CN105238780B

CN105238780B - 引物组合及确定生物样品来源的方法

Info

Publication number: CN105238780B
Application number: CN201510616898.XA
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 刘玉方; 李晓晨; 孙克非
Original assignee: Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Current assignee: Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2035-09-24
Also published as: CN105238780A

Abstract

本发明提出了一种引物组合及其一种确定生物样品来源的方法，所述引物组合包括：第一核酸分子和第二核酸分子，第一核酸分子和第二核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的特征性DNA区段。本发明所提出引物组合和方法能够快速、准确、灵敏地检测出狐狸、貉和貂物种或狐狸、貉和貂源性成分。

Description

引物组合及确定生物样品来源的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种引物组合，一种试剂盒及其一种确定生物样品来源的方法。

背景技术

随着人们对生活质量的越发重视，食品安全问题得到各国政府的广泛重视。尤其是动物饲料、肉质品等跟民生息息相关的产业，更加得到消费者的高度关注。目前，对畜禽动物制品的源性成分检测已经涉及到食品工业、饲料贸易以及餐饮业等领域。成为保障食品及饲料安全的常规检测手段，承担着进出口防疫检查、肉制品市场监督的重要任务。是否能够快速、高灵敏地检测到饲料及食品中添加的违禁物质(如添加剂、非饲料类肉粉等)，将直接关系到国家的饲料及食品安全保障，进而影响人们的健康和生活。

在目前已开发的畜禽动物源成分分子生物学检测方法中，以分子标记技术应用最为广泛和成熟。常用的分子标记有基因组DNA标记、RNA标记、线粒体DNA标记以及蛋白质标记。其中，由于线粒体DNA遗传特性相对独立，又具备细胞拷贝数高、无组织特异性、不易降解等特点。被广泛用于动物源性成分鉴定的标记位点。目前，国内外对鸡、鸭、鱼、羊、牛、狗、猫、猪、驴、马等物种的源性成分鉴定已各有报道。

然而，能够快速、灵敏地检测畜禽类动物源性成分的方法仍有待进一步开发。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

狐狸、貉、貂，由于其肉经济价值低，许多商贩或养殖户将狐狸、貉、貂肉充当羊肉等，以肉粉制品卖入食品或饲料市场谋取利益。但由于此类制品往往在肉眼及感官上很难区分，从而极易造成饲料及食品市场的混乱，增加狐狸、貉、貂疾病流行的风险以及人畜共患疾病的可能。

申请公布号为CN102643912A的专利公开了一种检测水貂源性成分的扩增引物，属于特种经济动物水貂源性成分的检测。该方法是针对貂物种的特异检测方法，只能检测单一物种，从而限制了检测通量，增加了检测操作的繁琐性。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够同时检测狐狸、貉、貂的引物组合，该引物组合是针对狐、貉、貂的通用特异引物，能够同时对三种物种进行检测，提高了检测通量和检测效率。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种引物组合。根据本发明的实施例，该引物组合包括：第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的特征性DNA区段。根据本发明的实施例，该引物组合是针对狐、貉、貂的通用特异引物，能够同时对狐狸、貉和貂物种进行检测，检测通量和检测效率显著提高。

根据本发明的实施例，上述引物组合还可以具有下列附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，上述引物组合进一步包括：第三核酸分子和第四核酸分子，所述第三核酸分子和所述第四核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的所述特征性DNA区段的一部分。根据本发明的实施例，第三核酸分子和第四核酸分子是针对狐、貉、貂的通用特异荧光PCR引物，能够同时对狐狸、貉和貂物种进行荧光定量PCR检测，由于荧光定量PCR具有灵敏度高的特点，检测结果既可以作为对第一核酸分子和第二核酸分子检测结果的再确定，又可以检测出第一核酸分子和第二核酸分子未筛选出的微量狐狸、貉和貂的源性成分，同时也可以通过荧光定量PCR检测结果对样品DNA的起始拷贝数进行定量。根据本发明的实施例，应用第三核酸分子和第四核酸分子进一步提高了检测结果的准确性，进一步提高了检测效率。

