CN103060471A - 南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，属于微生物检测方法技术领域。包括如下步骤：（1）样品采集；（2）TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆转录cRNA的合成；（3）TSV引物和WSSV引物的设计与合成；（4）将步骤（2）的核酸和步骤（3）的引物加入PCR反应体系，建立PCR反应体系，并进行多重PCR试验；（5）将步骤（4）的扩增产物进行特异性和敏感性测试。本发明南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法可用于病毒携带的无临床症状的对虾检测，具有特异性高、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，属于微生物检测方法技术领域。
背景技术
我国沿海地区是南美白对虾养殖的主要产业区，在人工养殖环境中，对虾可同时感染几个病原体或病毒。优质的南美白对虾亲虾及虾苗主要从国外引进，但也有可能将潜在的病毒带入境内。桃拉综合症病毒（Taura syndrome virus, TSV）和白斑症（White spot syndrome virus, WSSV）一直是对虾养殖中的主要病毒原。近年来，随着对虾虾苗和水产品国际贸易增加，这两种病毒的混合交叉感染较为普遍，因此对该病毒的进行检测与监控具有十分重要的意义。
对虾病病毒检测的方法包括组织学，原位杂交法，以及生物活性法，这些方法较为费时费工；而且往往只能适用于发生急性感染的虾只，而病毒携带的对虾往往不出现应有的临床症状和病理反应，因此使用上述方法存在一定的局限性，加大了检测的难度。RT-PCR技术是一种简易有效的检测方法，但是传统的PCR方法一次只能检测一个样本。多重PCR是一种特殊的PCR方法，能在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增多个目的片段。但是多重PCR检测方法受多种因素影响，如引物的特异性、模板的质量以及不同病毒样本PCR的扩增条件均能影响检测的灵敏度和准确性。
有基于此，做出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、灵敏度高的高效南美白对虾TSV和WSSV多重PCR检测方法。
本发明采取的技术方案如下：
南美白对虾TSV和WSSV多重PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）样品采集；
（2）TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆转录cRNA的合成；
（3）TSV引物和WSSV引物的设计与合成；
（4）将步骤（2）的核酸和步骤（3）的引物加入PCR反应体系，建立PCR反应体系，并进行多重PCR试验；
（5）将步骤（4）的扩增产物进行特异性和敏感性测试。
本发明的进一步设置如下：
步骤（1）中样品要在-80℃下进行预处理。
步骤（2）中，TSV的RNA的提取：取疑似TSV发病对虾内脏组织约0.1g，加入1ml Trizol, 在4℃下12000g离心10min，得上清液;将上清液在15～30℃孵育5min; 加入0.2mL氯仿，振荡、孵育; 在4℃下12000g离心15min；将离心后的上层无色水相加入0.5mL异丙醇，震荡，孵育10min; 在4℃下12000g离心10min，去上清，加入至少1mL75%乙醇，涡旋振荡; 在4℃下7500g离心5min，室温晾干RNA，加入无RNase的水溶解RNA，55一60’C孵育10min, 溶解，备用。
步骤（2）中，TSV的cDNA的合成：在PCR反应管中加入5μL的上述桃拉病毒RNA模板，加入随机引物10～20ng, 70℃孵育5min后，依次加入4μL 5×M-MLV Buffer，RNA酶抑制剂和dNTP各1μL，M-MLV酶1μL，最后双蒸水补足20μL；42℃反应1h，然后70℃灭活M-MLV酶10min，立即冰浴10min，得到cDNA，保存于－80℃备用。
步骤（2）中，WSSV的DNA的提取：取疑似WSSV发病对虾内脏组织共约0.1g，加入200μL裂解液(0.4M NaCl，10mM Tris-HCl, 2mM EDTA, PH 8.0) 研磨均匀后补加100μL裂解液，6000g 离心去杂质及细胞碎片，取上清液；在上清液中加入30μL 20%SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K混合均匀，在55℃温度下培育1～2h后，加入苯酚/氯仿/异戊醇（质量比为25:24:1）混合液，去除残余蛋白，离心后取上清；加入与苯酚/氯仿/异戊醇混合液等体积的异丙醇，并混匀，-20℃下沉淀30min，10000g在4℃离心10min，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL双蒸水中，并于-20℃备用。
步骤（3）中，TSV RT-PCR检测用的引物：5'-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3'，5'-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3'；WSSV PCR检测用的引物：5’-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT -3’，5’ - CACGAG TCTACCGTCACAACATC -3’。
