CN110981929B - 一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针及方法 - Google Patents

一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于RNA m1A修饰结合蛋白捕获的探针及方法。该探针由碱基茎环结构组成，其长度均为32‑632个碱基，探针的3′或5′具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合。探针经过脱硫生物素标记，链霉亲和素偶联在磁珠上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞提取总蛋白与磁珠‑探针复合物孵育，作用蛋白可以和RNA m1A修饰探针特异性结合；经过洗涤可以将非特异性结合蛋白去除；最后，用洗脱液进行洗脱，得到探针‑蛋白复合物。本发明特异的RNA m1A修饰探针序列及二级结构能够有效捕获RNA m1A修饰结合蛋白，显著提高对特异性结合蛋白的富集。

Description

一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针及方法
【技术领域】
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针及方法。
【背景技术】
真核生物RNA能发生100多种转录后修饰，这些修饰可调控RNA的剪接、定位、稳定性、结合和翻译(Gilbert WV,Bell TA,Schaening C.Messenger RNA modifications:Form,distribution,and function.Science 352,1408-1412(2016))。腺苷(m6A)N6位甲基化参与基因表达的表观遗传调控。N1-甲基腺苷(m1A)是RNA上一种常见的N1位发生甲基化修饰，在许多tRNAss中都有发现。最近的转录组图谱也显示，m1A修饰也存在于人类mRNA中，提示m1A在调控mRNAs剪接和翻译中发挥潜在作用，同时，m1A修饰在外界热刺激或饥饿刺激下也会发生动态变化(Li X,Xiong X,Wang K et al.Transcriptome-wide mappingreveals reversible and dynamicN(1)-methyladenosine methylome.Nat Chem Biol12,311-316(2016))。在孕期母胎界面细胞会受到多种外界刺激(缺氧、脂多糖和激素)也会影响m1A修饰的动态变化。
此前有报道称，含有YTH结构域的蛋白质能与m6A直接结合，并作为Reader蛋白调节RNA的代谢(Wang X,Zhao BS,Roundtree IA et al.N(6)-methyladenosine ModulatesMessenger RNA Translation Efficiency.Cell 161,1388-1399(2015))。含有YTH结构域蛋白质3(YTHDF3)和YTHDF1通过与蛋白翻译机器相互作用促进蛋白质合成，增加了含有m6A的RNA的衰变，但YTHDF2降低了m6A修饰mRNA的稳定性，抑制了mRNA的翻译。总之，包含YTH结构域的蛋白质通过与m6A修饰的RNA结合来调节各种生物学过程。m1A作为另一种重要的RNA修饰，该修饰是由tRNAs甲基转移酶6(TRMT6)/TRMT61A复合物(writers)催化发生甲基化，并被a-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物3(ALKBH3)或ALKBH1(eraser)催化发生去甲基化修饰。然而，这些m1AReader的关键靶基因是如何影响细胞活性的，以及介导这些变化的潜在途径和机制尚不清楚，因此寻找能特异性识别RNA上m1A修饰的Reader结合蛋白就显得特别重要。
【发明内容】
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针及方法。
本发明的目的是通过以下方式来实现的：
本发明提供了一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)甲基化探针的碱基序列设计：
5′-biotin-ACCCGUCUUG(m1A)AACACGGCCGUUG(m1A)UCACGUC-3′；
对照非甲基化探针的碱基序列设计：
5′-biotin-ACCCGUCUUGAAACACGGCCGUUGAUCACGUC-3′；
2)在所述探针5′端与第一个茎之间、3′端与第二个茎之间、第一个茎与第二个茎之间插入序列为人类基因组无关序列，且插入序列不与探针中其他序列形成互补。
进一步，所述的探针由碱基茎环结构组成，探针的3′或5′具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合；
进一步，所述探针的长度是10-632bp，优选是32bp；
进一步，所述探针的5′端到第一个茎的长度为0-202bp，优选是2bp；
进一步所述探针的3′端到第二个茎的长度为0-202bp，优选是2bp；
进一步，所述探针的第一个茎环的长度为16bp；
进一步，所述探针的第二个茎环的长度为11bp；
进一步，所述探针的第一个茎与第二个茎之间的长度为0-202bp，优选是1bp；
进一步，所述的m1A是指腺苷(A)的N1位置上偶联甲基化修饰，所述的甲基化的探针上包含2个m1A修饰位点。
进一步，所述的5′-biotin是指在序列的5′端偶联上生物素标记。
进一步，所述探针的第一个和第二个甲基化修饰位点均位于两个环的顶部，第一个环由4对碱基对形成茎，第二个环由3对碱基对形成茎，第一个甲基化修饰位于第一个环的第4个碱基，第二个甲基化修饰位于第二个环的第3个碱基。