根据本发明的实施例，所述特征性DNA区段具有SEQ ID NO：1～3之一所示的核苷酸序列。

CACCATGCCTCGAGAAACCATCAATCCTTGCTCGAAGTATCCCTCTTCTCGCCCCGGGCCCATATCAACGTGGGGGTTTCTATCATGGAACTATACCTGGCATCTGGTTCTTACCTCAGGGCCATTCTGCTTGTTCACTCCAATCCTACTAATCCTCTCAAATGGGACATCTCGATGGACTAATGACTAATCAGCCCATGATCACACATAACTGTGGTGTCATGCATTTGGTATCTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGAACTTGCTATCACTCAGCTATGACCGCAACGGCACTAACTCTAACCTACATCTGCACTCAGGGAATATGCCCGTCGCGGCCCCGACGCAGTCAGATGATCTGTAGCTGGACTTATTCATTATCATTTATCAACTCCGTGCACAATTCAAGGTGCTATTCAGTCAATGGTTTCAGGACATAAGGAATTTACACACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACGTACACACGTACGTACACACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGTACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGTACGTACACGCAAGATATTGAGTTAGCTCATACAAACCCCCCTTACCCCCCGTAAACTCATGCTACTCGCTATACACCTATATATGCCCCGCCAAACCCCAAAAACAGGACTAAGCACATG(SEQ ID NO:1)。

CACCATGCCTCGAGAAACCATCAACCCTTGCCCGATGTGTACCTCTTCTCGCTCCGGGCCCATAGAATGTGGGGGTTTCTATCCTGAAACTATACCTGGCATCTGGTTCTTACTTCAGGGCCATGATAGTCCTCAATCCAATCCTACTAACCCTTCAAATGGGACATCTCGATGGACTAATGACTAATCAGCCCATGATCACACATAACTGTGGTGTCATGCATTTGGTATTTTTTAATTTTTAGGGGGGGGGGACTGGTATCACTCAGCTATGGCCGTAAAGGCCTCGTAGCAGTCAAATAACTTGTAGCTGGGCTTATCCTTCATCATTTATCCGCATCGCACAACCATAAGGTGCAATTCAGTCAATGGTTACAGGACATACACACGTATACACGTACACACGTACACGTATACACGTACACACGTACACACGTACACGTATACACGTATACACGTACACACACGTACACGTACACGTATACACGTACACGTACACACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTATACACGTACACACGTACACGCATCACGCAATTCAACAGATAAAGACTAATTTAAAACAAACCCCCCTTACCCCCCGTAACCTCAAAGTATACAAGTACCCGTAATTGTTCTGCCAAACCCCAAAAACAGGACTAAGCACATG(SEQ ID NO：2)。

CACCATGCCTCGAGAAACCATCAACCCTTGCCTGAAGTGTACCTCTTCTCGCTCCGGGCCCATACCAACGTGGGGGTTTCTATAATGGAACTATACCTGGCATCTGGTTCTTACCTCAGGGCCATGAACTCCCTCCATCCAATCCTACTAATCCACTCAAATGGGACATCTCGATGGACTAATGACTAATCAGCCCATGATCACACATAACTGTGGTGTCATGCATTTGGTATCTTTTATTTTTCGGGGGGGAATCTGCTATCACTCAACTATGACCGCAACGGCACTAACTCTAACTTATTCCTGCACTCAGGGGATATGCCCGTCGCGGCCCTGACGCAGTCAGATAACATGTAGCTGGACTTGCTTTCAATCATTAATCAACTCCGTGCACAATTCAAGGTGCTATTCAGTCAATGGTTACAGGACATAAGAACTTTTTCGCACGTACACACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACGCACGTACACACGTACACACGTACACACGTACACACGTACACACGTACACACGTACGCACGCGTACACGCAAGACATCAAGTTAGCTTACACAAACCCCCCTTACCCCCCACAAACTCATGTCTCCCACTATATACTTAATTATGTCCCGCCAAACCCCAAAAACAGGACTAAGCACATG(SEQ ID NO：3)。

