CN104774958B

CN104774958B - 鉴别驴、马、狐狸动物源性的引物探针组合物、试剂盒和多重实时荧光定量pcr检测方法

Info

Publication number: CN104774958B
Application number: CN201510205907.6A
Authority: CN
Inventors: 步迅; 张全芳; 刘艳艳; 范阳阳
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2035-04-27
Also published as: CN104774958A

Abstract

本发明公开了一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的引物探针组合物，包括一对通用引物、三种特异TaqMan探针，还有一竞争型内标及其特异TaqMan探针。本发明还公开了包含该引物探针组合物的试剂盒和多重实时荧光定量PCR检测方法。本发明引物探针特异性强、灵敏度高，能够同时检测样品中是否含有驴、马、狐狸三种动物源性成分，能有效指示假阴性出现，提高了检测的准确性，为皮张、肉类及其加工品中多种动物源性成分的鉴定探索了新的途径。

Description

鉴别驴、马、狐狸动物源性的引物探针组合物、试剂盒和多重实时荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速鉴别驴、马和狐狸3种动物源性成分的引物探针组合物、试剂盒以及多重实时定量PCR检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

“天上龙肉，地下驴肉”，是人们对驴肉的最高褒扬。从营养学和食品学的角度看，驴肉比牛肉、猪肉口感好、营养高。驴肉中氨基酸构成十分全面，8种人体必需氨基酸和10种非必需氨基酸的含量都十分丰富。驴肉的不饱和脂肪酸含量，尤其是生物价值特高的亚油酸、亚麻酸的含量都远远高于猪肉和牛肉。驴肉一直被人们誉为美味保健的传统食品，然而近年来，由于养殖量大大减少，驴肉供应量逐年降低，完全不能满足火爆的市场需求，价格更是不断攀升。2014年元旦后的国际零售巨头沃尔玛“假驴肉门”事件并非特例，在利益驱使下，部分餐馆和不法商家为了谋权暴利，收购问题驴肉，采用向驴肉中掺杂廉价的马肉、狐狸肉等策略欺骗消费者，这种廉价原料经过深加工后，已无法从外观上对其组成进行鉴定。掺杂、掺假、以次充好等手段欺骗消费者谋权暴利现象目前在国内外均屡屡发生,这种造假行为不仅仅涉及经济、法律、营养价值及宗教信仰问题，部分企业在狐狸肉处理过程中，甚至加入合成色素或发色剂亚硝酸盐—亚硝酸盐可与食物或胃中的物质产生强致癌作用，对人体健康存在极大威胁。因此，尽快建立可靠有效的驴、马和狐狸源性检测方法，对于确保食品标签真实准确，加强食品标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。

目前，食品中动物源性成分鉴别的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法。其中尤以分子生物学方法最为快速、准确、稳定、高效和灵敏。采用DNA分子水平的检测方法与蛋白质水平的检测方法相比，目标DNA比较稳定，不易受到外界环境及加工工艺的影响，而蛋白质在高温加工后构象会改变，不稳定，每个物种不一致，鉴别起来困难，而且DNA提取简单，易操作。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、闭管反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。

鉴于线粒体基因组(mtDNA)结构比较简单、稳定、分子量小，每个细胞中有1000-10000个拷贝，容易从组织中分离提取。大量研究证明，在动物种属鉴定中mtDNA与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定容易操作等优势。在mtDNA中，16SrRNA基因是线粒体基因组中研究较多的基因，为生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可变序列，其序列变化与进化距离相适应，被称为进化分子钟。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，加之多重实时荧光PCR的快速、灵敏、高通量等特点，其在动物源性成分鉴别检测中具有广泛的应用前景。

此外，目前针对动物源性的荧光定量PCR检测体系均缺乏内标(IAC)对反应体系进行监控，无法避免由反应抑制因素而造成假阴性结果的产生，导致检测结果不准确。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的引物探针组合物，该引物探针组合物能快速鉴别驴、马、狐狸三种动物源性成分，特异性好，灵敏度高。

