CN109402232A

CN109402232A - 一种用于检测的组合物及检测方法

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Publication number: CN109402232A
Application number: CN201811237061.4A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 罗云波; 牛晨启; 黄昆仑; 徐瑗聪; 杜再慧; 贺晓云
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明提供了一种用于检测的组合物及检测方法。本发明将传统MLPA中的填充序列换成一段与荧光探针序列一致的序列。由于这一巧妙的设计，本发明建立的F‑MLPA方法将现有MLPA方法变为可定量、可视化检测技术，且设计的荧光探针只能与探针连接产物的PCR产物相结合，避免了假阳性现象。在一个具体的实施例中，通过本发明设计的探针序列、Taqman荧光探针，和本发明建立的F‑MLPA方法，最终成功实现了转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40‑3‑2的特异性检测，检测的灵敏度均达到了1nM。此外，本发明建立的F‑MLPA方法和体系，是一种能够同时对外源特异基因和内参基因进行定量检测的多重PCR反应体系，可以实现转基因成分的准确定量检测。本发明为检测产品或方法的研发提供了一个新的平台和思路。

Description

一种用于检测的组合物及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测的组合物及检测方法。

背景技术

2016年，国际农业生物技术组织(International Service for the Acquisitionof Agri-Biotech Applications，ISAAA)公布的《2016年全球生物技术/转基因农作物商业化发展趋势》报告中指出，从1996年到2016年，转基因农作物的种植面积从170万公顷到迅猛增长至185.4百万公顷。2016年，全球生物转基因技术农作物种植面积相对于2015年179.7百万公顷的种植面积增加了570万公顷。在转基因技术飞速发展的同时，有关转基因食品的毒性、耐药性、过敏性等安全问题越来越引起公众的关注，某些有关转基因的争论甚至已经影响了公众对转基因的态度。近45年来，人类对近67555种转基因食品和食品成分的使用经验表明，经过严格的安全性评价审批程序进入市场的转基因食品与传统食品具有实质等同性，不会对人类健康造成额外的风险。但出于经济因素和国际政治因素的影响，许多国家加强对转基因作物的安全管理，颁布法规对转基因作物以及其产品进行标识管理。

随着越来越多的转基因作物品系商品化，转基因作物的检测面临着越来越大的挑战。品系的增多使得传统的单重检测方法工作量、工作时间和检测成本都大大增加，因此，转基因多重检测技术应运而生并且得到了很好地发展。多重PCR(Multiplex PCR)技术是研究的比较成熟的检测技术，它是指同一个反应体系中同时添加有两对或者两对以上引物，通过热循环过程同时扩增出两对或两对以上的核酸片段的PCR技术。多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)

技术是一种依赖连接酶的定性和半定量多重核酸检测技术，现在已经在人类基因组学、分子细胞生物学、肿瘤诊断学等领域应用。

MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。多重连接依赖探针扩增技术由于左右连接探针进行特异性的连接探针杂交反应，能够有效避免非特异性产物的产生；且上下游连接探针中含有相同的通用引物序列，在第二步的PCR扩增过程中发挥通用引物多重PCR的优势，解决了各个连接产物之间扩增效率不一致的问题。

传统的MLPA技术依赖毛细管电泳来作为产物的检测手段，通过毛细管电泳结果分析片段峰位置和峰面积的变化来得出结论，操作繁琐，费时费力。有的研究对传统方法进行改进，采取标记荧光的方法来更加方便辨别电泳峰，但这种方法且成本较高。且它们均无法对目标序列进行准确定量，无法满足各个国家对于转基因标识制度中必须的定量需求。

发明内容

本发明提供了一种用于检测的组合物及检测方法。本发明通过结合Taqman荧光探针和多重连接依赖探针扩增技术，建立了一种新型荧光多重连接依赖探针扩增技术体系(Fluorescence Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，F-MLPA)。本发明设计一对连接探针，分别是左连接探针(上游探针)和右连接探针(下游探针)。左连接探针包括5′末端的通用序列和3′端的与靶序列特异性结合的杂交序列；右连接探针的杂交序列包括在5′端的与模板特异杂交序列，3′端的通用序列，以及在两者之间的一段填充序列，填充的序列与荧光探针的序列一致。F-MLPA的反应过程分为两步，第一步是连接探针与靶标序列杂交结合，之后连接酶发挥作用将长短两条探针连接行成一条完整的单链；第二步是实时荧光定量PCR反应。以第一步过程中形成的单链为模板，用与通用序列互补的核酸序列作为实时荧光定量PCR反应过程中的引物进行扩增，PCR反应过程中，TaqMan荧光探针被水解发出荧光，在实时荧光定量PCR仪器中读取荧光信号实现定量检测。且由于TaqMan荧光探针的序列与右连接探针中的序列完全一致，如果没有模板存在，不能形成完整单链，继而不能形成互补链与TaqMan荧光探针杂交结合，因此本方法的背景荧光信号值极低，不会造成假阳性影响实验结果的判定。