其中，SEQ ID NO：1是狐狸基因组区段，SEQ ID NO：2是貂基因组区段，SEQ ID NO：3是貉基因组区段，SEQ ID NO：1～3是狐狸、貂和貉线粒体基因组的保守但与其它物种差异较大的DNA区段。根据本发明的实施例，本发明提出的第一核酸分子和第二核酸分子特异性扩增上述SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸分子，通过分析PCR扩增产物的大小和序列，可以准确判断狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，检测效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；所述第三核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；以及所述第四核酸分子具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

CACCATGCCTCGAGAAACCATCAA(SEQ ID NO：4)，

CATGTGCTTAGTCCTGTTTTTGGGGTTT(SEQ ID NO：5)，

ACTATACCTGGCATCTGGTTCTTA(SEQ ID NO：6)，

CCAAATGCATGACACCACAGTTA(SEQ ID NO：7)。

其中，SEQ ID NO：4和5是特异性扩增狐狸、貉和貂特征性DNA区段的引物对，SEQID NO：6和7是特异性扩增狐狸、貉和貂特征性DNA区段的荧光定量PCR引物对。根据本发明的实施例，SEQ ID NO：4～5和SEQ ID NO：6～7所示的引物对，通过PCR技术对狐狸、貉和貂特征性DNA区段进行扩增，能够准确、快速、灵敏地判断狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，检测效率显著提高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的引物组合。本发明所提出的试剂盒具有前面所述引物组合的优点和效果，所述试剂盒能够快速、准确、灵敏地确定狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作简便，检测效率高。

在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的引物组合或所述的试剂盒在确定生物样品来源中的用途。需要说明的是，在本发明中，确定生物样品的来源包括确定生物样品的物种或确定样品中生物物种源性成分的存在。根据本发明的实施例，前面所述的引物组合或所述的试剂盒能够快速、准确、灵敏地确定狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简便，检测效率高。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种确定生物样品来源的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的引物对或者试剂盒，对所述生物样品的核酸样本进行扩增，以便获得扩增产物；以及基于所述扩增产物，确定所述生物样本的来源。如前所述，确定生物样品的来源包括确定生物样品的物种或确定样品中生物物种源性成分的存在。根据本发明的实施例，本发明所提出的方法能够快速、准确地确定狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简便，检测效率高。

根据本发明的实施例，上述确定生物样品来源的方法还可以具有下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述确定生物样品来源的方法进一步包括：(1)从所述生物样品提取总DNA；(2)利用所述第一核酸分子和第二核酸分子对所述总DNA进行扩增，以便获得PCR扩增产物；以及(3)基于所述PCR扩增产物，确定所述生物样品的来源。如前所述，本发明所提出的引物组合能够特异性扩增狐狸、貉和貂基因组的特征性DNA区段。根据本发明的实施例，本发明所提出的确定生物样品来源的方法能够通过RCR方法，快速、准确地确认狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简便，检测效率高。

根据本发明的实施例，所述确定生物样品来源的方法进一步包括：(4)利用所述第三核酸分子和所述第四核酸分子，对所述总DNA进行荧光定量PCR；以及(5)基于所述荧光定量PCR的结果，对所述生物样品的来源进行定量分析。需要说明是，此处的定量分析指的是狐狸、貉和貂物种样品或源性成分的DNA的质量或初始拷贝数。如前所述，第三核酸分子和第四核酸分子作为荧光定量PCR引物，能够特异性扩增狐狸、貉和貂基因组的特征性DNA区段。根据本发明的实施例，利用所述第三核酸分子和所述第四核酸分子，对所述总DNA进行荧光定量PCR，能够进一步确定狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，同时能够检测样品DNA的初始拷贝数。根据本发明的实施例，本发明所提出的确定生物样品来源的方法能够快速、准确、灵敏地确认狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简单，检测效率高。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2是根据本发明实施例2的荧光定量PCR的扩增曲线结果；

图3是根据本发明实施例3的荧光定量PCR检测狐狸DNA的扩增曲线结果；

图4是根据本发明实施例4的荧光定量PCR检测貉DNA的扩增曲线结果；以及

图5是根据本发明实施例5的荧光定量PCR检测貂DNA的扩增曲线结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