本发明的另一目的是提供含有上述引物探针组合物的PCR检测试剂盒，该试剂盒操作方便，不易污染，准确稳定。

本发明的另一目的是提供一种多重实时荧光定量PCR检测方法，该方法快速方便，能有效指示假阴性出现，灵敏准确。

本发明应用PCR技术及荧光探针进行核酸DNA分子标记技术，采用多重多色荧光定量PCR检测技术，实现驴、马和狐狸3种动物源性成份的快速、准确定性检测。引物和探针是实现本发明的关键。基于线粒体基因组具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定容易操作等优势，本发明以线粒体16SrRNA基因为靶基因，根据NCBI数据库分别下载驴、马和狐狸的线粒体16SrRNA基因序列，应用同源分析工具DNAMAN软件对其同源性比对，根据筛选出的核心片段两端相似的序列，利用引物设计软件Primer5.0在高度保守区设计一对同时适合驴、马和狐狸的PCR通用引物，再使用Primer3.0在可变区设计驴、马和狐狸的3种TaqMan特异探针。

本发明设计的同时适合驴、马、狐狸源性的通用引物如下：

上游引物：5'CGGGAATGACTAAATAAGACGA 3'

下游引物:5'GGTCACCCCAACCGAAAT3'。

本发明设计的驴特异TaqMan探针(简称驴特异探针，下同)为：

5'TCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAC 3'。

本发明设计的马特异TaqMan探针(简称马特异探针，下同)为：

5'ACAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACA 3'。

本发明设计的狐狸特异TaqMan探针(简称狐狸特异探针，下同)为：

5'CCCCACTGGGAATAACATACTACCATTG 3'。

在PCR检测时，因为多种因素容易出现PCR反应假阴性的现象，为了有效指示假阴性，本发明还设计构建内标及其相应的内标TaqMan探针(简称内标探针，下同)，提高检测的准确性。内标的DNA序列如SEQ ID NO：6所示，为：CGGGAATGACTAAATAAGACGATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTCGGTTGGGGTGACC，共100bp。其构建方法为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上下游连接上驴、马和狐狸3个物种的通用引物序列，从而形成该100bp的内标DNA序列。在PCR体系使用时，内标以重组质粒的形式加入PCR体系中，重组质粒为内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成，其方法为：将这段扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到载体PMD18-T，转化感受态DH5a，质粒提取，并测序验证，得到能同时针对驴、马和狐狸3个物种检测体系的含有内标DNA的重组质粒。

上述内标TaqMan探针为：5'–TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3'。

本发明提供了一种能够鉴别驴、马、狐狸动物源性的组合物，该组合物包括上述一对通用引物和上述驴、马和狐狸特异TaqMan探针。

进一步的，该组合物还包括上述内标和内标TaqMan探针。其中，所述内标以重组质粒的形式存在，所述重组质粒为上述将内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成的含有内标DNA的重组质粒。

本发明中，所述驴特异探针、马特异探针、狐狸特异探针和内标探针的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团。所述报告基团可以为FAM、JOE、CY3、CY5等，所述淬灭基团可以为TAMRA、BHQ等。

本发明还提供了一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括：a.一对上述通用引物；b.驴、马、狐狸3种特异TaqMan探针；c.含有内标的重组质粒；d内标TaqMan探针。所述含有内标的重组质粒为内标DNA序列与质粒重组得到的重组质粒。所述质粒可以为PMD18-T。

进一步的，本发明试剂盒中还可以包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq酶和超纯水。

上述试剂盒中，各成分的用量可以参照现有技术中通用的用量规则来加入，例如各引物加入量相同，各探针加入量也相同。

本发明还提供了一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的多重实时荧光定量PCR检测方法，该方法包括使用本发明鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒，鉴别待检样本中是否含有驴、马、狐狸源性成分的步骤。

上述多重实时荧光定量PCR检测方法中，使用本发明试剂盒能够同时鉴别待检样本中是否含有驴、马、狐狸源性成分。

上述多重实时荧光定量PCR检测方法中，具体包括以下步骤：

(1)提取待检样本的基因组DNA，备用；

(2)将提取的基因组DNA加入鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒中，利用多重实时荧光定量PCR法检测；

