JP2016500257A5

JP2016500257A5 -

Info

Publication number: JP2016500257A5
Application number: JP2015545900A
Authority: JP
Filing date: 2013-12-06
Publication date: 2019-02-14
Anticipated expiration: 2033-12-06

Description

他の態様において、本明細書に開示される実施形態は、複数のアンプリコンを含むアレイにおいて合成によりシークエンシングのサイクルを実施するように形成された流体取扱い（ｆｌｕｉｄｉｃｓｈａｎｄｌｉｎｇ）システムを備え、放射線を線源からアレイへ方向付け、アレイからの蛍光発光をカメラへ方向付けるように形成された検出システムであって、アレイへ方向付けられた放射線の暴露レベルを増大させるために検出システムを自動的に変更し、増大された暴露レベルにおいてアレイからカメラへの蛍光発光を検出するように形成されたシステムコントロールインターフェースを備える検出システムを提供するステップと、多重ライゲーション依存性プローブ増幅によって複数のアンプリコンを提供するステップと、複数のアンプリコンの配列を決定するステップとを有してなる方法を提供する。

蛍光標識ヌクレオチドを検出するための１つの方法は、標識ヌクレオチドに特異的な波長の放射線の使用、または他の適切な照射源の使用を含む。ヌクレオチド上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適切な検出手段によって検出され得る。

図２を参照すると、本明細書に開示される実施形態に従って、ＭＬＰＡ−ＳＢＳアッセイのための例示的な方法を要約するフロースキームが示されている。図２に示されるように、ＤＮＡの検索サンプルは、ゲノム標的を横切ってハイブリダイズする５’および３’ハーフプローブ（左側プローブおよび右側プローブ）を含むプローブセットによってハイブリダイズされる。ハーフプローブは、ゲノム標的上で互いに隣接するように選択され、従って、プローブセットのライゲーションが可能になる。ハーフプローブは、ＰＣＲ増幅において使用され得るアダプター配列も備える。ライゲーションの後、連結プローブセットは、修飾順方向および逆方向プライマーを用いてＰＣＲ増幅される。これらは、ハーフプローブの標的特異的部分に隣接するアダプター配列に相補的であるように選択されるユニバーサルプライマーである。次に、ＰＣＲ増幅によって生成されたアンプリコンを配列決定することができる。いくつかの実施形態では、適切なシークエンシング法は、ＭＩＳＥＱ（登録商標）の利用により開発された次世代シークエンシング（ＮＧＳ）システムまたはＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＨＩＳＥＱ（登録商標）システムプラットホームを含むことができる。いくつかの実施形態では、このような検出システムは、複数のアンプリコンを含むアレイにおいて合成によりシークエンシングのサイクルを実施するように形成された流体取扱いシステムと、放射線を線源からアレイへ方向付け、アレイからの蛍光発光をカメラへ方向付けるように形成された検出システムと、アレイへ方向付けられた放射線の暴露レベルを増大させるために検出システムを自動的に変更し、増大された暴露レベルにおいてアレイからカメラへの蛍光発光を検出するように形成されたシステムコントロールインターフェースとを含み得る。図３は図２に示されるものと同様の方法のフロースキームを示し、インデキシング配列が修飾逆方向プライマーに提供されている。フロースキームの順序は同じであるが、得られるアンプリコン中にインデキシング配列が見られ、多数の線源からの標的核酸の同定を容易にする。

Claims

多重ライゲーション依存性プローブ増幅による、複数の異なる標的核酸を１回の実行で検索する方法であって、
（ａ）少なくとも１００の異なる、ゲノムＤＮＡである標的核酸を検索するためのサンプル組織を提供するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１００の異なる標的核酸のそれぞれに対する複数の異なるプローブセットであって、各々が、
第１のアダプター配列および第１の標的特異的部分からなる第１の遺伝子座特異的プローブと、
第２のアダプター配列、および前記第１の標的特異的部分に隣接する第２の標的特異的部分からなる第２の遺伝子座特異的プローブと
を含むプローブセットを提供するステップと、
（ｃ）前記複数の異なるプローブセットを前記少なくとも１００の異なる標的配列にハイブリダイズさせて、少なくとも１００のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
（ｄ）前記少なくとも１００のハイブリダイゼーション複合体を連結して、少なくとも１００の連結プローブを形成するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１００の連結プローブを増幅して少なくとも１００のアンプリコンを形成するステップであって、前記第１のアダプター配列に相補的な領域を含む第１のユニバーサルプライマーと、前記第２のアダプター配列に相補的な領域を含む第２のユニバーサルプライマーとを用いて実行される増幅ステップと、
（ｆ）前記少なくとも１００のアンプリコンのそれぞれを配列決定することによって、長さに関係なく前記複数のアンプリコンを検出システムで検出するステップと
を有してなる方法。
前記少なくとも１００の異なる標的核酸のそれぞれについてコピー数を決定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００よりも多いことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００〜５００の範囲の標的核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００〜１，０００の範囲の標的核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００〜１０^８の範囲の標的核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記検出システムが合成によるシークエンシングを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
前記検出システムが、前記少なくとも１００の異なるアンプリコンを含むアレイにおいて合成によりシークエンシングのサイクルを実施するように形成された流体取扱いシステムを備え、該検出システムが、放射線を線源から前記アレイへ方向付け、前記アレイからの蛍光発光をカメラへ方向付けるように形成され、該検出システムが、前記アレイへ方向付けられた放射線の暴露レベルを増大させるために前記検出システムを自動的に変更し、増大された暴露レベルにおいて前記アレイから前記カメラへの蛍光発光を検出するように形成されたシステムコントロールインターフェースを備えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
一塩基多型を検出するステップを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１００の異なる標的核酸の少なくとも一部分のメチル化度を決定するステップを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１００の異なるアンプリコンの配列を決定するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。