本研究以转基因玉米MON810和转基因大豆GTS 40-3-2为研究对象，针对两个品系的事件特异性基因和两种作物的内参基因设计连接探针，验证F-MLPA方法的可靠性、优化方法并且探索该方法的定量检测限，为后续连接探针的设计提供数据支持。

本发明的一个目的是提供一种组合物，所述组合物至少包括下述1)和2)所述的核酸序列：

1)从5′→3′的连接方向，依次包括：5′端通用引物序列、与荧光探针的核苷酸序列一致的核苷酸序列、与部分和/或全部靶核苷酸序列的碱基互补结合的核苷酸序列；

2)从5′→3′的连接方向，依次包括：与部分和/或全部靶核苷酸序列的碱基互补结合的核苷酸序列、3′端通用引物序列；且核酸序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰。

所述通用引物包括传统MLPA技术中所述的通用引物或其互补序列。

具体的，所述组合物还包括下述1)-8)中的至少一种：

1)荧光探针；具体的，所述荧光探针包括一核苷酸序列，且所述核苷酸序列的5′端标记有荧光报告基团或荧光淬灭基团，3′端标记有荧光淬灭基团或荧光报告基团；

2)连接酶；具体的，所述连接酶包括可催化下述反应的酶：将一条核苷酸序列的3′端连接到另一条核苷酸序列的5′端，且所述5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；

3)连接酶反应缓冲液；

4)实时荧光定量PCR反应缓冲液；

5)实时荧光定量PCR反应的引物对，其中，一条引物的核苷酸序列与本发明所述5′端通用引物序列的核苷酸序列一致，另一条引物的核苷酸序列与本发明所述3′端通用引物序列的核苷酸序列反向互补；

6)dNTP；

7)所述5′端通用引物序列包括序列表中的SEQ ID №：15所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

8)所述3′端通用引物序列序列包括序列表中的SEQ ID №：16所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：16所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：16所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。

和/或具体的，所述组合物还包括下述1)-13)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：5所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：6所示的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；和/或将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；

3)序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID №：8所示的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；和/或将序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；

5)序列表中SEQ ID №：9所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

6)序列表中SEQ ID №：10所示的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；和/或将序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；

7)序列表中SEQ ID №：11所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：11所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

8)序列表中SEQ ID №：12所示的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；和/或将序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列，且序列的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰；

9)当所述组合物还包括荧光探针时，所述荧光探针的核苷酸序列为序列表中SEQID №：13所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：13所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：13所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

10)当所述组合物还包括荧光探针时，所述荧光探针的核苷酸序列为序列表中SEQID №：14所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：14所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：14所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

11)当所述组合物还包括荧光探针时，所述荧光探针的5′端标记了荧光基团VIC，3′端标记了荧光淬灭基团BHQ1；

12)当所述组合物还包括荧光探针时，所述荧光探针的5′端标记了荧光基团FAM，3′端标记了荧光淬灭基团BHQ1；

13)当所述组合物还包括实时荧光定量PCR反应的引物对时，所述实时荧光定量PCR反应的一条引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：15所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述实时荧光定量PCR反应的另一条引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：17所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：17所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：17所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明任一所述的组合物。

本发明的再一个目的是提供一种检测方法，所述检测方法包括使用本发明任一所述的组合物、或本发明任一所述试剂盒进行检测。

具体的，所述检测方法还包括下述1)-5)中的至少一种：

1)待测DNA样品变性反应；具体的，变性反应的反应条件包括于98℃反应5min，然后降温至25℃以下；再具体的，所述降温包括将反应完的离心管迅速置于冰水中保持20min以上；

2)本发明任一所述组合物与靶核苷酸序列的杂交反应；具体的，所述杂交反应的反应条件包括95℃1min，60℃0.5h以上，54-58℃暂停；优选的，所述杂交反应的反应条件为95℃1min，60℃0.5h，58℃暂停；

3)本发明任一所述组合物与靶核苷酸序列杂交后的连接反应；具体的，所述连接反应的反应条件包括54-58℃15min，98℃5min，20℃暂停；优选的，所述连接反应的反应条件包括58℃15min，98℃5min，20℃暂停；

