CN1987464B - 磁捕获技术在NF-κB蛋白分离与检测中的应用方法 - Google Patents
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Abstract
磁捕获技术在NF-κB蛋白分离与检测中的应用。应用磁捕获分离、检测NF-κB蛋白的技术是先制备含NF-κB结合位点，且末端标记生物素的NF-κB探针。将生物素标记的NF-κB探针与链霉亲和素包被的Dynabead磁珠连接，形成DNA-磁珠复合物。取该复合物与细胞总蛋白抽提物进行结合，在磁性分离器中清洗DNA-磁珠-蛋白复合物，除去未结合的细胞蛋白，洗脱捕获的蛋白。用相应的抗体对洗脱下的蛋白进行Western印迹检测，进而验证该技术的有效性。该技术在分离蛋白的同时，还可以鉴定其活性，而且还能捕获疑是互作分子的蛋白。试验表明磁捕获NF-κB蛋白技术是一种多功能、实用的新技术，其将有助于在蛋白水平研究NF-κB蛋白。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分离、检测与互作蛋白分析技术。
背景技术
Rel/NF-信号通路与炎症、肿瘤、病毒感染等人类疾病紧密相关。随着NF-κB信号通路成为新药开发的重要靶点，检测NF-κB在病理过程中的活性变化以及寻找与之相互作用的生物分子成为了新药研发及基础研究领域的重要课题。Rel蛋白能通过Rel同源区(Rel homologydomain，RHD)结合一段被称为NF-κB结合位点的DNA序列，所以检测NF-κB活性最常用、最直接的方法是电泳迁移试验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。另外，还可以通过间接方法进行检测，如Western蛋白杂交检测NF-κB的抑制蛋白IκB，以及利用人工构建的表达系统检测由NF-κB控制的报告基因。这些传统的方法虽然已被广泛地应用于Rel/NF-κB信号通路的研究中，但操作复杂，用途单一，很大程度限制了它们在要求高效率、高通量的现代蛋白质组学研究领域中的应用。目前，磁分离技术逐渐被应用于DNA、RNA和蛋白等生物大分子的分离操作中，这种方法以磁珠-DNA-蛋白质亲和分离为基础，其优点是方便，省时，所有步骤能在一个微量离心管中完成，而被分离的样品在操作时受外力的影响很小，实验在近乎自然的状态下进行，尤其适用于互作蛋白和药物筛选等研究。
发明内容
本发明目的是要通过技术改造，优化实验条件，将磁捕获技术应用于捕获NF-κB DNA结合蛋白及其互作蛋白。
利用连接有特殊DNA探针的磁珠，以DNA-蛋白亲和作用为基础，从细胞总蛋白中分离NF-κB蛋白。该项被称为磁捕获的技术操作简单、省时、省力，且对样品的损伤程度小，不仅适用于分离蛋白，而且有利于分离与目的蛋白相互作用的其它蛋白及生物分子。因为只有具DNA结合活性的NF-κB蛋白才能被捕获分离，所以在分离蛋白的同时，还可以鉴定其活性。
试验所用的DNA探针一端为生物素标记，能非常牢固地与链霉亲和素连接，另一端含有NF-κB结合位点，能与DNA结合蛋白NF-κB相结合；所用的磁珠(DynabeadsTMM-280Streptavidin)表面光滑，无孔，且包被有链霉亲和素，生物素标记的NF-κB DNA探针能很容 易地连到Dynabead磁珠上，且这种复合体的设计非常利于之后的蛋白亲和连接与洗脱。生物素与链霉亲和素的连接非常牢固，能抵抗高盐溶液，当有活性的NF-κB蛋白结合到NF-κB探针后，用高盐溶液洗脱便得到了NF-κB蛋白。
我们已克隆了鲍NF-κB蛋白(Ab-Rel)，并对其功能与特性进行了鉴定。利用新改良的磁捕获技术方案分离和检测该DNA结合蛋白，通过优化实验条件，我们成功地从鲍血细胞蛋白中分离出了Ab-Rel蛋白，同时捕获到了几个可能与Ab-Rel互作的蛋白。为了进一步证明该方法的实用性，我们对在昆虫细胞中表达的重组Ab-Rel蛋白进行分离，结果表明磁捕获技术不仅能有效地分离内源性NF-κB，而且对体外重组的NF-κB蛋白同样有效。磁捕获技术是一种多功能、实用的新技术，其将有助于在蛋白水平研究NF-κB信号通路。
发明的技术方案