本发明还提供了一种RNAm1A修饰结合蛋白捕获的方法，具体包括如下步骤：
(1)制备探针-磁珠复合物：使用BSA和tRNAs封闭链霉亲和素标记的磁珠，将该预处理的磁珠与所述的探针结合；
(2)提取并预处理细胞总蛋白：向提取的核蛋白样品中加入DNase酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；
(3)捕获：将步骤2收集的上清加入到步骤1制备的探针-磁珠复合物中，加入DNase酶抑制剂孵育，收集磁珠，用裂解和结合buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；
(4)探针-蛋白复合物的洗脱：将步骤3制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入UreaCHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针-蛋白复合物。
进一步，步骤(1)中所述BSA的质量体积百分浓度为0.05-0.5％。
优选地，所述BSA的质量体积百分浓度为0.2％。
进一步，所述的tRNAs的浓度为30-60μg/mL。
优选地，所述的tRNAs的浓度为40μg/mL。
进一步，步骤(3)中所述的DNase酶抑制剂为EDTA。
进一步，步骤(3)中所述裂解和结合buffer配方为：10mM Tris-Cl、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、150mM KCl、2mM EDTA、0.5％TritonX-100和0.05％NP-40。
本发明的特点和有益效果如下：
1、本发明通过模拟细胞内天然存在的RNAm1A修饰二级结构，使RNA探针上的修饰更易结合m1A修饰的结合蛋白。
2、本发明通过预先使用BSA和tRNAs封闭磁珠，能分别降低磁珠与非特异性蛋白和基因组DNA的结合。BSA和tRNAs的预孵育既能封闭磁珠增强实验的特异性，又不会影响探针与蛋白的结合。
3、本发明采用DNase酶预处理蛋白样品，采用未预处理的磁珠对蛋白样品进行预沉淀，除去蛋白样品内的过多的基因组DNA，防止其缠绕磁珠从而影响耦连在磁珠上的RNA探针与蛋白质的结合，再采用DNase酶抑制剂EDTA灭活DNase酶。本发明通过防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可重复性，简化了实验流程。
4、本发明中磁珠首先与探针孵育，去除多余探针后再与总蛋白孵育，较传统探针先与蛋白孵育再与磁珠孵育或探针、蛋白和珠子同时孵育极大的节约了磁珠的使用量，节约实验成本。本发明采用磁珠取代了琼脂糖珠，省掉离心的步骤，节约时间并降低非特异性沉淀。同时，采用磁珠法洗涤取代了琼脂糖珠离心的步骤，可以使上清液去除的更加彻底，提高反应的特异性。
综上所述，本发明特异的RNA m1A修饰探针序列及二级结构能够有效捕获RNA m1A修饰结合蛋白，显著提高对特异性结合蛋白的富集。
【附图说明】
图1是是本发明探针设计原理图。
图2是应用本发明探针捕获的结合蛋白图。
【具体实施方式】
结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的探针的设计方法
其特征在于，包括以下步骤：
1)甲基化探针的碱基序列设计：
5′-biotin-ACCCGUCUUG(m1A)AACACGGCCGUUG(m1A)UCACGUC-3′；
对照非甲基化探针的碱基序列设计：
5′-biotin-ACCCGUCUUGAAACACGGCCGUUGAUCACGUC-3′；
2)在所述探针5′端与第一个茎之间、3′端与第二个茎之间、第一个茎与第二个茎之间插入序列为人类基因组无关序列，且插入序列不与探针中其他序列形成互补。
所述的探针由碱基茎环结构组成，探针的3’或5’具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合；所述探针的长度是32bp；所述探针的5′端到第一个茎的长度为2bp；所述探针的3′端到第二个茎的长度为2bp；所述探针的第一个茎环的长度为16bp；所述探针的第二个茎环的长度为11bp；所述探针的第一个茎与第二个茎之间的长度为1bp；
所述的m1A是指腺苷(A)的N1位置上偶联甲基化修饰，所述的甲基化的探针上包含2个m1A修饰位点。
所述的5′-biotin是指在序列的5′端偶联上生物素标记。
所述探针的第一个和第二个甲基化修饰位点均位于两个环的顶部，第一个环由4对碱基对形成茎，第二个环由3对碱基对形成茎，第一个甲基化修饰位于第一个环的第4个碱基，第二个甲基化修饰位于第二个环的第3个碱基。
本发明所述探针是根据人的28rRNA上公认的特有的1322位点m1A修饰及该修饰位点两边的序列特征来进行设计的，具体原理图如图1所示。
实施例2一种利用实施1中的探针捕获RNAm1A修饰结合蛋白的方法
具体步骤如下：
(1)制备探针-磁珠复合物：用1mL 1×TBS洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TBS洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和tRNAs的1×TBS，室温孵育30min后去除TBS溶液。向预处理后的磁珠中加入2-5μg DNA探针，并加入100μL 1×TBS，5μL10U/μL RNase酶抑制剂，4℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TBS洗涤磁珠两次，去除TBS。