4)实时荧光定量PCR反应，所述实时荧光定量PCR反应的反应体系中的一条引物的核苷酸序列与本发明所述5′端通用引物序列的核苷酸序列一致，另一条引物的核苷酸序列与本发明所述3′端通用引物序列的核苷酸序列反向互补；反应条件为95℃变性10min，40个循环包括：95℃变性30s，54-58℃退火30s和72℃延伸30s，最后72℃延伸10min；

具体的，所述实时荧光定量PCR反应的反应体系中的一条引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：15所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述实时荧光定量PCR反应的反应体系中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：17所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID№：17所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：17所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

和/或具体的，反应条件优选为95℃变性10min，40个循环包括：95℃变性30s，58℃退火30s和72℃延伸30s，最后72℃延伸10min

5)实时荧光定量PCR反应结果的检测，所述检测包括定性和/或定量检测。

本发明任一所述组合物、本发明4所述试剂盒、或本发明任一所述方法的应用。

具体的，所述应用包括下述1)-6)中的至少一种：

1)单重检测；

2)多重检测；

3)定性检测；

4)定量检测；

5)转基因检测；具体的，包括转基因玉米MON810和/或转基因大豆GTS40-3-2的检测检测

6)SNP突变检测。

在设计序列时应注意：(1)通用引物上下游序列退火温度应尽量保持一致，记为Tm1。(2)左右连接探针的退火温度应尽量保持一致，记为Tm2。(3)TaqMan荧光探针的退火温度应比PCR使用的引物高8-10度左右，记为Tm3。(4)Tm1＜Tm2＜Tm3，期间有个5度左右的区别。(5)Tm1＜杂交温度＜Tm2，通过控制杂交温度可以使杂交序列与目的基因的杂交不受干扰。(6)Tm1＜PCR的退火温度＜Tm3，通过控制PCR程序的退火温度来保证TaqMan荧光探针优先于通用引物与模板结合，从而提高该方法灵敏度和稳定性。

本发明的有益效果包括：

本发明提供了一种新型荧光多重连接依赖探针扩增技术(FluorescenceMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification，F-MLPA)，该方法将现有MLPA方法变为可定量、可视化检测，且设计的TaqMan荧光探针只能与探针连接产物的PCR产物相结合，避免了假阳性现象。本发明提供的F-MLPA方法和体系，丰富了现有检测技术和方法，为新的检测产品或方法的研发提供了一个新的平台和思路。

随着转基因作物的种类和数量逐年增加，待检测目的基因的数量也越来越多，需要稳定和有效的多重检测方法来满足转基因作物检测和安全管理的要求。F-MLPA方法中，由于荧光探针的序列理论上是随意设计的，所以针对不同的转基因品系，在设计连接探针时，只需要更改杂交序列即可，TaqMan探针可以作为通用探针对所有转基因品系进行定量检测，可以满足不断增加的转基因作物混合样品和复合性状转基因作物成分筛查的要求，具有非常广阔的应用前景，也可用于转基因复合性状的检测。此外，该技术还为多重PCR在需要微量基因组精确定量领域的应用提供了一种思路，如：临床诊断、SNP突变检测等。

在一个具体的实施方式中，通过本发明设计的探针序列、Taqman荧光探针，和本发明建立的F-MLPA方法，最终成功实现了转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-3-2的特异性检测，检测的灵敏度均达到了1nM。

在一个具体的实施方式中，本发明建立的F-MLPA方法和体系，是一种能够同时对转基因作物的外源特异基因和内参基因进行定量检测的多重PCR反应体系，可以实现转基因成分的准确定量检测。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明提供的新型荧光多重连接依赖探针扩增技术体系(FluorescenceMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification，F-MLPA)的技术方案原理图。

图2为连接探针反应过程中的DNA变性过程的优化实验结果图；其中，M代表DNAmarker DL2000，泳道1-2为立刻放置于冰水中的结果，泳道3-4为PCR仪冷却到25℃的结果，泳道5-6为立刻放置于冰水中的阴性对照，泳道7-8为PCR仪冷却到25℃的阴性对照。

图3为连接探针反应过程中的杂交反应时间的优化结果图；图中曲线从下到上依次为杂交反应时间0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h的曲线结果。

图4通用引物PCR扩增程序中的退火温度优化结果图；其中，泳道1-2：52℃；泳道3-4：54℃；泳道5-6：56℃；泳道7-8：58℃；泳道9-10：60℃；泳道1、3、5、7、9是转基因玉米MON810检测体系的结果，泳道2、4、6、8、10是转基因大豆GTS 40-3-2检测体系的结果。