选取一段100bp大小的DNA(其中不含NF-κB结合位点)设计引物进行PCR扩增。在上游引物5’末端标记生物素，下游引含有一个NF-κB结合位点。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段即为生物素标记的NF-κB探针。将此生物素标记的NF-κB探针与链霉亲和素包被的Dynabead磁珠连接，在磁性分离器中清洗DNA-磁珠复合物，除去未结合的探针。制备细胞总蛋白抽提物，在结合缓冲液中与DNA-磁珠复合物结合反应一段时间。在磁性分离器中清洗捕获了蛋白的DNA-磁珠-蛋白复合物，除去未结合的细胞蛋白。以高盐缓冲液洗脱捕获的蛋白，洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。为了进一步验证捕获的蛋白为鲍转录因子，用相应的抗体对洗脱下的蛋白进行Western印迹检测。为了证明该方法的实用性，我们对在昆虫细胞中表达的重组Ab-Rel蛋白进行分离，操作步骤同上，因为表达的重组蛋白带有一段His标签，所以可用抗His抗体检测洗脱蛋白。
技术方案的操作步骤
1、制备细胞蛋白抽提物
2、生物素标记NF-κB探针的制备
3、NF-κB标记探针与磁珠连接
4、NF-κB蛋白与DNA探针结合
5、磁场分离NF-κB蛋白
6、洗脱捕获的NF-κB蛋白
7、Western蛋白印迹检测
本发明与现有技术相比所具有的优点和积极效果
与传统的方法相比，利用磁珠分离NF-κB蛋白更方便、省时，所有步骤能在一个微量离心管中完成。此技术以磁珠-DNA-蛋白质亲和分离为基础，而被分离的样品在操作时受外力的影响很小，实验在近乎自然的状态下进行，尤其适用于互作蛋白和药物筛选等研究。通过技术改造，优化实验条件，该技术不仅被应用于捕获内源性的NF-κB蛋白，而且可有效分离体外重组的NF-κB蛋白。因为只有具DNA结合活性的NF-κB蛋白才能被捕获分离，所以该技术在分离蛋白的同时，还可以鉴定其活性。试验表明磁捕获NF-κB蛋白技术是一种多功能、实用的新技术，其将有助于在蛋白水平研究NF-κB蛋白。
具体实施方式
本发明的实施例：
一、采用材料
1、取质粒和昆虫细胞系
E.coli TG I为本实验室保存，pGEM-T easy载体购自Promega公司，pFastBacTMHT A载体、E.coli DH10Bac和粉蚊夜蛾细胞系(Trichopolusia nis，Tn-5B1-4)由浙江大学应用昆虫所张传溪教授惠赠。
2、主要试剂及配制
M-280streptavidin为Dynal公司产品，磁分离器Magical Trapper购自Toyobo公司，其它化学试剂除特别注明外，均为国产分析纯。
主要试剂的配制如下：
细胞裂解液：20mM Tris-Cl pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，0.5％NP-40，1mM PMSF，1mMDTT
结合缓冲液：20mM Hepes pH7.6，1mM EDTA，10mM(NH4)2SO4，30mM KCl，1mMdithiothreitol，0.2％Tween-20[w/v]
2×B&W缓冲液：10mM Tris-Cl(pH7.5)
1mM EDTA
2M NaCl
洗脱液：结合缓冲液中加入NaCl，至终浓度200mM
3、引物设计与合成
引物BioF：GCACCTCAGCAAGCACCTGCTCGCTC，BioRw：CCTGGGAAAGTCCCCTCACACTCGTAGC和BioRm：CCTGTTTGCTTACCCTCACACTCGTAGC由上海生工公司 合成。
二、对NF-κB蛋白分离与检测中应用磁捕获技术的方法
1、细胞蛋白抽提物的制备：
1)离心收集血淋巴细胞和粉蚊夜蛾细胞，用预冷的PBS洗1次，加入细胞裂解液4℃溶解40分钟，其间不断地轻微震荡细胞溶液
2)4℃12000×g离心20分钟，取上清，于-20℃储存
按Brad-ford法对蛋白进行定量(Bradford，M.M.，1976.A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72，248-254)。
2、磁捕获的具体操作步骤如下：
1)生物素标记的NF-κB探针
随机选取一段100bp大小的DNA(其中不含NF-κB结合位点)设计引物进行PCR扩增。上游引物BioF：GCACCTCAGCAAGCACCTGCTCGCTC在其5’末端标记生物素，下游引物BioRw：CCTGGGAAAGTCCCCTCACACTCGTAGC含有一个NF-κB结合位点。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段即为生物素标记的NF-κB探针。经同样的方法，以引物BioF和BioRm CCTG TTTGCTTACCCTCACACTCGTAGC(NF-κB结合位点被替换)合成对照探针。
2)NF-κB探针与磁珠连接