狐狸、貉、貂，由于其肉经济价值低，许多商贩将狐狸、貉、貂肉充当羊肉等，以肉粉制品卖入食品或饲料市场谋取利益。但由于此类制品往往在肉眼及感官上很难区分，从而极易造成饲料及食品市场的混乱，增加狐狸、貉、貂疾病流行的风险以及人畜共患疾病的可能。申请公布号为CN102643912A的专利公开了一种检测水貂源性成分的扩增引物，属于特种经济动物水貂源性成分的检测。但该方法是针对貂物种的特异检测方法，只能检测单一物种，从而限制了检测通量，增加了检测操作的繁琐性。因此，目前检测狐狸、貉、貂物种的方法明显受到限制。发明人通过分析狐狸、貉、貂的基因组序列，设计了一种针对狐狸、貉、貂的保守但明显区别于其它物种特征性DNA序列的引物组合，从而通过PCR技术，实现了快速、准确地确认狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简便，大大提高了检测效率。

引物组合

在本发明的第一方面，本发明提出了一种引物组合。根据本发明的实施例，该引物组合包括：第一核酸分子和第二核酸分子，第一核酸分子和第二核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的特征性DNA区段。根据本发明的实施例，该引物组合是针对狐、貉、貂的通用特异引物，即利用一对引物，就能够通过简便的PCR技术，实现同时对狐狸、貉和貂物种的检测，检测通量和检测效率显著提高，检测成本大幅缩减。

根据本发明的实施例，上述引物组合进一步包括：第三核酸分子和第四核酸分子，第三核酸分子和第四核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的特征性DNA区段的一部分。根据本发明的实施例，第三核酸分子和第四核酸分子是针对狐、貉、貂的通用特异荧光引物，能够同时对狐狸、貉和貂物种进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法，并通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量PCR在扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，由于在PCR扩增的指数时期，模板的荧光域值(Ct值)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：

Ct＝-1/lg(1+Ex)*lgX₀+lgN/lg(1+Ex)

其中，n为扩增反应的循环次数，X₀为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

因此以第三核酸分子和第四核酸分子作为荧光定量PCR的检测结果既可以作为对第一核酸分子和第二核酸分子检测结果的再确定，又可以检测出第一核酸分子和第二核酸分子未筛选出的微量狐狸、貉和貂的源性成分，同时也可以通过荧光定量PCR检测结果对样品DNA的起始拷贝数进行定量。根据本发明的实施例，应用第三核酸分子和第四核酸分子进一步提高了检测结果的准确性，进一步提高了检测效率。

根据本发明的实施例，本发明所提出的第三核酸分子和第四核酸分子作为检测狐狸、貉和貂的荧光PCR引物，在荧光PCR检测过程中采用SYBR荧光染料法，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。根据本发明的实施例，本发明所提出的第三核酸分子和第四核酸分子作为检测狐狸、貉和貂的荧光PCR引物，能够灵敏、准确地确认狐狸、貉和貂物种或狐狸、貉和貂源性成分的存在。

根据本发明的实施例，所述特征性DNA区段具有SEQ ID NO：1～3之一所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID NO：1是狐狸基因组区段，SEQ ID NO：2是貂基因组区段，SEQ ID NO：3是貉基因组区段，SEQ ID NO：1～3是狐狸、貂和貉线粒体基因组的保守但与其它物种差异较大的DNA区段。由于线粒体DNA遗传特性相对独立，又具备细胞拷贝数高、无组织特异性、不易降解等特点，因此发明人通过分析线粒体DNA的序列，设计了针对SEQ ID NO：1～3任一序列的特异引物。根据本发明的实施例，本发明提出的第一核酸分子和第二核酸分子特异性扩增上述SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸分子，通过分析PCR扩增产物的大小和序列，可以准确、快速判断狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，检测效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；所述第三核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；以及所述第四核酸分子具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。其中，SEQID NO：4和5是特异性扩增狐狸、貉和貂特征性DNA区段的引物对，SEQ ID NO：6和7是特异性扩增狐狸、貉和貂特征性DNA区段一部分的荧光PCR引物对。根据本发明的实施例，SEQ IDNO：4～5和SEQ ID NO：6～7所示的引物对，通过PCR技术对狐狸、貉和貂特征性DNA区段进行扩增，能够准确、快速、灵敏地判断狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，检测效率显著提高。

