CN105734160A - 畜禽肉猪牛羊源性成分pcr鉴定用引物体系及pcr鉴定方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种畜禽肉中猪、牛、羊源性成分鉴定用的引物体系以及PCR鉴定方法与试剂盒。根据动物线粒体DNA 16S rRNA基因的差异位点，设计特异性引物，见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。PCR鉴定方法，包括提取待测样本DNA，PCR扩增。试剂盒，包括SEQ ID NO.1?6。本发明引物均仅对各自物种目标片段进行特异性扩增，不会与其他物种发生反应，检测灵敏度较高，能有效鉴别出畜禽肉中的猪、牛、羊源性成分，该方法快速、灵敏、实用；若将该引物体系配合相关的试剂可以制成试剂盒，为工业化生产及应用提供可能，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及畜禽肉中猪、牛、羊源性PCR鉴定用的引物体系及PCR鉴定方法与试剂盒，适用于上述三种动物肉类源性快速检测与真假鉴别。
背景技术
肉与肉制品质量安全问题一直以来是全社会共同关注的热点话题。随着市场上猪肉和牛肉、羊肉价格差距的拉大，一些不法商家或个人为了追求自身利益，使用相对廉价的猪肉，通过各种手段的深加工，冒充牛肉、羊肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益，更直接影响着消费者的健康。近年来，随着“牛肉膏”、假冒牛、羊肉卷等事件的多次曝光，对食品中原料肉进行掺假、掺杂检测显得尤为重要。而传统的以经验为主的鉴别方法已远不能满足科学监管的需要，因此，建立快速、准确的畜禽肉中猪、牛、羊肉源性成分鉴定方法势在必行。对食品进行动物源性成分鉴定，有利于维护消费者利益，避免假冒伪劣食品的出现，也有利于肉类产业健康发展。
聚合酶链式反应（PCR）技术由于其操作简便、快速高效等特点，已逐步成为肉类种属鉴定的核心方法，在国内外肉类掺假研究中得到广泛应用，并取得创新性成果。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。而在目标基因的选择上，动物线粒体基因组DNA序列具有种内高度保守性和物种特异性，且由于拷贝数多而在食品加工过程未完全降解，因此其多态性位点是设计肉类成分定性检测的首选靶点。
近年来根据线粒体基因组DNA序列差异位点设计物种特异性引物，建立PCR以及实时荧光PCR方法在国外已有相关报道，而在国内目前仅有少数文献报道了使用PCR技术对肉类来源的鉴别，且其扩增序列多数基于动物基因组中的微卫星序列，方法的灵敏度受到基因组DNA提取效率的影响很大，而且所涉及到的物种覆盖面少，检测范围窄，是否能够精确的从若干混合的肉类中检测出牛源性、羊源性或猪源性成分还有待于进一步考证。
目前，基于线粒体DNA 16S rRNA 基因建立畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别的方法还未见相关报道。建立能够鉴别大量常见物种包括猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅等动物肉中猪牛羊源性成分的引物体系以及PCR方法，是提高肉品真假鉴别效率的有效途径之一，对打击假冒伪劣，维护市场秩序，提升食品安全监管能力具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种畜禽肉猪、牛、羊源性鉴别用引物体系和PCR鉴定方法及试剂盒，利用该引物体系和方法可快速准确的检测畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，并可对牛、羊肉真伪和掺假进行识别。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种畜禽肉中猪牛羊三种肉类源性成分PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：
（1）对猪16S rRNA 基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物序列为：CTCAACAAATTCACCAACAT，
反向引物序列为：GTGCGAGGAGAAAGGC；
（2）对牛16S rRNA 基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物序列为：AAGGAATAACAACAATCTC，
反向引物序列为：AGTGATTTGACTTGTGGG；
（3）对羊16S rRNA 基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物序列为：CCAGCAATAACATTAGCC，
反向引物序列为：CTTTGAATCTTTCCTGGGT。
本发明通过比对分析猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅九种动物线粒体DNA16S rRNA 基因的差异性位点，设计猪、牛、羊的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其它物种没有目的扩增信号，因此能够快速准确的对猪、牛、羊进行定性检测。
本发明还提供了一种猪肉、牛肉、羊肉的PCR鉴定方法。以样品总DNA为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据1.5%琼脂糖凝胶电泳判定结果，所述样品总DNA模板来自猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅肌肉样品的混合，或上述各物种肌肉样品的一种。
所述PCR扩增实验中特定的反应体系为20 μL体系：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，模板DNA 1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
所述PCR扩增实验中特定的反应程序为：先进行95℃ 预变性5 min；然后95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 60 s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为：所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别扩增出的DNA片段大小，其中