(3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号鉴别待检样本中是否含有驴、马、狐狸源性成分。

上述方法中，本领域技术人员可以按照现有技术中公开的方法和试剂盒提取待测肉品的基因组DNA，该操作是容易实现的。

上述方法中，所述待检样本可以为皮张、肉类及肉类加工品。

在PCR检测时，将试剂盒中的引物、探针、扩增内标等各种试剂加入一支荧光定量PCR反应管中，然后加入模板DNA形成荧光定量PCR反应体系。

各种上述方法中，PCR扩增条件为：95℃10min预变性；95℃5s，63℃35s，在此收集荧光信号，共计45个循环。

上述方法中，优先选用20μl的PCR扩增体系。

上述方法中，按照以下方式判读是否含有驴、马、狐狸源性成分：

a.当相应的驴、马、狐狸特异探针的荧光信号被检出，且Ct值<35时，无论内标探针的荧光信号是否被检出(检测样品会抑制内标DNA的扩增)，均表示待检样本中含有相应的动物源性成分；

b.当内标探针的荧光信号被检出且Ct值<35时，如果相应的驴、马、狐狸特异探针的荧光信号没有被检出，或者虽然有荧光信号检出但是Ct值＞35，则表示不含相应的动物源性成分或含量低于检测界限；

c.当相应的驴、马、狐狸特异探针没有荧光信号被检出，且内标探针也没有荧光信号被检出时，表示实验失败，需要重新进行实验。

上述方法中，使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应可在4通道或5通道的任何型号的荧光定量PCR仪上进行。

目前国内外添加有外源扩增内标的动物源性多重荧光定量PCR检测方法少有报道，因此，本发明建立的添加有外源扩增内标的驴、马和狐狸的多重实时荧光定量PCR检测方法对皮张、肉类及其加工品市场安全的快速监管具有重要的创新实践意义。

本发明采用多重荧光定量PCR技术鉴别驴皮、驴肉及驴肉加工制品是否掺假，能够同时检测样品中是否含有驴、马、狐狸三种动物源性成分。所用试剂盒中含有一对通用引物，三种特异TaqMan探针，还有一竞争型内标及其特异TaqMan探针。扩增时仅用一对通用引物，降低了多对引物对荧光定量PCR体系产生干扰的风险；扩增内标与目的基因共用一对引物，能有效指示假阴性出现，提高了检测的准确性。此外，在同一PCR试剂盒内可完成4重多色荧光定量PCR检测，仅需单管，全程无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高，特异性强，通量大等优势，为皮张、肉类及其加工品中多种动物源性成分的鉴定探索了新的途径。

附图说明

图1.为驴、马、狐狸基因组和内标序列DNA同源性片段序列比对图，箭头所示为各物种探针和内标引物位置。

图2.马源性阳性检测结果图，只有FAM荧光检出，且Ct值<35，内标CY5荧光信号正常扩增，即确定含有马源性成分。

图3.驴源性阳性检测结果图，只有JOE荧光被检出，且Ct值<35，内标CY5荧光信号正常扩增，即确定含驴源成分。

图4.狐狸源性阳性检测结果图，只有CY3荧光被检出，且Ct值<35，内标CY5荧光信号正常扩增，则可视为含狐狸源成分。

图5.为马源性灵敏度检测图，当模板DNA含量为0.01ng时，有扩增曲线且Ct值<35；当模板DNA量为0.001ng时，有扩增曲线但Ct值＞35，所以本发明检测马源性检出限为0.01ng。

图6.为驴源性灵敏度检测图，当模板量为0.01ng时，有扩增曲线且Ct值<35，当模板量为0.001ng时，有扩增曲线但Ct值＞35，所以本发明检测驴源性检出限为0.01ng。