图5为单重可行性验证实验结果图；其中，M代表DNA marker DL2000，泳道1-4：MON810(3-4为阴性对照)；泳道5-8：ZSS(7-8为阴性对照)；泳道9-12：GTS 40-3-2(11-12为阴性对照)；泳道13-16：LEC(15-16为阴性对照)；泳道17-18：PCR过程的阴性对照。

图6为多重可行性验证实验结果图；其中，A为转基因玉米MON810的基因组作为模板时的检测结果图，B为转基因大豆GTS 40-3-2的基因组作为模板时的检测结果图。

图7为单重灵敏度实验结果图，其中A：Mon810-2F/2R；B：ZSS-2F/2R；C：GTS-2F/2R；D：LEC-2F/2R；曲线a：10μM；曲线b：1μM；曲线c：0.1μM；曲线d：10nM；曲线e：1nM。

图8为玉米的多重灵敏度实验结果图，其中，A为扩增曲线，B为标准曲线。

图9为大豆的多重灵敏度实验结果图，其中，A为扩增曲线，B为标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的，所用的DNA连接酶购自荷兰MRC-Holland公司；Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；SuperReal PreMix(SYBR Green)以及SuperReal PreMix(Probe)购自北京天根生化科技有限公司。

下述实施例主要以转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-3-2为例，详细说明本发明提供的新型荧光多重连接依赖探针扩增技术体系(Fluorescence MultiplexLigation-dependent Probe Amplification，F-MLPA)的技术方案，即转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-3-2及其相关核苷酸序列的使用是为了详细解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的不当限定，不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。

下述实施例所建立的新型荧光多重连接依赖探针扩增技术体系(FluorescenceMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification，F-MLPA)的原理如图1所示。

实施例1、新型荧光多重连接依赖探针扩增技术体系F-MLPA的建立

(一)连接探针序列的设计

根据待检测或待扩增目标核苷酸序列的全部或部分序列(以下简称序列A)，获得与待检测或待扩增目标核苷酸序列相互补结合的核苷酸序列(以下简称序列C)，将所述互补结合的核苷酸序列分为两部分即两条核苷酸序列(以下简称序列C1、序列C2，需要指出的是，序列C1、序列C2没有前后顺序之分，只是单纯用来表示所述两部分中的不同的部分，或两条核苷酸序列中的不同的核苷酸序列)，其中一部分(序列C1)用于设计上游连接探针，另一部分(序列C2)用于设计下游连接探针。

以下叙述中，与标记有荧光基团的探针(例如Taqman探针)具有相同核苷酸序列的序列简称为P序列；在多重反应体系中，如果存在多种荧光基团，则与不同荧光基团所标记的探针具有相同核苷酸序列的序列分别通过P1、P2、P3……Pn(n为自然数)的方式来表示和区分，其中P1、P2、P3……Pn(n为自然数)之间没有前后顺序之分，只是单纯用来表示或区分不同的核苷酸序列。

上游连接探针的核苷酸序列结构为：从5′→3′的连接方向，依次包括通用引物序列、P序列和C1序列。

下游连接探针的核苷酸序列结构为：从5′→3′的连接方向，依次包括C2序列和通用引物序列，且下游连接探针R的5′端的第一个核苷酸经过磷酸化修饰。

具体的，本实施例根据转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-3-2的序列信息，分别针对表1所示玉米内标基因ZSS、大豆内标基因LEC、转基因玉米MON810转化事件特异性基因MON810和转基因大豆GTS 40-3-2转化事件特异性基因GTS 40-3-2(以下简称GTS)4个基因中的部分核苷酸序列(相当于上述序列A)，设计了4组上游连接探针F和下游连接探针R，并设计了用于检测内参基因的通用Taqman荧光探针EDO-VIC和用于检测转基因序列的通用Taqman荧光探针GMO-FAM。具体的4组连接探针序列和2条荧光探针序列如表2所示。

表1

表2

表2中，序列中的P代表磷酸化修饰；Taqman荧光探针GMO-FAM为将序列表中SEQ ID№：13所示核苷酸序列的5′端标记了荧光基团FAM，3′端标记了荧光淬灭基团BHQ1；Taqman荧光探针EDO-VIC为将序列表中SEQ ID №：14所示核苷酸序列的5′端标记了荧光基团VIC，3′端标记了荧光淬灭基团BHQ1。

