋ’はそれぞれ、ｋ_２及びｋ_２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
   前記プライマーのセットの各々の間で、ｋ_２及びｋ_２’はそれぞれ、他のｋ_２及びｋ_２’とは異なるものである、及び
   ｋ_１、ｋ_１’、ｓ及びｓ’は前記されたものである、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記プライマーのセットは、
   配列番号００１から０４５から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０４６から０５８から選択されるｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
   配列番号１８９から２３２から選択されるｐ_ｃを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号２３３から２４６から選択されるｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
   配列番号０５９から０８５から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号０８６から１１７から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマー、及び／又は
   配列番号１１８から１４９から選択されるａ_Ｌ−ａ_Ｐを含む第１段階目の左側（フォワード）プライマーと、配列番号１５０から１８２から選択されるｍ_ａを含む第１段階目の右側（リバース）プライマーを含む、
   請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記第１段階目の増幅及び／又は前記第２段階目の増幅において、３’末端から５’末端方向のエキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 配列断片ｔ_ｎ−ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’−ｔ_ｎ’に含まれる標的核酸配列ｔ_Ｃ−ｔ_Ｖ−ｔ_Ｃ’をシーケンシングする方法であって、
   ａ）請求項１、３又は４のいずれか１項に記載の方法を用いて前記標的核酸配列を増幅する工程、及び
   ｂ）配列要素ｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ’を含む前記第２の増幅産物をシーケンシングして、読み取った配列のセットを生成する工程
   を含む、方法。
6. 更に、
   ｃ） 前記配列のセットに含まれる各配列を、第１段階目のプライマーに含まれるｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ’とアライメントする工程、及び
   ｄ） コンタミネーションの指標として、前記配列のセットに含まれる各配列に対し０又は１の値を割り当てる工程であって、前記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）がｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ’と完全にアライメントした場合は値０を割り当て、前記配列のセットに含まれる配列（配列のセットに含まれるある特定の配列）とｍ_ａ−Ｋ及び／又はｍ_ａ−Ｋ’とのアライメントが不完全だった場合は値１を割り当てる工程
   を含み、
   ここで、
   （i）工程ｄ）で割り当てた値を全て加算し、読み取った全配列数で前記加算値を除算して、コンタミネーション物の百分率を算出する、及び／又は
   （ii）前記配列のセットから、値１を割り当てた配列を削除する、
   請求項５に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の、配列断片ｔ _ｎ −ｔ _Ｃ −ｔ _Ｖ −ｔ _Ｃ ’−ｔ _ｎ ’に含まれる標的核酸配列ｔ _Ｃ −ｔ _Ｖ −ｔ _Ｃ ’を増幅又はシーケンシングする方法に使用するためのプライマーのセットのコレクションであって、
   前記プライマーのセットの各々において、
   i．配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍ_ａ−Ｋ’−ｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対、及び
   ii．配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａ_Ｌ’−ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対
   を含み、
   ここで、
   ｐ_ｃは標的配列のｔ_Ｃに対し相補的な配列を有し、かつｐ_ｃ’はｔ_Ｃ’に対する逆相補配列を有し、
   Ｋは配列要素ｋ_１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は、配列要素ｋ_１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
   ここで、
   ｋ_１及びｋ_１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
   ｓ及びｓ’は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同じあり、かつａ_Ｋ’の配列は配列要素ｋ_１’の配列と同じであり、
   ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’はｍ_ａ−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
   ｐ_ｃ、ｐ_ｃ’、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
   ここで、
   前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、全てのｐ _ｃ は同じ配列を有し、かつ全てのｐ _ｃ ’は同じ配列を有し、
   前記プライマーのセットの各々において、
   ｋ _１ は、他のプライマーのセットのｋ _１ と異なるものである、及び／又は
   ｋ _１ ’は、他のプライマーのセットのｋ _１ ’と異なるものである、
   プライマーのセットのコレクション。
8. 前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｐ _ｃ は配列番号００１から０４５から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｐ _ｃ ’は配列番号０４６から０５８から選択され、及び／又は