猪物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为126bp，126 bp扩增片段见以下序列划线部分：
ACCAAAGCTAGCTCAACATATTAAACAAATACAAAAATACACCAAAATAAAATAAAACATTCACCTAACACTAAAGTATAGGAGATAGAAATTTTTATCCTGACGCTATAGAGATAGTACCGTAAGGGAAAGATGAAAGAATAAAATAAAAGTAAAAAAAAGCAAAGATTACCCCTTCTACCTTTTGCATAATGGTTTAACCAGAAAAAATCTAACAAAGAGAACTTTAGCTAGATACCCCGAAACCAGACGAGCTACCTATGAGCAGTTTAAAAGAACCAACTCATCTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGACTTGTAGGTAGAGGTGAAAAGCCTAACGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCGAGAAAGAATTTTAGTTCAACCTTAAAAATACCCCAAAAACCCTAAATTCCAATGTATTTTTAAGAGATAGTCTAAAAAGGTACAGCTTTTTAGAAACGGATACAACCTTGACTAGAGAGTAAAATCTTAATACTACCATAGTAGGCCTAAAAGCAGCCATCAATTGAGAAAGCGTTAAAGCTCAACAAATTCACCAACATAATCCCAAAAACTAATAACAAACTCCTAGCCCAATACCGGACTAATCTA TTGAAACATAGAAGCAATAATGTTAATATGAGTAACAAGAAGCCTTTCTCCTCGCACACGCTTACATCAGTAACTAATAATATACTGATAATTAACAATCAATAAACCAAAACAACACTAAAGCGTTTATTAATTATATTGTTAACCCAACACAGGAGTGCACCAAGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGAACTCGGCAAACACAAACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCTAGCATTACTAGTATTAGAGGCAATGCCTGCCCAGTGACACCAGTTTAACGGCCGCGGTATTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTTCTCCAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGTTTTACTGTCTCTTACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATAAAAAAATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAATTAACTATTCCAAAAGTTAAACAATTCAACCACAAAGGGATAAAACATAACTTAACATGGACTAGCAATTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGTACAAAAAACCCTCCGAGTGATTTTAATCTAGACAAACCAGTCAAAATAACCATAACATCACTTATTGATCCAAAATTTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCTAGAGTTCCTATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACACCCAAATGGTGCAACCGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCGGTTTCTATCTATTATAAATTTCTCCCAGTACGAAAGGACAAGAGAAATGGGACCAACCTCACAAACGCGTCTCAGAGATAATTAATGATATAATCTTAACCTAATTAACTCATAATAAATCCAGCCCTAGAACAGGGCAC。
牛物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为108bp，108bp扩增片段见以下序列划线部分：
ACTAGACCTAGCCCAAAGATACCCTCTCGACTAAACAACCAAGATAGAATAAAACAAAACATTTAATCCCAATTTAAAGTATAGGAGATAGAAATCTAAGTACGGCGCTATAGAGAAAGTACCGCAAGGGAACGATGAAAGAAAAAAACTAAAAGTATAAAAAAGCAAAGATTACCCCTTGTACCTTTTGCATAATGAATTAACTAGTATAAGACTTAACAAAATGAATTTTAGCTAAGCAGCCCGAAACCAGACGAGCTACTCACAAACAGTTTACCAAGAACTAACTCATCTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGATTTGTAAGTAGAGGTGACATGCCTAACGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAGAAAATGAATCTAAGTTCAGCTTTAAAGATACCAAAAATTCAAATAAACCCCACTGTAGCTTTAAAAGTTAGTCTAAAAAGGTACAGCCTTTTAGAAACGGATACAACCTTGACTAGAGAGTAAAATTTAACACTACCATAGTAGGCCTAAAAGCAGCCATCAATTAAGAAAGCGTTAAAGCTCAACAACAAAAATTAAATAGATTCCAACAACAAATGATTAACTCCTAGCCCCAATACTGGACTAATCTATTATAGAATAGAAGCAATAATGTTAATATGAGTAACAAGAAAAATTTTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGCCTGATAATACTCTGACCACTAACAGTCAATAAAAATAATCCAACAATAAACAATTTATTGATTATACTGTTAACCCAACACAGGAGTGCATCTAAGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGAACTCGGCAAACACAAACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCCAGCATTCCCAGTATTGGAGGCATTGCCTGCCCAGTGACAACTGTTTAACGGCCGCGGTATCCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTTCTCTAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCGCACGAGGGTTTTACTGTCTCTTACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATGCACAAATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACCAACCCAAAGAGAATAGATTTAACCATTAAGGAATAACAACAATCTCCATGAGTTGGTAGTT TCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAATAAAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACCCACAAGTCAAATCACTCTATCGCTCATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCTATTACGTATTTCTCCCAGTACGAAAGGACAAGAGAAATAAGGCCAACTTTAAATCAAGCGCCTTAAGACAACCAATGATAACATCTCAACTGACAACACAAAACCCTGCCCTAGAACAGGGCTTA。
羊物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为229bp，229bp扩增片段见以下序列划线部分：
ACTATACCTAGCCCAAAATCTCCCACTCTCCAGTTTAAATAACTAAATTAATTAAAATAAAACATTTACCCTAATTAAAGTATAGGAGATAGAAATTCTAAACACGGCGCTATAGAGAAAGTACCGCAAGGGAATGATGAAAGAAAAAAATCATAGTACAAAAAAGCAAAGATTAACCCTTGTACCTTTTGCATAATGAATTAACGAGCAAAAAACTTAACAAAACGAATTTTAGCTAAGTAACCCGAAACCAGACGAGCTACTTATAGACAGTTTATTAGAACCAACTCATCTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGATCCATAAGTAGAGGTGACATGCCTAACGAGCCTGGTGATAGCTGGTTGTCCAGAAAATGAATTTTAGTTCAGCTTTAAAGATACCAAAAATACAAATAAATCCCACTGTATCTTTAAAAGTTAGTCTAAAAAGGTACAGCCTTTTAGAAATGGGTACAACCTTCACTAGAGAGTAAGATCTAAAAATACCATAGTAGGCCTAAAAGCAGCCATCAATTAAGAAAGCGTTAAAGCTCAACAACAATAGTATTATTAATCCCAGCAATAACATTAGCCAACTCCTAGATTTAATACTG GACTATTCTATTACTAAATAGAAGAATAATGTTAATATGAGTAACAAGAAATATTTTCTCCTCGCACAAGTTTAAGT CAGTAACTGATAATACCCTGACCGTTAACAGTAAATAAAAATAACCCAACAATAAATGATTTATTACTTATACTGTT AACCCAACACAGGAGTGCACCCAGGAAAGATTCAAAGAAGTAAAAGGAACTCGGCAAACACTAAACCCCGCCTGTTTACCAAAAACATCACCTCCAGCATCCCTAGTATTGGAGGCACTGCCTGCCCAGTGACTAAACGTTAAACGGCCGCGGTATTCTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCATTTGTTCTCTAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGTTTTACTGTCTCTTACTTCCAATCAGTGAAATTGACCTCCCCGTGAAGAGGCGGGGATAAATCAACAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGAAAATAAATTCAACCACCAAGGGATAACAACACTCCTTATGAGTTAACAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAGAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTAACAAGTCAAACCAAACCATCGCTTATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACACCCCGATGGTGCAACCGCTATCAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATCTGTTATGTATTTCTCCCAGTACGAAAGGACAAGAGAAATAAGGCCAACTTTAACAAAGCGCCTTAAACCAATTAATGACTTTATCTTAATTAATTTCACAACAAAACCTGCCCTAGAAAAGGGCCCA。
