CN107475433A

CN107475433A - 一种混合动物种属鉴定方法及引物

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Publication number: CN107475433A
Application number: CN201710928435.6A
Authority: CN
Inventors: 张颖; 杨雪莹; 郝金萍; 崔文涛; 张忠祥; 畅晶晶; 高珊; 张瑾; 刘开会
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2017-10-09
Filing date: 2017-10-09
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-10-09
Also published as: CN107475433B

Abstract

本发明公开了一种混合动物种属鉴定方法及引物。本发明所提供的用于混合动物种属鉴定的引物对，为如下a)或b)：a)序列1和序列2所示的引物对；b)将序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的引物对。本发明所提供的引物对可以对于常见家养动物(猪、牛、羊、鸡、鸭、犬)和人的样本进行有效区分。本发明对混合动物检材的种属鉴定具有重要意义。

Description

一种混合动物种属鉴定方法及引物

技术领域

本发明属于动物种属鉴定领域，涉及一种混合动物种属鉴定方法及引物。

背景技术

动物是自然界的重要组成部分，对动物进行保护已经深入到绝大多数人的心中，然而随着全球经济的发展，人类涉及到动物的经济活动也越来越多，非法利用动物及其产制品的经济活动也越来越猖獗，为了规范管理涉及动物的经济活动，打击违法犯罪行为，在规范管理和执法的过程中，必然要对涉及的动物进行种属鉴定。

目前遇到的对动物进行种属鉴定的情况主要分两种：单一动物种属来源鉴定和混合动物种属来源鉴定。其中单一动物种属来源鉴定的技术方法比较成熟，已经应用于我国食品安全、检验检疫等部门，但是针对混合动物种属来源的鉴定技术还仅仅停留在研究阶段，且普遍较复杂，往往需要进行多次复合扩增，所需实验操作时间长，结果分析较复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种混合动物种属鉴定方法及引物。

本发明所提供的用于混合动物种属鉴定的引物对，具体为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条引物组成的引物对；

(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。

为了便于扩增片段大小的检测，可将所述引物对中的一条引物的5’端标记上荧光基团。

其中，所述荧光基团可为FAM、HEX、ROX、TAMRA等。在本发明中，所述荧光基团具体为FAM。

本发明还提供了一种用于混合动物种属鉴定的PCR试剂盒。

本发明所提供的用于混合动物种属鉴定的PCR试剂盒，除了含有前文所述的引物对外，还可含有DNA聚合酶、dNTPs、PCR扩增缓冲液等PCR常规反应试剂。

所述引物对或所述试剂盒在混合动物种属鉴定中的应用也属于本发明的保护范围。

其中，所述混合动物种属鉴定中涉及到的动物可为常见家养动物和人；所述常见家养动物可为猪、牛、羊、鸡、鸭和犬。

本发明所提供的对混合动物样本进行种属鉴定的方法，具体可包括如下步骤：

(a)从待测混合动物样本中提取总DNA作为模板，采用前文所述的引物对(经荧光标记)进行PCR扩增，得到PCR产物；

(b)将所述PCR产物进行毛细管电泳，检测所述PCR产物中扩增片段的大小，然后根据检测结果按照如下确定所述待测混合动物样本来自于哪些动物：

如果所述PCR产物中有大小为237.0bp至237.5bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“猪”的样本；

如果所述PCR产物中有大小为231.5bp至232.0bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“牛”的样本；

如果所述PCR产物中有大小为232.5bp至233.5bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“羊”的样本；

如果所述PCR产物中有大小为241.0bp至241.5bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“鸡”的样本；

如果所述PCR产物中有大小为244.5bp至245.0bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“鸭”的样本；

如果所述PCR产物中有大小为240.0bp至240.5bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“犬”的样本；

如果所述PCR产物中有大小为230.0bp至231.0bp的扩增片段，则所述待测混合动物样本中有或候选有来自于“人”的样本。

其中，所述待测混合动物样本中需有来自于常见家养动物和/或人的样本；所述常见家养动物为猪、牛、羊、鸡、鸭、犬。进一步，如所述待测混合动物样本中的全部样本选自如上所述的常见家养动物和人。

所述待测混合动物样本可为血液、唾液、肌肉和/或毛发等。

在所述方法中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度为57℃。更进一步，具体的反应程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃40s，25个循环；72℃15min。

在所述方法中，进行所述PCR扩增时所述引物对中的上下游引物在反应体系中的终浓度均为0.5μM。

本发明主要应用于公共安全领域涉及多种动物混合样本的检测，比如制假贩假中羊肉掺鸭肉的现象，也可以用于刑事或民事案件中现场遗留混合斑迹的鉴定。具有如下优点：

1、使用一对引物(序列1和序列2)一次性扩增可以检测6种常见家养动物(猪、牛、羊、鸡、鸭、犬)和人的样本。对于混合动物种属鉴定国内外均有研究报道，但是有的用了多对引物复合扩增，有的要进行多次扩增，且每个物种的产物片段不止一条，为后期分析判断带来困难。