步骤（4）中，1μL的TSV的RNA和WSSV的DNA分别加入PCR反应体系12.5μl（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5μl，加重蒸馏水至终体积25μL；扩增条件为：94℃1 min，1个循环；51℃min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃: 1 min ,72℃ 5 min，1个循环。
步骤（4）中，桃拉病毒1μL逆转录cDNA模板和白斑病毒1μLDNA模板，加入PCR反应体系25μl（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司），加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各0.5μL，加重蒸馏水至终体积50μL。另外设立阳性对照和的阴性对照。将反应管置于PCR仪上，根据1.4研究结果，按反应体系⑵进行扩增，具体如下94℃1 min，1个循环；51℃min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃:1 min ，72℃ 5 min，1个循环。
步骤（5）中，特异性和敏感性检测：TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品，分别加入到PCR反应体系中进行扩增，测其特异性；将抽提的WSSV的DNA和TSV的RNA作为模板分别测其含量后，将核酸作l0倍系列稀释，并对上述模板进行多重PCR扩增以检测其敏感性；将PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳富集，回收目的片段，将纯化后的PCR产物进行测序。序列分析用DNASTAR 4.2（DNASTAR Inc.）和 Clustal X 1.83软件，分析结果经GeneDoc 2.6.000编辑。
本发明技术方案依据多重PCR设计原则，采用GenBank公布的WSSV和TSV全基因组序列，设计了两对特异引物分别扩增TSV和WSSV病毒。该两对引物扩增片段较小，PCR扩增片段分别为210bp（TSV）和300bp（WSSV），且大小差异不大，同时又能在凝胶电泳中区分出来。事实上实验结果也符合引物设计的原则，在合适的反应条件下获得了较为理想的多重PCR扩增结果。即同时扩增出两个特异的WSSV和TSV条带，且能明显的区分。
除引物设计外，筛选出适宜的PCR条件以满足两个片段的同时扩增也是多重PCR成功的关键因素。其中以94℃1 min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃: 1 min ,72℃ 5 min，1个循环扩增条件最好，在该体系下各条带清晰，条带密集，且所用时间较短。
TSV和WSSV核酸模板与对虾其他病原核酸样品进行扩增反应，结果含有WSSV和TSV核酸的样品能扩增出的相应特异条带，而非WSSV和TSV核酸的样品组未见任何条带。条带测序结果显示与TSV和WSSV的同源性为100%。这些研究结果表明该多重PCR具有良好的特异性。敏感性实验表明，该多重PCR最低能同时检测到5 pg的WSSV DNA和0.5pg的TSV RNA模板，检测出如此微量的病原DNA/RNA，说明该方法可用于病毒携带的无临床症状的对虾检测。
附图说明
图1为本发明实施例中RT-PCR扩增TSV条带；
图2为本发明实施例中PCR扩增WSSV条带；
图3为本发明实施例中TSV PCR产物的测序结果；
图4为本发明实施例中WSSV PCR产物的测序结果；
图5为本发明实施例中TSV和WSSV的多重PCR检测。
具体实施方式
A. 多重PCR检测过程：
（1）样品采集
疑似TSV和WSSV感染对虾在绍兴地区沿海岸线共5个对虾养殖基地进行对虾样品收集，对虾采集时在一个地点的不同池塘里捕捞对虾，然后随机抽取一定数量的样品，运至绍兴文理学院冻于-80℃冰箱中。
（2）核酸提取
① 白斑病毒DNA提取 取疑似WSSV发病对虾内脏组织共约0.1g，加入200μL裂解液(0.4M NaCl，10mM Tris-HCl, 2Mm EDTA, PH 8.0) 研磨均匀后补加100μL，6000g 离心去杂质及细胞碎片，取上清液；在上清液中加入30μL 20%SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K混合均匀，在55℃温育1～2h；在反应液中加入苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去除残余蛋白，离心后取上清；加入等体积异丙醇混匀，-20℃沉淀30min，10000g在4℃离心10min，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL双蒸水中于，-20℃备用。
② 桃拉病毒cDNA的合成：按Promega公司试剂盒操作方法，在PCR反应管中加入5μL的桃拉病毒RNA模板，加入随机引物10～20ng, 70℃孵育5min后依次加入4μL 5×M-MLV Buffer, RNA酶抑制剂和dNTP各1μL，M-MLV酶1μL，最后双蒸水补足20μL。42℃反应1h，然后70℃10min灭活M-MLV酶，立即冰浴10min。得到cDNA保存于－80℃。
③ 桃拉病毒RNA提取：按Invitrogen公司Trizon试剂盒操作方法，取疑似TSV发病对虾内脏组织约0.1g，加入1ml Trizol, 4℃12000g离心10min分;将上清液转移至离心管中，15～30℃孵育5min; 加入0.2mL氯仿，振荡、孵育; 4℃12000g离心15min。将上层无色的水相转移到离心管中;加入0.5mL异丙醇，震荡，孵育10min; 4℃12000g离心10min；去上清，加入至少1mL75%乙醇，涡旋振荡; 4℃7500g离心5min; 室温晾干RNA，加入无RNase的水溶解RNA，55一60’C孵育10min, 溶解。