(2)提取并预处理细胞总蛋白：用1×PBS洗涤2×107个细胞(Raw264.7和293T)两次，每次4℃、1200rpm离心5min，弃上清；加入800μL预冷裂解和结合Buffer、8μL 10mg/mL的PMSF溶液、5μL10U/μL RNase酶抑制剂、8μL protease inhibitor cocktail和4μL 100mMDTT溶液，剧烈涡旋10秒钟充分混匀并重悬沉淀，冰浴30min；每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12,000g-16,000g离心10min，弃沉淀，上清为总蛋白提取物；所述裂解和结合Buffer的配方为：10mM Tris-Cl、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、150mM KCl、2mM EDTA、0.5％Tri tonX-100和0.05％NP-40；
(3)捕获：将步骤2制备的总蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入200μL裂解和结合Buffer、5μL protease inhibitor cocktail、5μL 10mg/ml的PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液、5μL10U/μL RNase酶抑制剂、2.5μL 100mM DTT(二硫苏糖醇)和5μL 0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)溶液；4℃旋转混合孵育60-120min，收集磁珠，4℃，加入1000μL裂解和结合Buffer、10μL 10mg/mL的PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL 100mM DTT溶液，洗涤磁珠，再重复洗涤三次。
(4)探针-蛋白复合物的洗脱：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入50μL Urea CHAPSbuffer和0.5μL 100mM DTT溶液，4℃孵育5-10h，上清即为探针-蛋白复合物。
将上述探针-蛋白复合物用5×蛋白loading buffer在100℃下煮样变性10min，用5％-24％的梯度聚丙烯酰胺大胶进行电泳分离，再通过银染显示蛋白电泳条带(如图2所示)，结果显示，与非甲基化探针相比，甲基化探针能有效捕获与m1A探针特异性结合的蛋白条带，再将这些特异结合的蛋白条带割胶回收进行质谱鉴定，获得与RNA m1A修饰探针的结合蛋白。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于RNAm1A修饰结合蛋白捕获的甲基化探针，其特征在于，该甲基化探针的碱基序列为：
5′-biotin-ACCCGUCUUG(m1A)AACACGGCCGUUG(m1A)UCACGUC-3′。
2.一种用权利要求1所述甲基化探针捕获RNAm1A修饰结合蛋白的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
（1）制备探针-磁珠复合物：用1mL 1×TBS洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TBS洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和tRNAs的1×TBS，室温孵育30 min后去除TBS溶液，向预处理后的磁珠中加入2-5μg 权利要求中1所述的甲基化探针，并加入100μL 1×TBS，5μL10U/μL RNase酶抑制剂，4℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TBS洗涤磁珠两次，去除TBS；
（2）提取并预处理细胞总蛋白：用1×PBS洗涤2×107个细胞两次，每次4℃、1200 rpm离心5min，弃上清；加入800 μL预冷裂解和结合Buffer、8μL 10mg/mL的PMSF溶液、5μL10U/μLRNase抑制剂、8 μL protease inhibitor cocktail和4 μL 100 mM DTT溶液，剧烈涡旋10秒钟充分混匀并重悬沉淀，冰浴30min；每隔2 min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12 ,000 g-16 ,000 g离心10 min，弃沉淀，上清为总蛋白提取物；所述裂解和结合Buffer的配方为：10 mM Tris-Cl、10 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、150 mM KCl、2 mM EDTA、0.5%TritonX-100和0 .05 % NP-40；
（3）捕获：将步骤（2）制备的总蛋白加入到步骤（1）制备的探针-磁珠复合物中，并加入200μL裂解和结合Buffer、5μL protease inhibitor cocktail、5μL 10mg/ml的PMSF溶液、5μL10U/μL RNase酶抑制剂、2.5μL 100mM DTT和5μL 0.5 M EDTA溶液；4℃旋转混合孵育60-120 min，收集磁珠，4℃，加入1000 μL裂解和结合Buffer、10μL 10mg/mL的PMSF溶液、10μLprotease inhibitor cocktail和5μL 100mM DTT溶液，洗涤磁珠，再重复洗涤三次，得到蛋白-探针-磁珠复合物；
（4）探针-蛋白复合物的洗脱：向步骤（3）制备的蛋白-探针-磁珠复合物中加入50μLUrea CHAPS buffer和0.5μL 100mM DTT溶液，4℃孵育5-10h，上清即为探针-蛋白复合物。
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