表2中，连接探针序列Mon810-2F和Mon810-2R是根据表1中选自MON810基因的核苷酸序列设计的，用于特异性扩增、识别或检测转基因玉米MON810转化事件特异性基因MON810；连接探针序列ZSS-2F和ZSS-2R是根据表1中选自ZSS基因的核苷酸序列设计的，用于特异性扩增、识别或检测玉米的内参基因；连接探针序列GTS-2F和GTS-2R是根据表1中选自GTS基因的核苷酸序列设计的，用于特异性扩增、识别或检测转基因大豆GTS 40-3-2转化事件特异性基因GTS 40-3-2；连接探针序列LEC-2F和LEC-2R是根据表1中选自LEC基因的核苷酸序列设计的，用于特异性扩增、识别或检测大豆的内参基因。

表2中，4个上游连接探针(Mon810-2F、ZSS-2F、GTS-2F和LEC-2F)的5′端均设计了通用引物序列5′-TTTGGTCGTGGTGGTGG-3′(序列表中的SEQ ID №：15)；在4个下游连接探针(Mon810-2R、ZSS-2R、GTS-2R和LEC-2R)的3′端均设计了通用引物序列5′-GGGGAAGGAGGGAAGGG-3′(序列表中的SEQ ID №：16)。

表2中，在上游连接探针Mon810-2F和GTS-2F的通用引物序列后边均设计了一段与Taqman荧光探针GMO-FAM的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID №：13)一致的核酸序列(相当于上述序列P1)；在上游连接探针ZSS-2F和LEC-2F的通用引物序列后边均设计了一段与Taqman荧光探针EDO-VIC的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID №：14)一致的核酸序列(相当于上述序列P2)。

表2所示序列均由人工合成获得。

(二)连接探针反应体系和反应过程的建立

制备用于连接探针反应的待检测或待扩增物样品。本实施例具体为提取待检测物转基因玉米MON810或转基因大豆GTS 40-3-2的基因组DNA(以下简称DNA样品)。

本实施例建立的具体连接探针反应体系和反应过程为：

连接探针反应过程分为DNA变性(对应表3中的反应步骤MLPA-1)、杂交反应(对应表3中的反应步骤MLPA-2)和连接反应(对应表3中的反应步骤MLPA-3)三步，如表3所示，分别在PCR仪上设置所述三步对应的反应程序。

表3

每步的具体实验过程为：

DNA变性：

1、向100μl离心管中加入5μl DNA样品；

2、运行MLPA-1，结束后立刻取出管子，迅速放置于冰水中，保持20min。之后取出管子进行下一步操作。

杂交反应：

1、将连接探针均匀得probemix(溶剂为水)，涡旋MLPA buffer和MLPA probemix(所述MLPA buffer和MLPA probemix为荷兰MRC-Holland公司试剂盒中的产品)。

2、制备hybridisation master mix。每个样品：1.5μl MLPA buffer+1.5μlprobemix(探针浓度10μM)。吹吸或者震荡混匀。

3、向每个样品加入3μl hybridisation master mix，吹吸混匀

4、继续在PCR上运行MLPA-2，暂停后取出管子，进行下一步操作。

连接反应：

1、涡旋Ligase Buffer A和Ligase Buffer B(所述Ligase Buffer A和LigaseBuffer B为荷兰MRC-Holland公司试剂盒中的产品)；

2、制备Ligase-65master mix。每个样品：25μl dH₂O+3μl Ligase Buffer A+3μlLigase Buffer B，最后加入1μl Ligase酶(所述Ligase酶为荷兰MRC-Holland公司试剂盒中的产品)，温和的吹吸混匀。

3、到58℃后，向每个样加入32μl Ligase-65master mix。温和的吹吸混匀。

4、继续运行MLPA-3。暂停后可以将管子取出PCR仪。

(三)通用引物PCR扩增及荧光探针的结合的反应体系和反应过程的建立

具体的，本实施例选用了如表4所示的通用引物序列进行实时荧光定量PCR反应。

表4

本实施例实时荧光定量PCR反应体系如表5所示。

表5

表5中，连接探针杂交产物为步骤(二)所得产物；FAM荧光探针具体为表2中的GMO-FAM；VIC荧光探针具体为表2中的EDO-VIC。

本实施例实时荧光定量PCR反应过程为：

本反应在实时荧光定量PCR上进行，反应条件为95℃变性10min，40个循环包括：95℃变性30s，58℃退火30s和72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

实施例2、条件优化实验

(一)连接探针反应过程中的DNA变性过程的优化

荷兰MRC-Holland公司试剂盒说明书上的单链制备过程即DNA变性过程是95℃5min，然后降温至25℃。

实施例1将DNA变性过程改为98℃5min，然后迅速放置于冰水中，保持20min。

以转基因作物MON810为模板，以MON810为目的基因，将上述二者所述DNA变性过程进行对比优化。2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

