CN101613756A - 可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，包括以下步骤：1)与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列选择，并根据UT和目标核苷酸序列设计引物；2)人工合成引物；3)PCR扩增；4)PCR产物与亲和素磁珠混合；5)PCR产物变性解链；6)分离非生物素标记的单链核苷酸序列，即得到可用于多重连接扩增技术的长探针。本发明所述MLPA长探针的制备方法利用简单的PCR扩增和亲和素磁珠结合过程即可获得MLPA长探针，操作步骤简单容易，避免了进行噬菌体感染等获取长探针的耗时长且复杂的操作过程，大大降低了进行MLPA技术应用的门槛，使得普通的实验室也能顺利地进行该项实验。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸探针制备领域，尤其涉及一种可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法。
背景技术
2002年，荷兰科学家发明了一种名为多重连接扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)的高通量的基因检测方法，该技术利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应管内对多达45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。该技术仅需20ng/μl DNA，即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤，在同一反应管中对多个不同的靶基因进行检测和定量分析。
MLPA技术原理示意图见图1，该技术主要包括：探针与靶序列的杂交、探针的特异化连接、连接探针的扩增和结果的检测分析。针对每一个待测靶基因序列，均有一对MLPA探针，其由一个短的寡核苷酸片段(短探针)和一个长的寡核苷酸片段(长探针)组成。该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本靶序列。该技术的扩增环节仅需2条引物，一是引物GP1，另一是引物GP2。在所有短探针的5’端均有一段共同序列，该序列与引物GP1的核酸序列相同；在所有长探针的3’端均有一段共同序列，该序列与引物GP2的核酸序列互补。可见，所有连接探针的PCR扩增用的是同一对引物。若两探针连接，则扩增可进行；而若两探针未连接，则扩增无法进行。各长探针在共同序列和与靶序列互补的序列间有不同长度的填充片段，该片段长度不同使连接后的MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦不同。一般相临两产物的长度相差6～8bp，因此可同时检测基因组的多种不同靶基因。扩增后进行结果检测分析比对，得出结论。
至今MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，如单核苷酸多态性(SNP)和基因突变检测、染色体数目异常、遗传疾病基因缺失重复、基因甲基化检测、抑癌基因诊断及mRNA分析等。由于MLPA操作简便、成本低廉、应用领域广，这几年来，已超过有上百篇的研究报告发表。
在该方法中涉及到长探针和短探针，其中探针的设计是难点，荷兰科学家创造性地利用了M13单链噬菌体的特性，巧妙地在插入衍生的序列两端设计了限制性内切酶(RE)识别位点，以便采用双酶切获得长探针，克服了目前寡核苷酸合成一般难以达到50mer以上的困难。但该方法至少有2大缺陷：1)相对于极其庞大的有分子生物学检测需要的实验室来说，能够培养M13噬菌体的实验室不多，只能求助于收费高昂的商业化生产，成本极高；2)周期长，设计难度大。
发明内容
为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，该方法设计容易、操作简单、所需实验室设备少。
为达到上述目的，本发明采用PCR方法结合亲和素磁珠法制备可用于多重连接扩增技术的长探针，本发明所述可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法英文名称为long oligonucleotide preparation bymagnetic-beads，缩写为LOPM。
所述可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法包括以下步骤：
1)针对目标核苷酸序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为通用引物和检测引物；
2)在通用引物的5’端标记生物素；
3)以所述与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列；
4)将所述生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素标记的亲和素磁珠混合，使生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素磁珠相互吸附；
5)使生物素标记的双链核苷酸序列变性，解链形成单链；
6)离心，取上清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。
所述检测引物由两段核苷酸序列组成，一段根据目标核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计。
步骤4)所述PCR扩增得到的生物素标记的双链核苷酸序列经先经过纯化后再与亲和素磁珠混合。
所述每1份重量份生物素标记的双链核苷酸序列与10份重量份的亲和素磁珠混合。
所述生物素标记的双链核苷酸序列加热变性或者在碱性条件下变性。
所述步骤6)的离心条件为4℃，10,000rpm，离心30sec。
本发明所述MLPA长探针的制备方法与采用M13噬菌体制备MLPA长探针的方法相比，具有以下优点：