   前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｐ _ｃ は配列番号１８９から２３２から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｐ _ｃ ’は配列番号２３３から２４６から選択され、及び／又は
   前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるｍ _ａ は配列番号０５９から０８５から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｍ _ａ は配列番号０８６から１１７から選択され、及び／又は
   前記第１段階目の左側（フォワード）プライマーであるａ _Ｌ −ａ _Ｐ は配列番号１１８から１４９から選択され、かつ前記第１段階目の右側（リバース）プライマーであるｍ _ａ は配列番号１５０から１８２から選択される、
   請求項７に記載のプライマーのセットのコレクション。
9. Ｋは３’末端配列ｋ_１−ｋ_２−ｓを含み、かつＫ’は３’末端配列ｋ_１’−ｋ_２’−ｓ’を含み、
   ここで、ｋ_２の長さ及びｋ_２’の長さは、それぞれ独立して、２から７ヌクレオチド長であり、
   ａ_Ｋ及びａ_Ｋ’はそれぞれ、ｋ_２及びｋ_２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものであり、
   前記プライマーのセットの各々において、
   ｋ_２は、他のプライマーのセットのｋ_２と異なるものである、及び／又は
   ｋ_２’は、他のプライマーのセットのｋ_２’と異なるものであって、
   ｋ_１、ｋ_１’、ｓ及びｓ’は前記されたものである、
   請求項８に記載のセットのコレクション。
10. ４、８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０、１６０、２００、２５６又は１０２４個の相異なるプライマーのセットを含む、
    請求項７〜９のいずれか１項に記載のセットのコレクション。
11. ｋ_１及びｋ_１’並びに／又はｋ_２及びｋ_２’は、ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とはハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
    配列要素ａ_Ｐの配列は全て同じであり、配列要素ａ_Ｐ’の配列は全て同じである、及び／又は
    ａ_Ｋ及びａ_Ｋ’はそれぞれ、ｋ_２及びｋ_２’とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
    請求項７〜１０のいずれか１項に記載のセットのコレクション。
12. 請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプライマーのセットのコレクションを複数含む、コレクション集合であって、前記コレクションの各々は、相異なるｐ_ｃ及びｐ_ｃ’の組み合わせによって特徴付けられる、コレクション集合。
13. 各ｐ_ｃは、配列番号００１から０４５から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃの配列は配列番号００１から０４５から選択される配列であり、かつ、各ｐ_ｃ’は配列番号０４６から０５８から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃ’の配列は配列番号０４６から０５８から選択される配列である、又は、
    各ｐ_ｃは、配列番号１８９から２３２から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃの配列は配列番号１８９から２３２から選択される配列であり、かつ、各ｐ_ｃ’は配列番号２３３から２４６から選択される配列を含む、若しくは各ｐ_ｃ’の配列は配列番号２３３から２４６から選択される配列である、
    請求項１２に記載のコレクション集合。
14. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の、配列断片ｔ _ｎ −ｔ _Ｃ −ｔ _Ｖ −ｔ _Ｃ ’−ｔ _ｎ ’に含まれる標的核酸配列ｔ _Ｃ −ｔ _Ｖ −ｔ _Ｃ ’を増幅又はシーケンシングする方法に使用するための、複数のプライマーのセットのコレクションであって、ここでプライマーのセットの各々は、
    i．配列ｍ_ａ−Ｋ−ｐ_ｃを含む第１段階目の左側プライマー及び配列ｍ_ａ−Ｋ’−ｐ_ｃ’を含む第１段階目の右側プライマーを含む第１段階目のＰＣＲプライマー対、及び
    ii．配列ａ_Ｌ−ａ_Ｐ−ａ_Ｋを含む左側のアダプタープライマー及び配列ａ_Ｌ’−ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターＰＣＲプライマー対
    を含み、
    ここで、
    ｐ_ｃは標的配列のｔ_Ｃに対し相補的な配列を有し、かつｐ_ｃ’はｔ_Ｃ’に対する逆相補配列を有し、
    Ｋは配列要素ｋ_１及び３’末端配列要素ｓを含み、かつＫ’は、配列要素ｋ_１’及び３’末端配列要素ｓ’を含み、
    ここで、
    ｋ_１及びｋ_１’の長さは、それぞれ独立して、２から９ヌクレオチド長であり、
    ｓ及びｓ’は、配列要素ｔ_ｎ及びｔ_ｎ’とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、ｓ及びｓ’の長さは、それぞれ独立して、１、２、３、４又は５ヌクレオチド長であり、
    ａ_Ｋの配列は配列要素ｋ_１の配列と同じあり、かつａ_Ｋ’の配列は配列要素ｋ_１’の配列と同じであり、
    ａ_Ｐ−ａ_Ｋはｍ_ａ−Ｋ内の連続した配列とハイブリッドを形成し、ａ_Ｐ’−ａ_Ｋ’はｍ_ａ−Ｋ’内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
    ｐ_ｃ、ｐ_ｃ’、ｍ_ａ−Ｋ及びｍ_ａ−Ｋ’の配列の長さは、それぞれ独立して、１０から４０ヌクレオチド長であり、ａ_Ｌ及びａ_Ｌ’はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
    ここで、
    前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、配列要素Ｋ及びＫ’は全て同じであり、
    前記プライマーのセットの各々において、
    ｐ _ｃ は他のプライマーのセットのｐ _ｃ と異なる、及び／又は
    ｐ _ｃ ’は他のプライマーのセットのｐ _ｃ ’と異なる、
    複数のプライマーのセットのコレクション。
15. 患者のＴ細胞受容体β鎖のレパトアをex vivoで分析する方法であって、
    請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法、又は請求項７〜１４のいずれか１項に記載のプライマーのセットのコレクションを使用する、方法。