CN103224989B

CN103224989B - 一种快速检测食品中鸭源性成分的方法

Info

Publication number: CN103224989B
Application number: CN201310185234.3A
Authority: CN
Inventors: 黄明; 程欣; 黄继超; 周兴虎; 杨静
Original assignee: NANJING JITAI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Nanjing Huangjiaoshou Food Technology Co ltd
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: CN103224989A

Abstract

本发明公开了一种快速检测食品中鸭源性成分的方法，为TaqMan探针荧光定量PCR方法，以含有待检DNA模板、含有阳性扩增内标DNA的重组质粒、阳性扩增内标DNA的TaqMan探针、鸭的IL-2基因扩增引物和TaqMan探针，进行荧光定量PCR反应；应用ABI7500SoftwareSDS1.4对结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。该方法首次提出以细胞核中基因为目标基因，并添加有竞争性扩增内标，用荧光定量PCR法检测食品中鸭源性成分，不仅具有良好的特异性，同时可通过实时监控PCR反应来避免假阴性结果，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便等有益效果。

Description

一种快速检测食品中鸭源性成分的方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种快速检测食品中鸭源性成分的方法，具体为一种添加扩增内标的食品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR快速检测方法。

背景技术

近年来，肉品的质量安全问题已经成为全社会关注的热点话题。在经济利益的驱使下，一些不法分子为牟取暴利而掺杂使假，将相对廉价的鸭肉、猪肉等深加工后冒充牛羊肉进行销售，这些行为不仅损害牛羊产品质量，对穆斯林产生了巨大伤害，还极可能引入过敏原危害消费者健康，也会对牛羊产品在国际上的声誉造成损害，2013年欧洲多国出现的“马肉风波”也为我们敲响了警钟。因此，对于掺假牛羊肉制品中较常出现鸭肉，建立科学、准确快速的检测方法十分必要。

以前人们通常依靠感官和经验鉴别肉的种类，随着现代分子生物学的发展，逐步形成了分别以蛋白质检测与核酸检测为基础的方法体系。近几年来，根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现特异性基因片段的扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中动物源性成分的PCR方法已基本取代以蛋白检测为基础的鉴别技术。尤其是近5年出现的实时荧光PCR技术，以其高特异性、高灵敏性、无污染和可定量等优点，越来越多的应用于食品中的肉类鉴别。实时荧光PCR是利用PCR反应体系中荧光信号的变化对产物生成进行实时监测的技术，它不仅省去了凝胶电泳的繁琐操作，减少了假阳性的发生率，还可以避免实验过程中溴化乙锭对人体的潜在危害。在目标基因选择方面，动物细胞核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，能够避免非特异性扩增；此外，目前对食品中动物源性的荧光定量PCR检测研究均缺乏阳性扩增内标（IAC）对反应体系进行监测，无法避免检测假阴性结果的产生，导致检测结果不准确。目前国际上以细胞核基因DNA序列为目标基因，并添加有扩增内标的食品中动物源性荧光定量PCR检测方法尚未见报道。因此，建立添加有扩增内标的食品中动物源性成分的实时荧光PCR快速检测方法将对食品安全的监管具有重要的实践意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速检测食品中鸭源性成分的方法，以鸭的细胞核中基因序列为目标序列，设计特异性引物和TaqMan探针，设计并构建扩增内标，针对内标设计TaqMan探针，通过对PCR反应体系和反应条件的优化，建立用于检测食品中鸭肉成分的添加有扩增内标的的荧光PCR方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种快速检测食品中鸭源性成分的方法，为TaqMan探针荧光定量PCR方法，具体包括：以含有待检DNA模板、含有阳性扩增内标DNA的重组质粒、阳性扩增内标DNA的TaqMan探针、鸭的IL-2基因扩增引物和TaqMan探针，进行荧光定量PCR反应；应用ABI 7500 Software SDS1.4对结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；

其中，

阳性扩增内标DNA的序列如SEQ ID NO.1所示，阳性扩增内标DNA的TaqMan探针为：5’-CY5-ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG-BHQ3-3’；

鸭的IL-2基因扩增上游引物序列为：5’-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3’，下游引物序列为：5’-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3’，探针为5’-FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1-3’。

所述含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，由以下方法制备：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，并确保在NCBI中Blast后没有出现与所述DNA序列同源的DNA片段；先在所述DNA序列上、下游分别连接上鸭的扩增引物序列，然后分别连接载体pMD19-T Simple，再转化感受态细胞E.coli Competent Cell JM109，小量提取并测序验证，得到含有阳性扩增内标DNA的重组质粒；其中，

所述TaqMan探针荧光定量PCR方法，20μL反应体系为：2μL待检模板DNA，2μL含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，10μL Premix Ex Taq，0.8μL（10μM）鸭DNA探针溶液，0.8μL（10μM）扩增内标探针溶液，0.4μL ROX校正溶液，上、下游引物各为0.4μL（10μM），灭菌蒸馏水补足。