1)PCR扩增引物设计简单，主要考虑引物的Tm值和长度等一般性引物设计问题，只需要通过结合目标核苷酸序列，针对用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列(UT，Unrelated Template)设计一对引物，即可进行PCR扩增，进而获得MLPA长探针；
2)利用简单的PCR扩增和亲和素磁珠结合过程即可获得MLPA长探针，操作步骤简单容易，避免了进行噬菌体感染等获取长探针的耗时长且复杂的操作过程，同时大大降低了进行MLPA技术应用的门槛，使得普通的实验室也能顺利地进行该项实验；
3)本申请所述LOPM法制备长探针无需进行耗时费力且繁琐的双酶切过程，操作变得简单容易；
4)采用本申请所述LOPM法制备长探针，对于长探针的设计具有更大的灵活性，长探针的序列来源广泛，可以来自于目标核苷酸序列对应的阴性模板、实验室常见的质粒模板等，甚至包括人工设计合成的基因序列，对于作为长探针所需要考虑的GC含量、长度及序列特异性、Tm值等也能容易地实现；
5)采用本LOPM法制备长探针能使所获得的长探针的填充序列(stuffer sequence)保持一致，或者可以采用人工设计序列的方法保证其特异性，可大大降低多重连接扩增产物序列的复杂性，从而能有效的降低基因芯片法检测时的非特异性杂交，从而提高检测的特异性和准确性，并保证检测的重复性。
附图说明
图1是MLPA技术原理图；
图2是本发明所述可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法流程图；
图3是MLPA电泳检测结果图。
具体实施方式
下面结合图2和具体实施例进一步详细说明本发明所述可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，具体为用多重连接扩增技术检测质粒pcDNA3.1上新霉素抗性基因(Neomycin resistance gene，NEO)的长探针的制备方法：包括以下步骤：
1)与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列(UT)选择，并根据UT和目标核苷酸序列设计引物；
2)人工合成引物，且在通用引物(GP2)的5’端标记生物素；在检测引物(GSS2+CP)的3’端磷酸化
3)PCR扩增；
4)PCR产物与亲和素磁珠混合；
5)PCR产物变性解链；
6)分离非生物素标记的单链核苷酸序列，即得到用于多重连接扩增技术的长探针，所述长探针为：GSS2+UT(UT包含了CP和GP2)。
实施例1选择UT模板并设计合成引物
选择质粒pET-49b(购自Novagen)为与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列(UT)，并根据新霉素抗性基因和pET-49b的核苷酸序列设计并人工合成通用引物和检测引物；
所述检测引物命名为CP+GSS2，其核苷酸序列具体为：
5’-
GCTCATACAAATGCTCTTCA--3’
其中线框内序列为GSS2，其根据新霉素抗性基因核苷酸序列设计；下划线部分序列为CP，其根据pET-49b核苷酸序列设计，5’端磷酸化；
所述通用引物命名为GP2，其核苷酸序列为：
5’--TAATACGACTCACTATAGGG--3’
其5’端标记生物素。
GP是General Primer的缩写；
CP是Common Primer的缩写；
GSS是Gene Specific Sequence的缩写。
实施例2PCR扩增
以质粒pET-49b为模板，用引物CP+GSS2和GP2进行PCR扩增，
1)PCR反应体系：
| 反应体系 | 体积：20μl | 浓度 |
| 10×pfu PCR buffer | 2μl | 1× |
| dNTP(10μM) | 0.8μl | 0.4μM |
| pfu酶(5U/μl) | 0.4μl | 0.1U/μl |
| 引物(上/下游)(10μM) | 0.8μl | 0.4μM |
| H2O | 15.5μl | |
| 模板 | 0.5μl |
2)PCR反应程序
95℃ 5min；
94℃ 30sec，
50℃ 30sec，
72℃ 40sec，35cycles；
72℃ 10min；
10℃ hold。
实施例3PCR产物纯化及与亲和素磁珠混合
将实施例2PCR扩增得到的产物进行纯化，包括以下步骤：
1)向PCR产物中加入1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，混匀；
2)再加入2.5倍体积的95％的冰乙醇，混匀；
3)-20℃，放置2-3小时，14,000rpm离心5min，去上清；
4)加70％乙醇清洗，14,000rpm离心5min，去上清，干燥；
5)加适量去离子水溶解。
制备亲和素磁珠
1)重悬亲和素磁珠，根据亲和素磁珠结合能力计算所需的亲和素磁珠量(每1μgPCR产物即生物素标记的双链核苷酸序列与10μg亲和素标记的亲和素磁珠混合)，将所需的适量亲和素磁珠转移至一新离心管中；
2)亲和素磁珠洗涤以去除防腐剂：将含有亲和素磁珠的离心管于磁力架上静置1～2min，去上清；将离心管从磁力架上移开，沿着亲和素磁珠所收集的离心管内壁加入洗涤液(洗涤液体积等于或大于所取亲和素磁珠的原始体积)，充分重悬亲和素磁珠洗涤；重复以上步骤，一共洗涤3次。
PCR产物与亲和素磁珠混合，利用生物素和亲和素的吸附作用使磁珠与生物素标记的核苷酸序列吸附在一起：
1)用2×B&W buffer(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，2M NaCl)重悬亲和素磁珠，使亲和素磁珠终浓度为5μg/μl(2倍的原始体积)；
2)加入等体积的溶于H2O的生物素标记PCR扩增产物将2×B&Wbuffer中的NaCl浓度从2M稀释至1M，使其达到最佳结合效果；
3)轻微旋转离心管，室温孵育15min；
4)将离心管至于磁力架上2～3min，分离包被生物素标记PCR产物的亲和素磁珠；
5)用1×B&W Buffer洗涤亲和素磁珠2～3次；
6)缓冲液重悬亲和素磁珠至10μg/μl。
实施例4PCR产物变性解链，分离非生物素标记的单链核苷酸序列
将PCR产物，加热至100℃5min，立刻至冰上冷却3min，使双链核苷酸序列变性解链；