试剂盒

引物组合或试剂盒在确定生物样品来源中的用途

确定生物样品来源的方法

根据本发明的实施例，所述确定生物样品来源的方法进一步包括：(1)从所述生物样品提取总DNA；(2)利用所述第一核酸分子和第二核酸分子对所述总DNA进行扩增，以便获得PCR扩增产物；以及(3)基于所述PCR扩增产物，确定所述生物样品的来源。如前所述，本发明所提出的引物组合能够特异性扩增狐狸、貉和貂基因组的特征性DNA区段。根据本发明的实施例，本发明所提出的确定生物样品来源的方法能够通过RCR方法，以便获得PCR扩增产物，通过凝胶电泳技术，判定PCR扩增产物中是否具有所要筛选的目标条带，通过测序进一步确定PCR扩增产物是否是所要筛选的目标序列，从而快速、准确地确认狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简便，检测效率高。

根据本发明的实施例，所述确定生物样品来源的方法进一步包括：(4)利用所述第三核酸分子和所述第四核酸分子，对所述总DNA进行荧光定量PCR；以及(5)基于所述荧光定量PCR的结果，对所述生物样品的来源进行定量分析。如前所述，此处的定量分析指的是狐狸、貉和貂物种样品或源性成分的DNA的质量或初始拷贝数。第三核酸分子和第四核酸分子作为荧光定量PCR引物，能够特异性扩增狐狸、貉和貂基因组的特征性DNA区段。根据本发明的实施例，利用所述第三核酸分子和所述第四核酸分子，对所述总DNA进行荧光定量PCR，能够进一步确定狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，同时能够检测样品DNA的质量或初始拷贝数。根据本发明的实施例，本发明所提出的确定生物样品来源的方法能够快速、准确、灵敏地确认狐狸、貉和貂物种或样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在，操作过程简单，检测效率高。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在实施例1中采用PCR方法对鸡、鸭、鱼、牛、羊、猪、狐狸、貉、貂等肉粉DNA进行扩增。

1)总DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304)对肉粉及动物组织进行DNA提取。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以及OD₂₆₀/OD₂₃₀比值。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值为2.0左右，则表明DNA纯度较好，满足PCR扩增需求。

2)PCR检测引物设计

根据GeneBank中提供的各物种线粒体DNA上D-Loop区域的核苷酸序列，依据各物种序列比对结果，找出狐狸、貉、貂物种内保守但与其他物种差异较大的序列区域设计引物。引物序列如SEQ ID NO：4和5所示：

正向引物(第一核酸分子，SEQ ID NO：4)：

5′-CACCATGCCTCGAGAAACCATCAA-3′

反向引物(第二核酸分子SEQ ID NO：5)：

5′-CATGTGCTTAGTCCTGTTTTTGGGGTTT-3′

3)狐狸、貉或貂源性成分PCR检测

利用设计的特异引物，对提取得到的鸡、鸭、鱼、牛、羊、猪、狐狸、貉、貂基因组DNA进行PCR扩增。PCR试剂采用天根生化科技(北京)有限公司Golden Fast PCR Kit(货号：KT501)。20微升的PCR反应体系包含0.4微升的正向引物(10微摩尔/升)、0.4微升的反向引物(10微摩尔/升)、10微升的2×PCR反应混合液(含有dNTP、镁离子)、0.5U快速DNA聚合酶、100纳克的基因组DNA，加入去离子水补足至20微升。

PCR反应程序为：94℃，3min，进入循环：94℃变性30s，72℃退火及延伸50s，35次循环，延伸：72℃，5min。

PCR反应完成后将产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。检测结果如图1所示。由图1可以看出：鸡、鸭、鱼、牛、羊、猪样品未扩增到目标条带，而狐狸、貉、貂均可扩增得到特异性条带。

