CN103266180A

CN103266180A - 通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒

Info

Publication number: CN103266180A
Application number: CN2013102247428A
Authority: CN
Inventors: 徐堤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明提供一种通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，主要成分为2-40份长短不同的长探针B段。长探针B段由下游过桥引物结合区、长度填充区和PCR引物二结合区组成。下游过桥引物结合区碱基序列和长度已知，其碱基数量为10-40个；长度填充区的总长度在1碱基到350碱基之间，长探针B段长度取决于长度填充区长度。本发明通过将MLPA长探针分为用户自备的A段和通用的B段两部分，通过连接A段上游过桥引物识别区和B段下游过桥引物结合区，制备MLPA长探针，由此代替现有技术中每检查一组靶序列都需制备一组长探针的方式，制备简单、方便，能够快速、大量的完成待测基因的检测，具有广泛的通用性，成本也更低，极大地促进了MLPA技术的发展。

Description

通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药体外诊断试剂领域，尤其涉及一种通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒。

背景技术

多重连接依赖探针扩增技术(Multiplex ligation dependent probe amplication，MLPA)是一种高通量基因检测方法，该技术方法特异、高效，能在同一反应管内对几十种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析，已广泛应用于染色体异常、基因点突变、基因缺失、基因甲基化、癌症及mRNA表达研究等医学基因检查领域。

MLPA技术需要针对多达40个待检测的靶序列中的每个靶序列设计一对探针，这一对探针由相互毗邻的一条短探针和一条长探针组成，现已知MLPA技术的特点和难点在于制备多达40个长度各异的长探针，40个长探针彼此至少需要有6碱基的长度差异，最长探针的长度将达到240bp，因此很多长探针的长度超过100碱基。现有技术中采用化学合成法制备短探针，M13噬菌体衍生法制备长探针。化学合成法制备单链探针较简单方便，但当合成的探针长度超过100碱基时，化学合成发生错误的概率增加，合成产量也大大降低；M13噬菌体衍生法制备长探针时需要先将人工合成的短探针序列克隆入选定的SALSA载体，经过培养和质粒提取获得大量的单链载体DNA，单链载体DNA与合成短探针和含PCR引物的序列复性成双链后，经限制性内切酶酶切即获得不同长度的单链DNA探针。该制备方法步骤复杂且耗时，不仅需要基因克隆、病毒转染、质粒提取和酶切等过程，还必须购买一套昂贵的SALSA载体，成本高。另外，操作M13噬菌体极易发生污染，而且为了垄断MLPA应用市场，行业巨头荷兰公司MRC-Holland不再出售M13噬菌体，这也在一定程度上限制了MLPA探针技术的发展。

专利CN101613756B公开了一种多重连接扩增技术的长探针的制备方法，该方法包括以下步骤：根据检测靶片段和目标核苷酸序列设计引物；人工合成引物并PCR扩增；PCR产物与亲和磁珠混合；PCR产物变性解链；分离未标记的单链核苷酸序列，即得到可用于多重连接扩增技术的长探针。专利CN102534004A公开了一种用于多重连接扩增技术的探针制备方法，该方法包括以下步骤：根据目标核苷酸序列和目标探针长度设计引物；人工合成引物并PCR扩增；PCR产物纯化回收；使用Lambda外切酶对PCR产物进行消化；回收单链DNA，得到所需要的长探针。上述两个专利提供的长探针制备方法，操作步骤简单容易，避免了进行噬菌体感染等获取长探针的耗时长且复杂的操作过程，上述方法能一次性制备一套长短不一的、多达40套的探针，这样一套探针只能用于特定基因靶序列的检测，当检测不同种类的靶基因时，就需要另外制备相应的一系列(多达40套)长短不同的探针，操作繁琐，制备麻烦，不利于普遍推广使用。

发明内容

为了解决公知技术中存在的问题，本发明提供一种通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，该试剂盒制造容易、使用简单、能广泛用于任何靶基因的检测。

本发明为达到上述目的所采取的技术方案为：

通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下成分：2-40份长短不同的长探针B段、过桥引物、T4DNA连接酶和连接酶缓冲液，每份长探针B段为一管，所述长探针B段由5’末端的下游过桥引物结合区、长度填充区和3’末端的PCR引物二结合区组成，所述下游过桥引物结合区碱基序列和长度已知，其碱基数量为10-40个，所述长探针B段长度取决于长度填充区长度，所述长度填充区的总长度在1个碱基到350个碱基之间，每相邻两条长探针B段相差6-9个碱基，PCR引物二结合区用于PCR扩增时与加入的相应引物结合。