（3）引物的设计和合成
根据GenBank公布的WSSV和TSV全基因组序列，分别设计TSV和WSSV的2个特异性引物，引物由上海生工合成。WSSV PCR检测用的引物：5’-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT -3’，5’ - CACGAG TCTACCGTCACAACATC -3’；TSV RT-PCR检测用的引物：5'-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3' ，5'-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3'。
（4）PCR反应体系的建立和优化
1μLTSV和WSSV模板分别加入PCR反应体系12.5μl（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5μl，加重蒸馏水至终体积25μL。为筛选扩增条件，设计四种不同的反应体系：
1：95℃2min，94℃30S，68℃ 1 min，35个循环；68℃ 2 min，1个循环；
2：94℃1 min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃: 1 min ,72℃ 5 min，1个循环；
3：94℃4min，50℃1min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min，1个循环；
4：94℃5 min，1个循环；94℃45S，55℃45S，72℃ 1 min，35个循环；72℃10min，1个循环。
（5）TSV和WSSV多重PCR实验
桃拉病毒1μL逆转录cDNA模板和白斑病毒1μLDNA模板，加入PCR反应体系25μl（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司），加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各0.5μL，加重蒸馏水至终体积50μL。另外设立阳性对照和的阴性对照。将反应管置于PCR仪上，根据1.4研究结果，按反应体系⑵进行扩增，具体如下94℃1 min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃:1 min ，72℃ 5 min，1个循环。
（6）多重PCR 的特异性及敏感性试验
TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品，分别加入到多重PCR反应体系中进行扩增，以检测其特异性。将抽提的WSSV DNA和TSV RNA作为模板分别测其含量后，将核酸作l0倍系列稀释，并对上述模板进行多重PCR扩增以检测其敏感性。
（7）测序与序列分析
PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳富集，按照试剂盒操作手册进行用胶回收试剂盒回收目的片段。将纯化后的PCR产物直接送至上海英俊公司（Invitrogen）测序。序列分析用DNASTAR 4.2（DNASTAR Inc.）和 Clustal X 1.83软件，分析结果经GeneDoc 2.6.000编辑。
B. 结果
TSV和WSSV核酸提取后，PCR反应体系中加入相应引物。本技术方案通过对变性和退火温度时间和循环次数的控制，设计四种（1，2，3，4）不同的PCR反应体系。结果显示所有含有反应体系均能扩增出与实验设计大小相符的210bp（TSV）（图1）和300bp（WSSV）（图2）的两条特异条带。图中阿拉伯数字0，1，2，3，4，5分别代表DNA marker, 反应条件1，2，3，4以及阴性对照。图1，2结果显示TSV和WSSV PCR在反应体系2和4的条带最为清晰，但反应体系2用时较短。因此，TSV和WSSV最佳PCR反应条件为94℃变性1 min，1个循环；51℃ 退火1min，72℃延伸1min，94℃ 变性30S，35个循环；51℃: 退火1 min ,72℃延伸 5 min，1个循环。
（1）特异性分析
TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品，结果含有WSSV和TSV核酸的样品能扩增出的相应特异条带，而非WSSV和TSV核酸的样品组未见任何条带（结果未显示）。将WSSV和TSV样品组扩增送检测序后，PCR产物的序列如图3（TSV PCR序列）和图4（WSSV PCR序列）所示，将该序列输入NCBI的BLAST搜索软件，结果证明序列长度分别为217bp和301bp，与TSV和WSSV的同源性为100%。
（2）敏感性分析
将抽提的WSSV DNA和TSV RNA作为模板分别测其含量后，将核酸作不同倍数稀释，并对上述模板在反应体系2中进行PCR扩增，该体系最低能同时检测到约为5pg的WSSV和0.5 pg的TSV核酸模板。
（3）多重PCR检测结果
采用WSSV的引物和TSV引物，经过多重PCR扩增，扩增产物电泳后分别得到300bp大小(WSSV) (图5中的3和6) 的和210bp(TSV) (图5中的4和7)大小的电泳条带，与预期的结果一致；并且300bp的WSSV和210bp的TSV能在同一凝胶电泳中明显区分出来(图5中的5和8)；而阴性对照1和9则没有条带出现，2为DNA marker。