分别使用猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉来源的DNA模板，对引物进行特异性验证和比较，三种目标肉类均在设计位置观察到特异性条带，未见明显非特异性扩增。
将猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉和鹅肉来源的DNA模板以及双蒸灭菌水按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1等比例混合，对引物特异性进行研究，三种目标肉类引物仅与对应肉类DNA发生扩增反应，均与其它肉类DNA无交叉反应。
将157.67ng/ul猪肉来源DNA模板原液、141.46ng/ul牛肉来源DNA模板原液以及206.52ng/ul羊肉来源DNA模板原液，分别进行10倍梯度稀释，并进行灵敏度检测，目标DNA稀释104倍后，均仍可观察到微弱的特异性扩增，检测灵敏度达到皮克级。
本发明又提供了一种畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒，包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ。可以将本发明所述引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂，也可以为其他适用的除样品总DNA模板以外的试剂。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。
本发明的试剂盒可以由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器可以分别装有本发明中各物种的引物对。根据需要该引物可以是冻干形式或者溶于缓冲液中的状态。
本发明所述试剂盒可用于单物种总DNA模板以及多物种混合总DNA模板进行猪肉、牛肉、羊肉源性鉴定。所述试剂盒尤其适用于牛、羊肉掺假判定。
本发明的有益效果是：通过使用本发明的引物体系，可以有效检测多种畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，检测方法快速简单，准确性高，检测灵敏度达到皮克级，不仅能为检测牛源性和羊源性食品提供新的方法，而且能够抵御牛、羊肉掺假，维护消费者利益；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，具有较好的应用前景和良好的社会效益。
附图说明
图1是以本发明所述猪16S rRNA 基因引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。1：空白；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL 2000 DNA marker；
图2是以本发明所述牛16S rRNA 基因引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。1：空白；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL 2000 DNA marker；
图3是以本发明所述羊16S rRNA 基因引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图。1：空白；2：9种畜禽肉混合样；3：羊肉；4：牛肉；5：猪肉；6：兔肉；7：鸽肉；8：鹌鹑肉；9：鸡肉；10：鸭肉；11：鹅肉；12：DL 2000 DNA marker；
图4是以本发明所述引物对Ⅰ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：稀释10倍；2：稀释102倍；3：稀释103倍；4：稀释104倍；5：稀释105倍；6：DL 2000 DNA marker；
图5是以本发明所述引物对Ⅱ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：稀释10倍；2：稀释102倍；3：稀释103倍；4：稀释104倍；5：稀释105倍；6：DL 2000 DNA marker。
图6是以本发明所述引物对Ⅲ灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：稀释10倍；2：稀释102倍；3：稀释103倍；4：稀释104倍；5：稀释105倍；6：DL 2000 DNA marker。
图1-6中DL 2000 DNA marker为标准核酸分子量标签，该标签自下向上以此为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例所使用的主要材料、试剂与仪器具体如下：
样品：新鲜猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉购于超市和农贸市场。
试剂：离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；2×PCRMix（南京博尔迪公司）；电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂（宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖（Promega公司）；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；DNA测序由上海华大基因科技有限公司完成。
仪器和设备：PCR仪（德国EPPENDORF公司）；凝胶成像系统（基因有限公司）；核酸蛋白检测仪（德国EPPENDORF公司）；高速冷冻离心机（日本日立）。
实施例1
特异性引物体系的设计：根据GenBank上公布的猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅九种动物线粒体DNA 16S rRNA 基因序列，经BLAST比对分析，针对各物种特异性碱基位点利用Primer Premier5.0软件筛选出猪、牛、羊特异性引物对。各引物如下所述：
对猪16S rRNA 基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物序列为：CTCAACAAATTCACCAACAT（SEQ ID NO.1），
反向引物序列为：GTGCGAGGAGAAAGGC（SEQ ID NO.2）；