DNA变性过程优化结果如图2所示。从图2中可以看出，将DNA变性过程改为98℃5min，然后迅速放置于冰水中，连接产物的扩增产物更加清晰。

(二)连接探针反应过程中的杂交反应时间的优化

按照实施例1所述的连接探针反应过程操作，不同的是，以转基因作物MON810为模板，以MON810为目的基因，在杂交反应过程中，杂交反应时间分别设置为0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h，以验证杂交时间对该技术的影响。

杂交反应时间优化实验的结果如图3所示。图3结果显示，杂交时间在0.5h的时间后，杂交程度已经接近最大，且杂交时间不同的Ct值并没有明显差别，再延长杂交时间不会对扩增结果造成影响，因此，实施例1选择时间较短的0.5h杂交时间进行后续实验。

(三)通用引物PCR扩增程序中的退火温度优化

分别以转基因玉米MON810和大豆GTS 40-3-2为模板，以MON810、GTS、ZSS和LEC为目的基因，将实施例1所述的通用引物PCR扩增程序中的退火温度分别设置为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃进行优化。2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

检测结果如图4所示。图4结果表明在PCR过程中退火温度低于58℃时，随着退火温度的提升，产物中的非特异性产物也随之减少。当温度高于58℃时，由于高于引物的Tm值太多，反而降低了引物扩增效率。因此，实施例1选择58℃作为PCR反应中的退火温度，进行后续实验。

实施例3、单重和多重可行性验证实验

(一)单重可行性验证实验

对实施例1中表2所示多对连接依赖探针的可行性分别进行验证。可行性验证实验的每组反应体系中的模板和连接探针序列，参照实施例1做适应性调整后进行，其它均与实施例1一致，最后用2％凝胶电泳检测实验结果。

单重可行性验证实验结果如图5所示。从图5可以看出，四组探针(Mon810-2F和Mon810-2R、ZSS-2F和ZSS-2R、GTS-2F和GTS-2R、LEC-2F和LEC-2R)均有效连接且连接产物可以在通用引物的引导下进行PCR扩增，扩增产物片段大小均与理论产物相同。且连接步骤的阴性组均没有产物产生且PCR步骤的阴性对照组没有非特异性和特异性产物。设计的左右连接探针和通用引物序列特异性极高，不存在发卡和二聚体等容易产生非特异性结合的结构。体系的优化也起到了很好的作用。可以进行后续多重实验。

(二)多重可行性验证实验

在实时荧光定量PCR仪中针对转基因玉米MON810和转基因大豆GTS 40-3-2分别建立两组二重新型荧光多重连接依赖探针扩增体系。由于玉米MON810的基因组中同时含有MON810外源插入基因和ZSS内参基因，因此在杂交连接时同时加入两对对应的连接依赖探针Mon810-2F/R和ZSS-2F/R，生成的连接产物中有两种双链；转基因大豆GTS 40-3-2的基因组中同时含有GTS 40-3-2外源插入基因和LEC内参基因，在杂交连接时同时加入两对对应的连接依赖探针GTS-2F/R和LEC-2F/R，生成的连接产物中有两种双链。在随后的通用引物PCR过程中分别加入针对外援插入基因的标记有FAM荧光的TaqMan探针和针对内参基因的标记有VIC荧光的TaqMan探针，同时检测二重荧光。探针杂交连接步骤、实时荧光PCR反应体系、反应过程同实施例1。

实验结果如图6所示。从图6中的A图可以看出，转基因玉米MON810的基因组作为模板时，Mon810-2F/2R和ZSS-2F/2R均成功连接形成双链。之后在实时荧光定量PCR过程中，由CUP-F/R作为引物，GMO-FAM和EDO-VIC作为两条TaqMan探针，可以同时检测到代表转基因事件玉米MON810的FAM荧光信号和代表作物内参的的VIC荧光信号。从图6中的B图可以看出，在转基因大豆GTS 40-3-2的基因组作为模板时，GTS-2F/2R和LEC-2F/2R均成功连接形成双链。之后在实时荧光定量PCR过程中，由CUP-F/R作为引物，GMO-FAM和EDO-VIC作为两条TaqMan探针，可以同时检测到代表转基因事件大豆GTS 40-3-2的FAM荧光信号和代表作物内参的的VIC荧光信号。

实施例4、灵敏度实验

人工合成实施例1中表1所示的4条单链(分别选自转基因玉米MON810、玉米内标基因ZSS、转基因大豆GTS 40-3-2、大豆内标基因LEC的序列信息)，作为模板，来验证实施例1所述方法的灵敏度。