实施例2

在实施例2中采用荧光定量PCR方法对鸡、鸭、鱼、牛、羊、猪、狐狸、貉、貂等肉粉DNA进行扩增

1)总DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304)对各样品肉粉进行DNA提取。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以及OD₂₆₀/OD₂₃₀比值。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值为2.0左右，则表明DNA纯度较好，满足PCR扩增需求。

2)PCR检测引物设计

根据GeneBank中提供的各物种线粒体DNA上细胞色素B(Cytochrome b)区域的核苷酸序列，依据各物种序列比对结果，找出狐狸、貉、貂物种内保守但与其他物种差异较大的序列区域设计引物。引物序列如SEQ ID NO：6和7所示：

正向引物(第三核酸分子，SEQ ID NO：6)：

5′-ACTATACCTGGCATCTGGTTCTTA-3′

反向引物(第四核酸分子，SEQ ID NO：7)：

5′-CCAAATGCATGACACCACAGTTA-3′

3)狐狸、貉或貂源性成分荧光定量PCR检测

利用设计的特异引物，对提取得到的鸡、鸭、鱼、牛、羊、猪、狐狸、貉、貂基因组DNA进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR采用天根生化科技(北京)有限公司产品：FastFire快速荧光定量PCR预混试剂(SYBR Green)(货号：KT501)。20微升的PCR反应体系包含：0.4微升正向引物(10微摩尔/升)、0.4微升反向引物(10微摩尔/升)、10微升2×PCR反应混合液(含有dNTP、镁离子以及DNA聚合酶)、20ng-200ng DNA模板，加入去离子水补足至20微升。每一个样品设置两个平行反应。

PCR反应程序为：95℃，1min，进入循环：95℃变性15s，74℃退火及延伸15s，40次循环。

PCR反应完成后分析扩增曲线。结果如图2所示，图2中RFU表示相对荧光单位。

图2结果显示：鸡、鸭、鱼、牛、羊、猪样品均无扩增，而狐狸、貉、貂样品均可得到有效扩增。其中狐狸样品扩增Ct值为21.3；貂样品扩增Ct值为25.9；貉样品扩增Ct值为21.1。

实施例3

荧光定量PCR方法对狐狸肉粉DNA的检测灵敏度分析

1)总DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304)对狐狸肉粉进行DNA提取。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其浓度、OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以及OD₂₆₀/OD₂₃₀比值。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值为2.0左右，则表明DNA纯度较好，满足PCR扩增需求。

2)PCR检测引物设计

正向引物(第三核酸分子，SEQ ID NO：6)：

5′-ACTATACCTGGCATCTGGTTCTTA-3′

反向引物(第四核酸分子，SEQ ID NO：7)：

5′-CCAAATGCATGACACCACAGTTA-3′

3)狐狸DNA的荧光定量PCR检测

将得到的狐狸基因组DNA进行10倍梯度稀释，并分别以其为模板进行荧光定量PCR扩增。定量试剂采用天根生化科技(北京)有限公司产品：FastFire快速荧光定量PCR预混试剂(SYBR Green)(货号：KT501)。PCR体系为20微升，包含0.4微升正向引物(10微摩尔/升)、0.4微升反向引物(10微摩尔/升)、10微升2×PCR反应混合液(含有dNTP、镁离子以及DNA聚合酶)、DNA模板量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg，加入去离子水补足至20微升。每一个样品设置三个平行反应。

PCR程序为：95℃，1min，进入循环：95℃变性15s，74℃退火及延伸15s，40次循环。

PCR反应完成后分析扩增曲线。结果如图3所示，图3中RFU表示相对荧光单位。图3结果显示，检测狐狸DNA的灵敏度约为10pg。

实施例4

荧光定量PCR方法对貉肉粉DNA检测灵敏度分析

1)总DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304)对貉肉粉进行DNA提取。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其浓度、OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以及OD₂₆₀/OD₂₃₀比值。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值为2.0左右，则表明DNA纯度较好，满足PCR扩增需求。