对牛16S rRNA 基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物序列为：AAGGAATAACAACAATCTC（SEQ ID NO.3），
反向引物序列为：AGTGATTTGACTTGTGGG（SEQ ID NO.4）；
对羊16S rRNA 基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物序列为：CCAGCAATAACATTAGCC（SEQ ID NO.5），
反向引物序列为：CTTTGAATCTTTCCTGGGT（SEQ ID NO.6）。
实施例2
（1）各物种肌肉总DNA提取：将新鲜猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉以及鹅肉分别充分搅碎混匀，采用上述离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，提取好的总DNA样品分别溶于100ul洗脱液TE中，1%琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白测定仪测定260nm和280nm处吸光度值，计算DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。
（2）采用实施例1中的3对引物，分别以上述猪肉、牛肉、羊肉DNA为模板，以其它动物肌肉DNA为对照，以无核酸的双蒸灭菌水为阴性对照，建立PCR检测体系。
（3）20 μL反应体系的配制：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，模板1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
（4）PCR反应程序的制定：先进行95℃ 预变性5 min；然后95℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 60 s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。
（5）琼脂糖凝胶电泳：取（4）中所得PCR扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1至图3所示：
其中图1是分别采用九种动物肌肉DNA为模板，以猪线粒体DNA 16S rRNA 基因的引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示猪物种特异引物对Ⅰ仅对猪肉DNA 模板特异扩增出126bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图2是分别采用九种动物肌肉DNA为模板，以牛线粒体DNA 16S rRNA 基因的引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示牛物种特异引物对Ⅱ仅对牛肉DNA模板特异扩增出108bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
图3是分别采用九种动物肌肉DNA为模板，以羊线粒体DNA 16S rRNA 基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增所得到的DNA条带。结果显示羊物种特异引物对Ⅲ仅对羊肉DNA模板特异扩增出229bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。
通过上述实验及实验结果可知，当猪、牛、羊的各自引物对均分别与九种动物总DNA模板进行PCR实验时，确定该引物仅对其自身物种的总DNA模板有反应，而对其它八个物种的总DNA模板没有反应，从而以单物种DNA模板方式验证了猪、牛、羊三个物种引物对的特异性。
实施例3
以所述各物种总DNA样品按照一定比例混合后的混合总DNA样品为模板：
（1）混合总DNA样品的处理：将实施例2中九种动物总DNA样品等体积混合，其中每种动物肌肉DNA各占0.1体积，并与0.1体积的双蒸灭菌水混匀，作为混合DNA模板。
（2）采用实施例1的3对引物，以混合DNA为模板，以9种动物肌肉DNA为对照，以无核酸的双蒸灭菌水为阴性对照，建立PCR检测体系。
（3）20 μL反应体系的配制：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，混合DNA模板1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
（4）PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例2中的反应程序。
（5）琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程同实施例2中的电泳。
所得凝胶成像结果如图1至图3中的2孔所示。该方法以猪、牛、羊三个物种特异性引物分别与混合总DNA模板进行PCR扩增反应，很好的验证了复杂总DNA模板条件下猪、牛、羊特异性引物的有效性和特异性。所述三种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。
实施例4
以所述猪、牛、羊肌肉DNA分别按照10倍梯度稀释后为模板，进行灵敏度实验。
（1）DNA模板稀释处理：将实施例2中157.67ng/ul猪肉来源DNA模板原液、141.46ng/ul牛肉来源DNA模板原液以及 206.52ng/ul羊肉来源DNA模板原液，分别稀释10倍、102倍、 103倍、104倍和105倍。
（2）分别采用实施例1的3对引物，以不同稀释倍数DNA为模板，建立PCR检测体系。
（3）20 μL反应体系的配制：2×PCR Mix 10 ul，10 μmol/L正向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，10 μmol/L反向引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ 0.3μL，经稀释处理的DNA模板1 μL，，双蒸灭菌水8.4 μL。
（4）PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例2中的反应程序。