或者加10mol/L NaOH使NaOH最终浓度为0.1mol/L，室温放置10min，使双链核苷酸序列变性解链；
将上述变性解链的核苷酸序列4℃，10,000rpm，离心30sec，吸取上清至一新的离心管中备用，即得到用于多重连接扩增技术的长探针。
实验例将上述实施例得到的用于多重连接扩增技术的长探针用于MLPA
1、人工合成短探针，短探针命名为GP1+GSS1，其核苷酸序列为：
5’--CTAGTTATTGCTCAGCGGTG 
--3’
其中下划线部分序列为GP1；线框内序列为GSS1，GSS1根据新霉素抗性基因核苷酸序列设计。
2、探针与靶序列杂交、探针的特异化连接
1)取5μl DNA模板即含有NEO基因的质粒pcDNA3.1(购自Invitrogen)于200μl离心管中，95℃变性5min，加热盖；
2)加入1.5μl盐溶液(1.5M KCl，300mM Tris-HCl pH8.5，1mM EDTA)；
3)加入1.5μl探针混合物(1～4fmol短探针和长探针)；
4)95℃加热1min，置于60℃孵育16小时；
5)将上述混合物用稀释液(2.6mM MgCl2，5mM Tris-HCl pH8.5，0.013％non-ionic detergent s，0.2mM NAD)稀释至40μl(含1U连接酶)，54℃孵育15min；(如果用T4连接酶进行连接：将4)和5)合并为95℃加热1min，置于16℃孵育16小时)
6)98℃加热5min使连接酶失活。
3、PCR扩增连接产物
将10μl连接产物、30μl PCR buffer和10μl混合溶液(含10pmolPCR primers，2.5nmol dNTPs，2.5U Taq polymerase)于60℃充分混合，于PCR仪上进行扩增反应；
PCR引物为
GP1：5’--CTAGTTATTGCTCAGCGGTG--3’
GP2：5’--TAATACGACTCACTATAGGG--3’。
反应程序：95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，35cycles。
4、结果检测
琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图3，以含有NEO基因的质粒pcDNA3.1为模板的PCR扩增可得大小为258bp的产物，以水为模板的阴性对照没有PCR扩增产物，因此证明利用本发明所述方法制备的长探针可用于MLPA。
本发明所述方法制备的长探针在用基因芯片法(固相芯片法和液相芯片法)进行结果检测时，更能显示出现有方法制备长探针所无可比拟的优势。众所周之，芯片法检测具有高通量、自动化、信息量大等优势，但是其对探针特异性的要求很高，设计起来耗时且艰难。芯片法待检测产物的一般长度大于100bp，甚至可达1000bp以上，如果同时检测几十甚至更多种产物，则待检产物与探针之间的非特异性杂交几乎是不可避免的，这也是导致芯片法存在直至今天也无法克服的准确性差、重复性差的根本原因。而采用本申请所述的LOPM法制备长探针能使所获得的长探针的填充序列(stuffer sequence)保持一致，或者可以采用人工设计序列的方法保证其特异性，这就大大降低了多重连接扩增产物序列的复杂性(complexity)，因此，采用本申请所述的LOPM法制备长探针能更好的保证采用芯片法检测时探针和引物的特异性，并极大的降低检测体系中序列的复杂性，从而能有效的降低芯片法检测时的非特异性杂交，从而提高检测的特异性和准确性，并保证检测的重复性。
LOPM-MLPA扩增结果能用多种检测方法进行检测，可以根据检测目标进行相应的选择，选择的范围广，琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、固相芯片法、液相芯片法、变性高效液相色谱(DenaturingHigh-Performance Liquid Chromatography，DHPLC)都能用于LOPM-MLPA扩增结果的检测。通过检测平台的选择，能够进一步的提高检测的特异性、灵敏度。
Claims (6)
1、可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，包括以下步骤：
1)针对目标核苷酸序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为通用引物和检测引物；
2)在通用引物的5’端标记生物素；
3)以所述与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列；
4)将所述生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素磁珠混合；
5)使生物素标记的双链核苷酸序列变性，解链形成单链；
6)离心，取上清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，其特征在于：所述检测引物由两段核苷酸序列组成，一段根据目标核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计。
3、根据权利要求1所述的可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，其特征在于：步骤4)所述PCR扩增得到的生物素标记的双链核苷酸序列经先经过纯化后再与亲和素磁珠混合。
4、根据权利要求1所述的可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，其特征在于：所述每1份重量份生物素标记的双链核苷酸序列与10份重量份的亲和素磁珠混合。
5、根据权利要求1所述的可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，其特征在于：步骤5)所述生物素标记的双链核苷酸序列加热变性或者在碱性条件下变性。
6、根据权利要求1所述的可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法，其特征在于：所述步骤6)的离心条件为4℃，转速10,000rpm，离心30sec。
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