优选的，所述下游过桥引物结合区的碱基数量为20个。

本试剂盒中所述的过桥引物是能够轻易完成设计的，过桥引物可用常规的引物合成技术进行合成。

本试剂盒中所述的T4DNA连接酶和连接酶缓冲液，是本领域常规使用的试剂。

本发明的有益效果为：本发明通过将MLPA长探针分为基因专一的长探针A段和通用的长探针B段，试剂盒提供一套由过桥引物结合区、长度填充区和PCR引物二结合区组成的、多达40条的长探针B段。实验人员使用时需自行设计并合成MLPA长探针A段，它由基因专一区和上游过桥引物识别区组成，通过T4DNA连接酶和过桥引物可以将长探针A段的上游过桥引物识别区和长探针B段的下游过桥引物结合区连接起来，制备成完整的一条MLPA长探针，然后将MLPA长探针、MLPA短探针分别与靶序列杂交，再通过DNA连接酶连接MLPA长探针和短探针，经PCR扩增和电泳分离后完成待测靶序列的检测。采用此种方法，科研人员每检查一组靶序列(数目多达40个)时，不需要特意制备一组长探针，只需合成3’端带有上游过桥引物识别区的长探针A段，，然后将其与本试剂盒提供的长探针B段连接成MLPA长探针，制备简单、方便，能够快速、大量的完成待测基因的检测，具有广泛的通用性，成本也更低，极大地促进了MLPA技术的发展。

本发明提供的通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，可以用于多领域的基因检测，为全基因组的通用型MLPA检测奠定了基础。

本发明提供了一种简单、方便、有效、可靠的通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，适合于全方位的医学基因检测领域。

附图说明

图1为现有MLPA技术原理图；

图2为本发明MLPA技术原理图。

图中：1-长探针、2-短探针、3-待测靶基因、4-长探针A段、5-长探针B段、6-过桥引物、7-长度填充区、8-PCR引物一结合区、9-上游过桥引物识别区、10-基因专一区、11-下游过桥引物结合区、12-T4DNA连接酶识别位点、13-PCR引物二结合区。

具体实施方式

本发明的基本原理是：将MLPA长探针分为A段、B段两部分，分别制备。长探针B段从5’到3’端的方向由下游过桥引物结合区11、长度填充区7和PCR引物二结合区13三个区组成；长探针A段从5’到3’端由基因专一区10和上游过桥引物识别区9组成。A段上游过桥识别区9和B段下游过桥引物结合区11核苷酸序列确定，能与本试剂盒提供的过桥引物4互补。技术人员使用前需要自行制备长探针A段，并在其基因专一区10的3’端增加一段与过桥引物4互补的上游过桥引物识别区9，通过T4DNA连接酶和过桥引物6将上游过桥引物识别区9和下游过桥引物结合区11连接起来，进而连接长探针A段和长探针B段，制得完整的长探针1。之后，长探针1、短探针2分别与靶序列杂交，并通过常规的MLPA过程，即DNA连接酶连接长探针1和短探针2，连接后的探针与靶序列解离后以PCR引物扩增及电泳分离，达到检测待测序列的目的。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步解释说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明的限制。

实施例1：人体13号染色体数目变化的检测

目前临床上22对常染色体非整倍频率较高的为13、18以及21号染色体，它们引起的三体病症比较典型和严重。现针对13号染色体设计8条长探针A段，并使长探针A段的5’端带有磷酸化修饰，其序列如表1所示。

表1

表1中长探针A段包括基因专一区和上游过桥引物识别区。相应的，长探针B段自5’端到3’端依次由下游过桥引物结合区、长度填充区和PCR引物二结合区3部分序列组成，并使长探针B段的5’端带有磷酸化修饰，该长探针B段及过桥引物序列如表2所示：

表2

操作者使用本试剂盒前，在长探针A段基因专一区的3’端引入上游过桥引物识别区，其序列如表1所示。然后分别取10pmol的长探针A段、长探针B段和10pmol的过桥引物于反应管内，加入10×连接酶缓冲液2μL、T4DNA连接酶1μL和20μL的水，16℃过夜，由此制备MLPA长探针。然后操作者采用常规方法制备短探针2，本实施例短探针序列如表3所示：