（5）琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程同实施例2中的电泳。
所得凝胶成像结果如图4至图6所示。目标DNA稀释104倍后，均仍可观察到微弱的特异性扩增，检测灵敏度达到皮克级。
根据上述实施例2和实施例3中所述的PCR反应体系，本发明所述的引物体系可以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，可用于畜禽肉中猪、牛、羊源性成分鉴定，尤其适用于牛、羊食品的真伪和掺假鉴别。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，再不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种畜禽肉中猪牛羊三种肉类源性成分PCR鉴定用引物体系，其特征在于：所述PCR鉴定用引物体系由下列引物对组成：
（1）对猪16S rRNA 基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
正向引物序列为：CTCAACAAATTCACCAACAT；
反向引物序列为：GTGCGAGGAGAAAGGC；
（2）对牛16S rRNA 基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
正向引物序列为：AAGGAATAACAACAATCTC；
反向引物序列为：AGTGATTTGACTTGTGGG；
（3）对羊16S rRNA 基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
正向引物序列为：CCAGCAATAACATTAGCC；
反向引物序列为：CTTTGAATCTTTCCTGGGT。
2.一种利用权利要求1所述的PCR鉴定用引物体系进行畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：提取待测物种总DNA；将提取的待测物种总DNA样品溶于100ul洗脱液TE中，于-20℃保存备用；以待测物种样品总DNA为模板，利用权利要求1所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ分别进行PCR扩增实验，反应完毕后将PCR产物取出，利用1.5%的低溶点琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；所述琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别扩增出的DNA片段大小，其中
当引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为126bp，判定待测物种为猪物种；126bp扩增片段为：
CTCAACAAAT TCACCAACAT AATCCCAAAA ACTAATAACA AACTCCTAGC CCAATACCGG 60
ACTAATCTAT TGAAACATAG AAGCAATAAT GTTAATATGA GTAACAAGAA GCCTTTCTCC 120
TCGCAC 126；
当引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为108bp，判定待测物种为牛物种；108bp扩增片段为：
AAGGAATAAC AACAATCTCC ATGAGTTGGT AGTTTCGGTT GGGGTGACCT CGGAGAATAA 60
AAAATCCTCC GAGCGATTTT AAAGACTAGA CCCACAAGTC AAATCACT 108；
当引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为229bp，判定待测物种为羊物种；229bp扩增片段为：
CCAGCAATAA CATTAGCCAA CTCCTAGATT TAATACTGGA CTATTCTATT ACTAAATAGA 60
AGAATAATGT TAATATGAGT AACAAGAAAT ATTTTCTCCT CGCACAAGTT TAAGTCAGTA 120
ACTGATAATA CCCTGACCGT TAACAGTAAA TAAAAATAAC CCAACAATAA ATGATTTATT 180
ACTTATACTG TTAACCCAAC ACAGGAGTGC ACCCAGGAAA GATTCAAAG 229。
3.根据权利要求2所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验的PCR反应体系为：2×PCR Mix10 ul，10 μmol/L所述引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ的正向引物0.3 μL，10 μmol/L所述引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ的反向引物0.3 μL，每个物种DNA模板1 μL，双蒸灭菌水8.4 μL。
4.根据权利要求2或3所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验的PCR反应程序为：先进行95℃ 预变性5 min；然后95℃变性 30 s，60℃退火30s，72℃延伸 60 s，进行30个循环;最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2或3所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述提取待测物种总DNA的方法是：使用离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒进行提取。
6.一种畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ。
7.如权利要求6所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于单物种总DNA模板或多物种总DNA模板进行畜禽肉中猪、牛、羊源性鉴定。
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