本实施例依据片段的长短及引物碱基的分布，设计出四种不同的PCR扩增条件。实验结果显示，虽然四个体系中均可扩增出目的片段，但是扩增效率及条带的分布存在差异，其中以94℃1 min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃: 1 min ,72℃ 5 min，1个循环的扩增效果最好，用时短，特异性和敏感性最高，因而可快速、准确，可用于病毒携带的无临床症状的对虾检测。
Claims (4)
1.南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品采集；
（2）TSV的DNA和WSSV的RNA的提取，以及WSSV的逆转录cRNA的合成；
（3）TSV引物和WSSV引物的设计与合成；
（4）将步骤（2）的核酸和步骤（3）的引物加入PCR反应体系，建立PCR反应体系，并进行多重PCR试验；
（5）将步骤（4）的扩增产物进行特异性和敏感性测试。
2.根据权利要求1所述的南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品采集：随机抽取疑似TSV和WSSV感染的南美白对虾，在-80℃下冷冻处理；
（2）核酸的提取：
① TSV的RNA的提取：取疑似TSV发病对虾内脏组织约0.1g，加入1ml Trizol, 在4℃下12000g离心10min，得上清液;将上清液在15～30℃孵育5min; 加入0.2mL氯仿，振荡、孵育; 在4℃下12000g离心15min；将离心后的上层无色水相加入0.5mL异丙醇，震荡，孵育10min; 在4℃下12000g离心10min，去上清，加入至少1mL75%乙醇，涡旋振荡; 在4℃下7500g离心5min，室温晾干RNA，加入无RNase的水溶解RNA，55-60℃孵育10min, 溶解，备用；
② TSV的cDNA的合成：在PCR反应管中加入5μL的上述桃拉病毒RNA模板，加入随机引物10～20ng, 70℃孵育5min后，依次加入4μL 5×M-MLV Buffer，RNA酶抑制剂和dNTP各1μL，M-MLV酶1μL，最后双蒸水补足20μL；42℃反应1h，然后70℃灭活M-MLV酶10min，立即冰浴10min，得到cDNA，保存于－80℃备用；
③ WSSV的DNA的提取：取疑似WSSV发病对虾内脏组织共约0.1g，加入200μL裂解液(0.4M NaCl，10mM Tris-HCl, 2mM EDTA, PH 8.0) 研磨均匀后补加100μL裂解液，6000g 离心去杂质及细胞碎片，取上清液；在上清液中加入30μL 20%SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K混合均匀，在55℃温度下培育1～2h后，加入苯酚/氯仿/异戊醇（质量比为25:24:1）混合液，去除残余蛋白，离心后取上清；加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液等体积异丙醇混匀，-20℃下沉淀30min，10000g在4℃离心10min，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL双蒸水中，并于-20℃备用；
（3）TSV的RT-PCR检测引物：5'-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3'，5'-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3'；WSSV的PCR检测引物：
5’-TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT-3’，5’-CACGAG TCTACCGTCACAACATC -3’；
（4） PCR反应体系建立和多重PCR试验：
①1μL的TSV的RNA和WSSV的DNA分别加入PCR反应体系12.5μl（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5μl，加重蒸馏水至终体积25μL，进行扩增；
②桃拉病毒1μL逆转录cDNA模板和白斑病毒1μLDNA模板，加入PCR反应体系25μl，加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各0.5μL，加重蒸馏水至终体积50μL，另外设立阳性对照和的阴性对照，将反应管置于PCR仪上进行扩增；
（5）特异性和敏感性测试：TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品，分别加入到PCR反应体系中进行扩增，测其特异性；将抽提的WSSV的DNA和TSV的RNA作为模板分别测其含量后，将核酸作l0倍系列稀释，并对上述模板进行多重PCR扩增以检测其敏感性；将PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳富集，回收目的片段，将纯化后的PCR产物进行测序。
3.根据权利要求2所述的南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）中，扩增条件为：94℃5 min，1个循环；94℃45S，55℃45S，72℃ 1 min，35个循环；72℃10min，1个循环。
4.根据权利要求2所述的南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）中，扩增条件为：94℃1 min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃ 30S，35个循环；51℃: 1 min ,72℃ 5 min，1个循环。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130424 |