依次将上述人工合成的4条单链分别进行10倍梯度稀释，每个单链制备6个样品(样品浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、10nM、1nM、0.1nM)。

(一)单重灵敏度实验

将上述人工合成的4条单链分别作为连接探针的模板，梯度稀释验证该方法针对实施例1中表2所示的Mon810-2F/R、ZSS-2F/R、GTS-2F/R和LEC-2F/R四对连接探针的单重灵敏度。

参照实施例1的连接探针反应体系，将模板和探针序列做适应性变更后进行，连接探针反应过程同实施例1。参照实施例1的实时荧光定量PCR反应体系，其中的FAM/VIC荧光探针添加一条即可，Mon810-2F/R和GTS-2F/R对应FAM荧光探针，ZSS-2F/R和LEC-2F/R对应VIC荧光探针，实时荧光定量PCR反应过程同实施例1。

实验结果如图7所示。浓度为0.1nM的模板扩增结果与阴性无差别，故将其余五个浓度梯度10μM、1μM、0.1μM、10nM、1nM、0.1nM的实验结果绘制了标准曲线。

如图7所示，当模板浓度低至1nM时，所有标准曲线的拟合度良好，Mon810-2F/2R荧光曲线的R²＝0.993；ZSS-2F/2R荧光曲线的R²＝0.994；GTS-2F/2R荧光曲线的R²＝0.993；LEC-2F/2R荧光曲线的R²＝0.995。因此，本研究所建立的新型多重连接探针依赖扩增体系对四个单重检测体系的检测灵敏度为1nM。

(二)多重灵敏度实验

上述4条单链的梯度稀释样品，将样品MON810和样品ZSS均匀混合作为玉米组的样品(6个梯度)；将样品GTS和样品LEC均匀混合作为大豆组的样品(6个梯度)。

参照实施例1的连接探针反应体系，将模板替换为梯度稀释单链混合物，探针序列做适应性变更后进行，连接探针反应过程同实施例1。实时荧光定量PCR反应体系、反应过程同实施例1。实验结果如图8、图9所示。

图8为玉米的扩增结果，梯度稀释的样品的扩增曲线有依次平移现象，说明该方法可以对不同浓度模板进行精确检测。当浓度低至0.1nM时，扩增曲线特征已经不明显且标准曲线的拟合度下降。当模板浓度低至1nM时，两条标准曲线的拟合度良好，FAM荧光曲线的R²＝0.996，VIC荧光曲线的R²＝0.996。因此，实施例1所建立的新型多重连接探针依赖扩增体系对转基因玉米MON810的检测灵敏度为1nM。

图9为大豆的扩增结果，与玉米的扩增结果一致，梯度稀释的样品的扩增曲线有依次平移现象，说明该方法可以对不同浓度模板进行精确检测。当模板浓度低至0.1nM时，扩增曲线特征已经不明显且标准曲线的拟合度下降。当模板浓度低至1nM时，两条标准曲线的拟合度良好，FAM荧光曲线的R²＝0.995，VIC荧光曲线的R²＝0.998。因此，实施例1所建立的新型多重连接探针依赖扩增体系对转基因大豆GTS 40-3-2的检测灵敏度为1nM。

实施例5、特异性实验

将转基因玉米MON863、BT11、GA21和转基因大豆MON89788和转基因油菜GT73基因组DNA分别作为模板，验证该方法的特异性。参照实施例1的连接探针反应体系，将模板分别替换为表6所示模板，连接探针反应过程同实施例1。实时荧光定量PCR反应体系、反应过程同实施例1。实验结果如表6所示。

表6

表6中，+：可以检测到荧光型号；-：无法检测到荧光信号；转基因玉米MON810检测体系中的连接探针序列为Mon810-2F/R、ZSS-2F/R；转基因大豆GTS 40-3-2检测体系中的连接探针序列为GTS-2F/R和LEC-2F/R。

从表6可以看出，针对转基因玉米MON810检测体系，除了MON810外的所有转基因玉米和非转基因玉米均无法检测到FAM荧光信号，但是都可以检测到标记玉米内参的VIC荧光信号；转基因大豆和非转基因大豆以及转基因油菜的两种荧光信号均无法检测到。对于转基因大豆GTS 40-3-2检测体系同理分析可以共同得到结论：该方法的特异性良好，在检测中对于不同种样品之间未出现假阳性和假阴性现象。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种用于检测的组合物及检测方法

<130> MP1826079Z

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggcaatggc aaaggatgtt aaacgttaga gtccttcgtc cttcgaagca ttatttcc 58