表3

长、短探针分别制备完成后，再按照以下步骤操作：

1)将DNA变性并分别与长、短探针杂交：取0.05-0.1μg/μL的模板DNA1μL，加入10×连接酶缓冲液4μL，混匀后置ABI2400PCR仪98℃变性5min；加入3μL制备好的长、短探针混合液，轻轻混匀，95℃孵育1min，然后60℃杂交16-18h；

2)连接反应：将ABI2400PCR仪温度降至54℃，加入32μL配好的连接反应液(2.6mMMgCl₂，5mM Tris-HCl pH8.5，0.013％non-ionic detergents，0.2mM NAD)和1U Lig-65连接酶，孵育15min；

3)PCR反应：取一新反应管，加入10μL连接反应产物于30μL的PCR缓冲液(每10μL的PCR缓冲液中包含10pmol PCR引物、2.5nmol的dNTP和2.5U Taq DNA聚合酶)混匀，经94℃5min预变性后，开始95℃30S-60℃30S-72℃1min的42次循环，最后72℃孵育20min；

4)用ABI3130XL分离、分析PCR产物：甲酰胺10μL，Liz5000.2μL，混匀，加入待测样本PCR产物2μL，再次混匀后，95℃变性5min，冰浴5min，取10μL加入96孔板中，进样，用ABI3130XL开始检测、分析，达到检测待测序列的目的。

实施例2：Park2基因检测

已知帕金森综合症致病因子位于人体Park2基因上，Park2基因上碱基的缺失或重复引起的帕金森综合症比较典型和严重。现针对Park2基因设计12条长探针A段，并使长探针A段的5’端带有磷酸化修饰，所用PCR引物和过桥引物与实施例1中的引物相同，该长探针A段序列如表4所示。

表4

表4中长探针A段包括基因专一区和上游过桥引物识别区。相应的，长探针B段自5’端到3’端依次由下游过桥引物结合区、长度填充区和PCR引物二结合区3部分序列组成，并使长探针B段的5’端带有磷酸化修饰，该部分序列如表5所示：

表5

操作者使用本试剂盒前，在制备长探针A段时，需在基因专一区的3’端引入上游过桥引物识别区，其序列如表1所示。按照实施例1中制备长探针的方法合成MLPA长探针，然后操作者采用常规方法制备短探针2，本实施例中短探针序列如表6所示：

表6

探针制备完成后，按实施例1中的检测步骤对待测基因进行检测。

实施例3：针对anophthalmia(无眼畸形)和microphthalmia(小眼球畸形)疾病的检测探针。

现针对影响人体眼部疾病的UCSC基因设计5条长探针A段，并使长探针A段的5’端带有磷酸化修饰，其序列如表7所示，所用PCR引物和过桥引物与实施例1中的引物相同。

表7

表7中长探针A段包括基因专一区和上游过桥引物识别区。相应的，长探针B段自5’端到3’端依次由下游过桥引物结合区、长度填充区和PCR引物二结合区3部分序列组成，并使长探针B段的5’端带有磷酸化修饰，该部分序列如表8所示：

表8

操作者使用本试剂盒前，在制备长探针A段时，需在基因专一区的3’端引入上游过桥引物识别区，其序列如表1所示，按照实施例1中制备长探针的方法合成MLPA长探针，然后操作者采用常规方法制备短探针2，本实施例短探针序列如表9所示：

表9

以上对本发明的具体实施方式进行详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施方式，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下成分：2-40份长短不同的长探针B段(5)、过桥引物(6)、T4DNA连接酶和连接酶缓冲液组成，每份长探针B段(5)为一管，所述长探针B段(5)由5’末端的下游过桥引物结合区(11)、长度填充区(7)和3’末端的PCR引物二结合区(13)组成，所述下游过桥引物结合区(11)碱基序列和长度已知，其碱基数量为10-40个，所述长探针B段(5)长度取决于长度填充区(7)长度，所述长度填充区(7)的总长度在1个碱基到350个碱基之间，每相邻两条长探针B段(5)相差6-9个碱基，PCR引物二结合区(13)用于PCR扩增时与加入的相应引物结合。

2.如权利要求1所述的通用型多重连接依赖探针扩增试剂盒，其特征在于所述下游过桥引物结合区(11)的碱基数量为20个。