2)PCR检测引物设计

正向引物(第三核酸分子，SEQ ID NO：6)：

5′-ACTATACCTGGCATCTGGTTCTTA-3′

反向引物(第四核酸分子，SEQ ID NO：7)：

5′-CCAAATGCATGACACCACAGTTA-3′

3)貉DNA的荧光定量PCR检测

将得到的貉基因组DNA进行10倍梯度稀释，并分别以其为模板进行荧光定量PCR扩增。定量试剂采用天根生化科技(北京)有限公司产品：FastFire快速荧光定量PCR预混试剂(SYBR Green)(货号：KT501)。PCR体系为20微升，包含0.4微升正向引物(10微摩尔/升)、0.4微升反向引物(10微摩尔/升)、10微升2×PCR反应混合液(含有dNTP、镁离子以及DNA聚合酶)、DNA模板量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg，加入去离子水补足至20微升。每一个样品设置三个平行反应。

PCR反应完成后分析扩增曲线。结果如图4所示，图4中RFU表示相对荧光单位。

由图4结果可以看出，检测貉DNA的灵敏度约为100pg。

实施例5

荧光定量PCR方法对貂肉粉DNA的检测灵敏度分析

1)总DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(货号：DP304)对貂肉粉进行DNA提取。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其浓度、OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以及OD₂₆₀/OD₂₃₀比值。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值为2.0左右，则表明DNA纯度较好，满足PCR扩增需求。

2)PCR检测引物设计

正向引物(第三核酸分子，SEQ ID NO：6)：

5′-ACTATACCTGGCATCTGGTTCTTA-3′

反向引物(第四核酸分子，SEQ ID NO：7)：

5′-CCAAATGCATGACACCACAGTTA-3′

3)貂DNA的荧光定量PCR检测

将得到的貂基因组DNA进行10倍梯度稀释，并分别以其为模板进行荧光定量PCR扩增。定量试剂采用天根生化科技(北京)有限公司产品：FastFire快速荧光定量PCR预混试剂(SYBR Green)(货号：KT501)。PCR体系为20微升，包含0.4微升正向引物(10微摩尔/升)、0.4微升反向引物(10微摩尔/升)、10微升2×PCR反应混合液(含有dNTP、镁离子以及DNA聚合酶)、DNA模板量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg，加入去离子水补足至20微升。每一个样品设置三个平行反应。

PCR反应完成后分析扩增曲线。结果如图5所示，图5中RFU表示相对荧光单位。

由图5可以看出，检测貂DNA的灵敏度约为10pg。

综上实施例1～5可以看出，通过本发明所提出的SEQ ID NO：4和5所示的第一核酸分子和第二核酸分子可以快速、准确地确定狐狸、貉、貂源性成分，通过本发明所提出的SEQID NO：6和7所示的第三核酸分子和第四核酸分子可以进一步确认狐狸、貉、貂源性成分的存在，且检测灵敏度高，可以定量分析狐狸、貉、貂源性成分DNA的总量，进而可快速、准确、灵敏地检测狐狸、貉、貂源性成分。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种引物组合，其特征在于，包括：

第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的特征性DNA区段，

第三核酸分子和第四核酸分子，所述第三核酸分子和所述第四核酸分子被设置为适于扩增狐狸、貉和貂的所述特征性DNA区段的一部分，

其中，所述第一核酸分子为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

所述第二核酸分子为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，

所述第三核酸分子为SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；以及

所述第四核酸分子为SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述特征性DNA区段为SEQ ID NO：1～3之一所示的核苷酸序列。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的引物组合。

4.权利要求1～2任一项所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒在确定生物样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在的用途。

5.一种确定生物样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1～2任一项所述的引物组合，或者权利要求3所述的试剂盒，对所述生物样品的核酸样本进行扩增，以便获得扩增产物；以及

基于所述扩增产物，确定所述生物样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：

(1)从所述生物样品提取总DNA；

(2)利用所述第一核酸分子和第二核酸分子对所述总DNA进行扩增，以便获得PCR扩增产物；以及

(3)基于所述PCR扩增产物，确定所述生物样品中狐狸、貉和貂源性成分的存在。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括：

(4)利用所述第三核酸分子和所述第四核酸分子，对所述总DNA进行荧光定量PCR；以及

(5)基于所述荧光定量PCR的结果，对所述生物样品中狐狸、貉和貂源性成分进行定量分析。