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagcggaagc agcagtagcg tgaggcatcc ccatgccggg ggcaatctct tcctcgtcgt 60

cggc 64

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccatttg ggttccctat gtttatttta 60

acc 63

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaccaagaaa gcacgtcatg cgattcccca ggtatgtcga gtcccgtgg 49

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttggtcgtg gtggtggttc gagggaacac gggagtctgt ggaaataatg cttcgaagga 60

cgaaggact 69

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaacgttta acatcctttg ccattgcccg gggaaggagg gaaggg 46

<210> 7

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttggtcgtg gtggtggttt cccaagcatc taggggtttg ctgccgacga cgaggaagag 60

attgcccccg g 71

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catggggatg cctcacgcta ctgctgcttc cgcttgggga aggagggaag gg 52

<210> 9

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttggtcgtg gtggtggttc gagggaacac gggagtctgt ggttaaaata aacataggga 60

acccaaatgg aaaag 75

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgg ggaaggaggg aaggg 45

<210> 11

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttggtcgtg gtggtggttt cccaagcatc taggggtttg ctccacggga ctcgacatac 60

ctggg 65

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatcgcatg acgtgctttc ttggtcgggg aaggagggaa ggg 43

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgagggaaca cgggagtctg t 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcccaagcat ctaggggttt gct 23

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttggtcgtg gtggtgg 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggggaaggag ggaaggg 17

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccttccctc cttcccc 17

Claims

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物至少包括下述1)和2)所述的核酸序列：

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括下述1)-8)中的至少一种：

1)荧光探针；

2)连接酶；

3)连接酶反应缓冲液；

4)实时荧光定量PCR反应缓冲液；

5)实时荧光定量PCR反应的引物对，其中，一条引物的核苷酸序列与权利要求1所述5′端通用引物序列的核苷酸序列一致，另一条引物的核苷酸序列与权利要求1所述3′端通用引物序列的核苷酸序列反向互补；

6)dNTP；

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括下述1)-13)中的至少一种：

3)序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID№：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

7)序列表中SEQ ID №：11所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

9)当所述组合物还包括荧光探针时，所述荧光探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№：13所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：13所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：13所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

10)当所述组合物还包括荧光探针时，所述荧光探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№：14所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：14所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：14所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1、2和/或3任一所述的组合物。

5.一种检测方法，其特征在于，所述检测方法包括使用权利要求1、2和/或3任一所述的组合物、或权利要求4所述试剂盒进行检测。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括下述1)-5)中的至少一种：

1)待测DNA样品变性反应；

2)权利要求1所述组合物与靶核苷酸序列的杂交反应；

3)权利要求1所述组合物与靶核苷酸序列杂交后的连接反应；

4)实时荧光定量PCR反应，所述实时荧光定量PCR反应的反应体系中的一条引物的核苷酸序列与权利要求1所述5′端通用引物序列的核苷酸序列一致，另一条引物的核苷酸序列与权利要求1所述3′端通用引物序列的核苷酸序列反向互补；反应条件为95℃变性10min，40个循环包括：95℃变性30s，54-58℃退火30s和72℃延伸30s，最后72℃延伸10min；

7.根据权利要求5和/或6任一所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括下述1)-5)中的至少一种：

1)当所述方法包括待测DNA样品变性反应时，变性反应的反应条件包括于98℃反应5min，然后降温至25℃以下，所述降温包括将反应完的离心管迅速置于冰水中保持20min以上；

2)当所述方法包括权利要求1所述组合物与靶核苷酸序列的杂交反应时，权利要求1所述组合物至少包括权利要求3中1)-8)任一所述核苷酸序列；

和/或所述杂交反应的反应条件包括95℃1min，60℃0.5h以上，54-58℃暂停；

3)当所述方法包括权利要求1所述组合物与靶核苷酸序列杂交后的连接反应时，权利要求1所述组合物至少包括权利要求3中1)-8)任一所述核苷酸序列；和/或所述连接反应的反应条件包括54-58℃15min，98℃5min，20℃暂停；

4)当所述方法包括实时荧光定量PCR反应时，所述实时荧光定量PCR反应的反应体系中的一条引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：15所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：15所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述实时荧光定量PCR反应的反应体系中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：17所示的核苷酸序列；和/或将序列表中SEQ ID №：17所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：17所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

和/或反应条件为95℃变性10min，40个循环包括：95℃变性30s，58℃退火30s和72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

8.权利要求1、2和/或3任一所述组合物、权利要求4所述试剂盒、或权利要求5、6和/或7任一所述方法的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括下述1)-6)中的至少一种：

1)单重检测；

2)多重检测；

3)定性检测；

4)定量检测；

6)SNP突变检测。