双链DNA探针末端标记有生物素，能与链霉亲和素包被的磁珠连接。取2mgM-280磁珠，用1×B&W缓冲液洗两遍，加入100pmol标记了的NF-κB探针，室温结合20min，未结合的探针通过磁分离器洗脱去除。
3)NF-κB与DNA探针结合
向盛有上述磁珠的微量离心管中加入300μl的结合缓冲液，弃缓冲液。加入400μl血细胞蛋白抽提物，20μl非特异竞争DNA(poly[d(I-C)]，1mg/ml)，室温中缓慢摇动反应1h。
4)分离NF-κB
将上述反应的微量离心管置于磁分离器中2min，用移液枪缓慢去除反应液。
5)洗脱捕获的NF-κB
用300μl的结合缓冲液清洗磁珠，弃去洗液，加入40μl的洗脱液，用移液枪缓慢吹打数 次，在磁分离器中分离洗脱下的蛋白。
3、Western蛋白印迹(即用抗体进行Western蛋白印迹检测洗脱的蛋白)。
Western蛋白印迹试验，参见文献Sambrook J，Russell DW著.黄培堂等译.分子克隆实验指南，第3版.北京：科学出版社，2002，P1723(Sambrook J，RussellD W.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.
2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
序列表
<110>浙江大学
<120>磁捕获技术在NF-KB蛋白分离与检测中的应用方法
<140>200610053671X
<141>2006年9月29日
<160>3
<210>1
<121>26
<212>DNA
<213>鲍NF-KB蛋白(Ab-Rel)
<220>
<221>引物BioF
<222>(1)……(26)
<223>引物BioF序列根据鲍NF-KB蛋白(Ab-Rel)设计
<400>1
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>鲍NF-KB蛋白(Ab-Rel)
<220>
<221>引物BioRW
<222>(1)-(28)
<223>根据鲍NF-KB蛋白(Ab-Rel)设计的引物BioRW
<400>2
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>鲍NF-KB蛋白(Ab-Rel)
<220>
<221>引物BioRm
<222>(1)-(28)
<223>根据鲍NF-KB蛋白(Ab-Rel)设计的引物BioRm
<400>3
Claims (1)
1.磁捕获技术在NF-κB蛋白分离与检测中的应用方法，其特征是包括下列操作步骤：
(1)制备细胞蛋白抽提物：
1)离心收集血淋巴细胞和粉蚊夜蛾细胞，用预冷的PBS洗1次，加入细胞裂解液4℃溶解40分钟，其间不断地轻微震荡细胞溶液；
2)4℃12000×g离心20分钟，取上清，于-20℃储存；
(2)生物素标记NF-κB探针的制备：
随机选取一段100bp大小的DNA设计引物进行PCR扩增，上游引物BioF：GCACCTCAGCAAGCACCTGCTCGCTC在其5’末端标记生物素，下游引物BioRw：CCTGGGAAAGTCCCCTCACACTCGTAGC含有一个NF-κB结合位点，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段即为生物素标记的NF-κB探针；经同样的方法，以引物BioF和BioRm CCTG TTTGCTTACCCTCACACTCGTAGC合成对照探针；
(3)NF-κB标记探针与磁珠连接：
双链DNA探针末端标记有生物素，能与链霉亲和素包被的磁珠连接，取2mgM-280磁珠，用1×B&W缓冲液洗两遍，加入100pmol标记了的NF-κB探针，室温结合20min，未结合的探针通过磁分离器洗脱去除；
(4)NF-κB蛋白与DNA探针结合：
向盛有上述磁珠的微量离心管中加入300μl的结合缓冲液，弃缓冲液，加入400μl血细胞蛋白抽提物，20μl浓度为1mg/ml的非特异竞争DNA即poly[d(I-C)]，室温中缓慢摇动反应1h；
(5)磁场分离NF-κB蛋白：
将上述反应的微量离心管置于磁分离器中2min，用移液枪缓慢去除反应液；
(6)洗脱捕获的NF-κB蛋白：
用300μl的结合缓冲液清洗磁珠，弃去洗液，加入40μl的洗脱液，用移液枪缓慢吹打数次，在磁分离器中分离洗脱下的蛋白；
(7)用抗体进行Western蛋白印迹检测洗脱的蛋白。
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