图7.为狐狸源性灵敏度检测图，当模板量为0.01ng时，有扩增曲线且Ct值<35，当模板量为0.001ng时，有扩增曲线但Ct值＞35，所以本发明检测狐狸源性检出限为0.01ng。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。应理解这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。

下述实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：

1、实验材料：生熟驴肉、马肉、狐狸肉、生牛肉、生绵羊肉、生猪肉、生山羊肉、生兔肉、生鸭肉、生鸡肉、生鹅肉、生鱼肉、玉米、小麦等购于济南市农贸市场。

2、所用试剂：动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。2×TaqMan Master Mix为DBIBioscience品牌。Taq^TM Hot Star Version热启动酶、dNTP、Mg²⁺、DNA分子量MakerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。DNA测序由山东省农科院生物技术中心测序中心完成。

3、所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Ependorf公司产品，凝胶成像仪为BIO-RAD公司产品。

实施例1

1、通用引物设计：根据NCBI数据库中分别下载驴、马和狐狸的线粒体16SrRNA基因序列，应用同源分析工具DNAMAN软件对其同源性比对，如图1所示，利用引物设计软件Primer5.0根据筛选出的核心片段两端相似序列设计一对PCR通用引物。

2、设计构建含有内标DNA的重组质粒：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上下游连接上驴、马和狐狸3个物种的通用引物序列，从而形成一段100bp的内标DNA序列。将这段内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到载体PMD18-T，转化感受态DH5a，提取质粒，并测序验证，得到能同时针对驴、马和狐狸3个物种源性检测体系的含有内标DNA的重组质粒，也可称为重组PMD18-T质粒。

3、四种TaqMan特异探针设计：应用同源分析工具DNAMAN软件对驴、马、狐狸线粒体16SrRNA基因序列和内标DNA序列的同源性进行比对，在可变区使用Primer3.0设计驴、马和狐狸3种动物源性的特异探针，以及内标探针。同时，为了后续使用，在每种探针的5’端用FAM、JOE、CY3、CY5等发光基团进行修饰，在每种探针的3’端用TAMRA、BHQ等淬灭基团进行修饰。

所用的通用引物、探针、内标如下表所示：

4、试剂盒的设计：试剂盒包括上述一对通用引物，驴、马、狐狸3种特异TaqMan探针，含有内标DNA的重组质粒、内标TaqMan探针。除此之外，还包括一些PCR反应所必须的试剂，例如PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq酶和超纯水。

上述试剂盒中，各成分的用量可以参照现有技术中公开的用量规则来选择，当试剂盒PCR反应体系为20μl时，体系中各成分含量可以按照以下用量选择：预混物Premix(pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM)，Taq酶0.5U/μL，通用引物终浓度为0.2-0.5μM、4种TaqMan探针的终浓度为0.2-0.5μM，含有内标质控DNA(即内标DNA)的重组质粒浓度0.1-1pg/μl，各探针浓度相同。

实施例2

采用本发明试剂盒和多重实时荧光定量PCR检测方法检测肉品动物源性的方法步骤如下，可以测出各种待测肉类样本中是否含有驴、马、狐狸动物源性成分：

1、DNA提取：取待测肉类样本50g研磨充分混匀，从中取50mg进行DNA提取，可用动物组织提取试剂盒提取DNA，也可用经典手提法(参照分子克隆手册动物组织DNA提取方法)。用Nanodrop核酸检测仪检测DNA样本浓度和纯度，要求在1-20ng/μl，OD值1.7-1.8之间。

2、待测样品DNA的实时荧光PCR扩增

在PCR反应管中加入表1所示反应体系，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：扩增程序：95℃10min预变性；95℃5s，63℃35s，在此收集荧光信号，共计45个循环。

表1 多重实时荧光定量PCR反应体系

试剂名称	浓度	用量(μL)
			HS-Taq酶	5U/μL	0.2
预混物	10×	2
			通用引物混合物	2μM	2
探针混合物	2μM	2
			内标质控重组质粒	1pg/μl	2
DNA模板	20ng/μL	2
			超纯水	-	10.8
总体积	-	20