所述TaqMan探针荧光定量PCR方法，反应条件为：95℃，30s； 95℃，5s，60℃，34s，40个循环。

有益效果：与现有检测技术相比，本发明具有的优点包括：首次提出以细胞核中基因为目标基因，并添加有竞争性扩增内标，用荧光定量PCR法检测食品中鸭源性成分。在体系中增加扩增内标，可以有效避免因食品成分、残留的DNA提取试剂等抑制因子或者仪器故障等原因导致检测结果假阴性，降低了多对引物对荧光定量PCR体系产生干扰的风险；采用与靶基因同源性极低的扩增内标，使其不会与靶基因通过互补链的结合而交联在一起而影响检测灵敏度。该检测方法不仅具有良好的特异性，同时可通过实时监控PCR反应来避免假阴性结果，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便等有益效果。

附图说明

图1是鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法实际检测下限分析扩增曲线图，图中，1-5的DNA浓度分别为：250ng/μL、25ng/μL、2.5ng/μL、0.25ng/μL、0.025ng/μL；

图2是鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法相对检测下限（灵敏度）分析中鸭DNA扩增曲线图，图中，1-5的鸭肉含量分别是20%、10%、5%、1%和0.1%；

图3是鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法相对检测下限（灵敏度）分析中内标扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的主要材料、试剂与仪器具体如下：

样品：鸭肉、鸡肉、驴肉、牛肉、猪肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米、茴香、大豆、八角、花椒均购于江苏南京地区超市。

荧光定量PCR仪（美国ABI公司，ABI7500）；核酸蛋白测定仪（美国热电公司，Nanodrop 1000 Thermal）；MB-102恒温震荡金属浴（Bioer公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司，3-18K）。

血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司；引物和探针合成、人工全基因合成由上海辉睿生物科技有限公司完成；DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例1

（1）样品制备与DNA提取

按照TIANGEN（天根)试剂盒的说明书进行操作。50mg样品（鸭肉、鸡肉、驴肉、牛肉、猪肉、兔肉、鹅肉、鱼、山羊肉、绵羊肉、玉米、茴香、大豆、八角、花椒）的总DNA均溶解于100μL TE缓冲液中，利用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度和纯度。结果表明这些样品DNA符合荧光PCR检测的条件。

（2）引物和探针设计

根据GenBank中已发表的鸭（登录号：HQ008784.1）基因组序列（鸭的IL-2基因），应用Primer Premier 5.0软件设计出特异性引物和探针，再将引物和探针序列在NCBI网站中进行Blast分析比较和评估，保证引物与探针的特异性。使用荧光基团FAM作为探针的发光基团。引物和探针序列、Tm值与扩增片段大小见表1。

表1荧光定量PCR引物与探针序列

（3）扩增内标构建

扩增内标构建过程如下：用软件随机生成一段DNA序列，将其在NCBI中比照，若没有出现与之同源的真核生物DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上鸭目标片段的引物序列，从而形成长度为225bp的针对鸭目标基因的扩增内标DNA序列（SEQ ID NO.1）。将扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段连接载体pMD19-T Simple，转化感受态细胞E.coli Competent Cell JM109，小量提取并测序验证，测定于260nm和280nm处的吸光度值，计算质粒浓度，-20℃保存备用，菌液于甘油管中-70℃保存。扩增内参的探针序列见表1。

（4）TaqMan 探针荧光定量PCR扩增体系和反应条件

在20μL的荧光定量PCR反应体系中进行鸭源性成分的检测，优化引物浓度，反应体系包含：Premix Ex Taq （2×）10μL，上、下游引物分别在0.2μM、0.4μM和0.6μM三个梯度浓度进行，探针溶液0.4μM，ROX校正液（50×）0.4μL，模板DNA 2μL，灭菌蒸馏水（ddH₂O）6.0μL；最终确立鸭的扩增体系中引物添加量为0.4μL（10μM）。扩增内标根据后续试验按优化后的浓度添加。反应条件为：stage 1（95℃ 30s，1个循环）；stage 2（95℃ 5s，60℃，34s，40个循环）。应用ABI 7500 Software SDS1.4对实验结果进行分析处理。以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。

（5）特异性试验

分别以鸭肉、猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鱼肉、驴肉、兔肉、鸡肉、鹅肉、玉米、茴香、大豆、八角、花椒的DNA（50-100ng/μL）为模板按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针特异性。20μL反应体系包含：模板DNA 2μL，Premix ExTaq 10μL，鸭探针溶液（10μM）和扩增内标探针溶液（10μM）各0.8μL，ROX校正溶液0.4μL，上下游引物各为0.4μL（10μM）。反应条件为：stage 1（95℃ 30s，1个循环）；stage 2（95℃ 5s，60℃，34s，40个循环）。

结果显示，鸭肉DNA经过TaqMan探针实时荧光PCR扩增在36个循环内有扩增，荧光定量PCR检测Ct值为26.07±0.12，而其他14种DNA样本及阴性对照组在40个循环内没有出现实时扩增曲线，可判断为阴性结果。可见，针对目标物种的引物和探针特异性良好。