3、使用ABI 7500荧光定量PCR仪分析软件分析扩增结果，为确保检测结果的准确性，同时设置阴性对照(Negative Control)实验和阳性对照(Positive Control)实验。

3.1 Negative Control实验：在将待测肉类样本DNA加入PCR反应体系进行多重实时荧光定量PCR检测的同时，进行以ddH₂O替代待测肉类样本DNA的对照实验，作为阴性对照。阴性对照实验结果显示正常时实验正常进行，显示结果不正常时修正相应的条件后再进行实验。阴性对照实验检测结果判定标准如下表2所示：

表2 Negative Control实验检测结果判定标准

3.2Positive Control实验：在将待测肉类样本DNA加入PCR反应体系进行多重实时荧光定量PCR检测的同时，进行以纯正的驴、马和狐狸肉的DNA替代待测肉类样本DNA的对照实验，作为阳性对照。阳性对照实验结果显示正常时实验正常进行，显示结果不正常时修正相应的条件后再进行实验。阳性对照实验检测结果判定标准如下表3所示：

表3 Positive Control实验检测结果判定标准

3.3待测肉类样本检测结果判定：

在同时进行的阴性、阳性对照实验结果正常的情况下，实验结果具有可用性。当待测肉类样本有驴、马、狐狸的相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，Ct值<35时，说明待测肉类样本中含有相应的动物源性成分；如果待测肉类样本没有驴、马、狐狸的相应荧光信号检出，或者虽然有驴、马、狐狸的相应荧光信号检出但是Ct值>35，说明待测肉类样本中没有驴、马、狐狸的动物源性成分。当相应的驴、马、狐狸特异探针没有荧光信号被检出，且内标探针也没有荧光信号被检出时，表示实验失败，需要重新进行实验。

如图2所示，图中只有FAM荧光检出，且Ct值<35，则可视为含马源性成分；如图3所示，图中只有JOE荧光被检出，且Ct值<35，则可视为含驴源性成分；如图4所示，图中只有CY3荧光被检出，且Ct值<35，则可视为含狐狸源性成分。

为了验证试剂盒中引物和探针的性能，进行以下验证实验。

特异性试验

分别用动物组织提取试剂盒或经典手提法提取驴肉、马肉、狐狸肉、牛肉、绵羊肉、山羊肉、猪肉、兔肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、鱼肉、玉米、小麦中的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应条件分别进行荧光定量PCR检测，验证引物和探针的特异性。检测结果如下表4所示。

表4 引物和探针特异性实验结果

从以上结果可以看出，驴、马和狐狸探针仅针对相应物种具有Ct值，而其他样本没有扩增。由此可见本发明试剂盒中的引物及探针具有很强的物种特异性。

基因组DNA灵敏度试验

使用动物组织提取试剂盒提取马、驴、狐狸的基因组DNA，用Nanodrop定量到50ng，做10×梯度稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，每个梯度均取2μl为模板量，(即：10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001ng)按照上述方法分别对马、驴及狐狸DNA进行检测以考察本试剂盒的灵敏度。

马、驴及狐狸DNA检测结果见图5-图7，从图中可以看出，当荧光定量DNA模板用量为0.01ng时马、驴、狐狸特异探针仍有扩增曲线；但当模板用量为0.001ng时基本无扩增曲线了，Ct值>35，所以使用本试剂盒的检测限为0.01ng。

重复性试验

分别取纯马，驴及狐狸的基因组DNA，每个物种各取3个样本DNA，按照上述优化好的体系、PCR条件进行实时定量PCR，每个样本进行3次复孔的独立重复，考察方法的稳定性，结果见表5。表5中，Ct Mean表示Ct的平均值，Ct SD表示Ct的标准方差，从表中可以看出，每个样本的3次独立重复实验Ct值的标准方差均小于0.5，说明检测结果重复性好，检测稳定性高。