实施例2

1）基因组DNA实际检测下限分析实验

将鸭肉DNA模板原液（浓度为250ng/μL）进行梯度稀释，即250 ng/μL、25ng/μL、2.50ng/μL、0.25ng/μL和0.025ng/μL5个浓度梯度，用优化的反应体系考察其检测下限。该实验重复三次，每次分别设三个平行，以Ct值小于36为阳性判别标准。

结果如图1所示，当荧光定量PCR体系中模板量为0.5ng（0.25ng/μL*2μL）时，存在明显的扩增曲线，此时鸭DNA的Ct值分别为34.62±0.001。则该荧光定量PCR 检测体系的实际检测下限为0.5ng。

2）扩增内标对实际检测下限的影响

以上述所得的最低检出限为目标基因模板量评价扩增内标对检测体系实际检测下限的影响。将含有扩增内标的质粒原液10倍梯度稀释，并取2μL作为检测体系中内标的添加量，进行二重荧光定量PCR考察内标的添加量对基因组DNA实际检测下限的影响。

结果如表2所示，当用于检测鸭源成分的PCR体系中含有4.5×10⁴copies/μL的扩增内标质粒时，对于检测体系最低检出限Ct值影响小于0.2，此时扩增内标的Ct值稳定，为28.75±0.26。

表2二重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测下限表

实施例3

随机抽取三个个体来源、浓度均为100ng/μL的鸭肉DNA进行荧光PCR，实验分三次进行，每次分别设三个平行，考察该体系的稳定性。结果见表3，结果显示，每个样品的3次独立重复实验Ct值的标准差均小于0.3。说明检测结果重复性好，检测稳定性好。

表3 二重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法重复性试验结果

实施例4

将鸭肉粉末与牛肉粉末以一定比例混合，制成鸭肉含量分别为20%、10%、5%、1%、0.1%和0%的混合肉样品，提取各组DNA，依照优化好的反应体系对该方法的相对检测下限进行分析，实验分三次进行，每次分设三个平行。

结果如图2和图3所示，鸭肉含量为20%、10%、5%、1%、0.1%和0%的样品，所得Ct值分别为24.60±0.05、26.53±0.16、30.58±0.17、31.22±0.25和34.21±0.21，0%时无有效检测信号（如图2）；内标Ct值为28.50±0.15（如图3）。结果表明当鸭肉含量为0.1%时扩增良好，即该法灵敏度可达0.1%，能满足实际检测需要。

实施例5

利用本专利建立的鸭TaqMan探针实时荧光PCR方法，对收集的38份牛肉干、干切牛肉、牛丸等样品进行检测，所有样品判断为阳性的条件为Ct值小于36，Ct值大于36判断结果为阴性，检测结果见表4。由表可见，所抽牛肉制品中掺有鸭肉的比率为13.16 %。

表4 市售牛肉样品鉴定结果

SEQUENCE LISTING

<110> 南京吉泰生物科技有限公司

<120> 一种快速检测食品中鸭源性成分的方法

<130> 100

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 阳性扩增内标DNA的序列

<400> 1

ggagcacctc tatcagagaa agacaacgtg tcgtcccaca ggggtctatt ggggatcatg 60

accaaagcct ccgggcgtag tcatctctgt ggagggacct tgccatcggc ggggtaattg 120

tgggcccttg tccctcggtc gcgcataggg gtggcgggac tcagccggcg gcggcacccc 180

gtaggcctta cgtggggcgt gggattgatc ttgagctcta cacac 225

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 阳性扩增内标DNA的TaqMan探针

<400> 2

atgaccaaag cctccgggcg tag 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 鸭的IL-2基因扩增上游引物序列

<400> 3

ggagcacctc tatcagagaa agaca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 鸭的IL-2基因扩增下游引物序列

<400> 4

gtgtgtagag ctcaagatca atccc 25

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 鸭的IL-2基因探针

<400> 5

tgggaacaag catgaatgta agtggatggt 30

Claims

1.一种快速检测食品中鸭源性成分的方法，其特征在于：为TaqMan探针荧光定量PCR方法，具体包括：以含有待检DNA模板、含有阳性扩增内标DNA的重组质粒、阳性扩增内标DNA的TaqMan探针、鸭的IL-2基因扩增引物和TaqMan探针，进行荧光定量PCR反应；应用ABI7500Software SDS1.4对结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；

其中，

2.根据权利要求1所述的快速检测食品中鸭源性成分的方法，其特征在于：所述TaqMan探针荧光定量PCR方法，20μL反应体系为：2μL待检模板DNA，2μL含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，10μL Premix Ex Taq，0.8μL鸭DNA探针溶液，0.8μL扩增内标探针溶液，0.4μL ROX校正溶液，上、下游引物各为0.4μL，灭菌蒸馏水补足。

3.根据权利要求1所述的快速检测食品中鸭源性成分的方法，其特征在于：所述TaqMan探针荧光定量PCR方法，反应条件为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，40个循环。