表5 重复性试验结果

实施例3检测方法的应用

选取实际要检测的样品，样品为从济南市各大超市、农贸市场等处采购的肉制品，采用本发明试剂盒按照实施例2所述的方法检测驴肉的真实性，以验证本方法的使用价值。

步骤如下：

1、DNA提取：将待检测的样品提取DNA，用Nanodrop核酸检测仪检测DNA样本浓度为20ng/μl，OD值1.7-1.8之间。

2、待检样品DNA的实时荧光PCR扩增

在PCR反应管中加入下表所示的PCR反应体系，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：扩增程序：95℃，10min，预变性；95℃5s，63℃35s，在此收集荧光信号，45个循环。同时，进行阳性对照实验和阴性对照实验。

PCR反应体系

试剂名称	浓度	用量(μL)
			HS-Taq酶	5U/μL	0.2
预混物	10×	2
			通用引物混合物	2μM	2

探针混合物	2μM	2
			内标质控重组质粒	1pg/μl	2
DNA模板	20ng/μL	2
			超纯水	-	10.8
总体积	-	20

3、使用ABI 7500荧光定量PCR仪分析软件分析扩增结果，阳性对照和阴性对照实验显示结果正常，各种待检样品的检测结果如下表6所示。由表中可见，市售驴肉产品中有很多为狐狸肉或马肉成分冒充，存在掺假现象。

表6.市售驴肉产品检测结果

<110>山东省农业科学院生物技术研究中心

<120>鉴别驴、马、狐狸动物源性的引物探针组合物、试剂盒和多重实时荧光定量PCR检测方法

<160>7

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

CGGGAATGAC TAAATAAGAC GA 22

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

GGTCACCCCA ACCGAAAT 18

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

TCAACATACA AACCTAACCC TCAGGGAC 28

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ACAACACACA AACCTAACCT TCAGGGACA 29

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CCCCACTGGG AATAACATAC TACCATTG 28

<210>6

<211>100

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

CGGGAATGAC TAAATAAGAC GATGGAGCAC GCCGTAAGCT TAACCTGACG CTAGTAGGCA 60

AGTACGCTCC ATTGGTGACC TCATTTCGGT TGGGGTGACC 100

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

TGACGCTAGT AGGCAAGTAC GCTCCATT 28

Claims

1.一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的组合物，其特征是：包括一对通用引物和驴、马、狐狸3种特异探针；

所述通用引物如下：

上游引物：5' CGGGAATGACTAAATAAGACGA 3'

下游引物: 5'GGTCACCCCAACCGAAAT3'

所述驴特异探针为：5' TCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAC 3'

所述马特异探针为：5' ACAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACA 3'

所述狐狸特异探针为：5' CCCCACTGGGAATAACATACTACCATTG 3'。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征是：还包括内标及其内标探针；所述内标的DNA序列为：

CGGGAATGACTAAATAAGACGATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTCGGTTGGGGTGACC；

所述内标探针为：5'TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3'。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征是：所述内标以重组质粒的形式存在，所述重组质粒为内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成的重组质粒。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征是：所述驴特异探针、马特异探针、狐狸特异探针和内标探针的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团。

5.一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒，其特征是：包括权利要求1、2、3或4所述的鉴别驴、马、狐狸动物源性的组合物。

6.根据权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征是：还包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq酶和超纯水。

7.一种鉴别驴、马、狐狸动物源性的多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括使用权利要求5或6所述的鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒，鉴别待检样本中是否含有驴、马、狐狸源性成分的步骤。

8.根据权利要求7所述的多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：

（1）提取待检样本的基因组DNA，备用；

（2）将提取的基因组DNA加入鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒中，利用多重实时荧光定量PCR法检测；

（3）收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过所得扩增曲线鉴别待检样本中是否含有驴、马、狐狸源性成分。

9.根据权利要求8所述的多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：PCR扩增条件为：95℃ 10min, 预变性；95℃ 5s，63℃ 35s，在此收集荧光信号，共计45个循环。

10.根据权利要求8所述的多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：

a.当相应的驴、马、狐狸特异探针的荧光信号被检出，且Ct值<35时，无论内标探针的荧光信号是否被检出，均表示待检样本中含有相应的动物源性成分；