2、本发明中混合动物检材的鉴定，每种动物的扩增片段均为一条，且大小各不相同。

3、实验过程简单、快捷，在目前国内DNA实验室均可实现。

本发明对混合动物检材的种属鉴定具有重要意义。

附图说明

图1为常见家养动物和人的PCR扩增产物的片段大小检测图谱。

图2为常见家养动物和人的混合样本的部分PCR扩增产物的片段大小检测图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

DNA提取试剂盒：

1、德国QIAGEN公司MagAttract@M48 DNA Manual Kit(200)，货号：151045368。

2、德国QIAGEN公司DNeasy@Blood&Tissue Kit(250)，货号：151039903。

PCR扩增试剂：美国Promega公司的PCR Master Mix，货号：0000174742。

实施例1、用于混合动物种属鉴定的通用引物对的设计与合成

本实施例通过比较不同常见家养动物(猪、牛、羊、鸡、鸭、犬)和人的线粒体DNA序列发现了一段具有长度多态性的序列，且其两端的序列相对保守，可以设计通用引物对混合动物样本的种属进行鉴定。该段序列起始于动物线粒体DNA16srRNA的3’末端，扩增序列长度在240bp左右，其上下游各有约20bp的保守区可用来设计引物。

设计并合成如下简并引物：

P16-F：5’-TGA TCT GAG TTC AGA CCG GAG-3’(序列1)；

P16-R：5’-GRAGAGGADTTGAAYCTCTG-3’(序列2)。

其中，R为A或G，D为A、G或T；Y为T或C。

为了检测方便，在上游引物5’端修饰FAM荧光基团。

实施例2、混合动物种属鉴定方法的建立及应用实例

一、对各种常见家养动物和人的样本的单独检测

分别以常见家养动物(猪、牛、羊、鸡、鸭、犬)和人的血液、唾液、肌肉或毛发等作为待测样本，验证实施例1所设计合成的P16引物对的可行性。

从各待测样本中分别提取总DNA作为模板，以实施例1所设计合成的P16引物对(即实施例1中的P16-F和P16-R)进行PCR扩增，以promega公司的PCR mastermix作为扩增试剂，基于该试剂说明书推荐的体系及扩增条件，经过多次摸索和调整形成扩增参数如表1和表2所示。

表1PCR反应体系

DNA模板	1μl
		上下游引物(各10μM)	0.5μl
2×MasterMix	5μl
		去离子水	3μl
总体积	10μl

表2PCR扩增条件

反应结束后，将各扩增产物分别进行毛细管电泳检测扩增片段的大小。具体操作步骤请参见ABI公司3500xL遗传分析仪操作手册。

上述实验均平行扩增和重复扩增数次，根据数次扩增的图谱(图1)可以看出，利用P16引物对猪、牛、羊、鸡、鸭、犬和人的DNA扩增，产物片段大小各物种均不相同(具体如表3所示)。因此，依据扩增片段大小的不同，完全可以利用P16引物实现一次性对猪、牛、羊、鸡、鸭、犬和人的混合样本DNA的有效鉴定。

表3利用P16引物对常见家养动物和人的DNA扩增产物片段大小

物种	扩增片段大小(bp)
		猪	237.0-237.5
牛	231.5-232.0
		羊	232.5-233.5
鸡	241.0-241.5
		鸭	244.5-245.0
犬	240.0-240.5
		人	230.0-231.0

另外，研究期间本发明的发明人曾对上述动物同科或同属的野生动物采用同样的方法进行验证，发现扩增序列与上述动物不同，因此，本方法仅适用于常见家养动物。

二、对常见家养动物和人的混合样本的检测

鉴于实际案例中的常见情况，本发明的发明人将猪、牛、羊、鸡、鸭、犬和人的DNA分别混匀制成不同组合的混合样本，并采用实施例1所设计合成的P16引物对上述混合样本进行扩增检测。具体如下：

1、将猪、牛、羊、鸡、鸭、犬的DNA分别与人的DNA进行混合(混合物中各样本的浓度相同)，并用P16引物对其进行扩增检测。

2、将猪、牛、羊的DNA混合(混合物中各样本的浓度相同)，并用P16引物对其进行扩增检测。

3、将猪、牛、羊、鸡、鸭的DNA混合(混合物中各样本的浓度相同)，并用P16引物对其进行扩增检测。

结果显示：扩增产物中检测到了表3中所示的各种常见家养动物和人所对应大小的扩增片段(图2)。可见：本发明所设计的P16引物对确实可以实现对常见家养动物(猪、牛、羊、鸡、鸭、犬)和人的混合种属鉴定。

对比例：

本发明的发明人在研究期间，曾根据线粒体DNA16srRNA设计过另外两对引物：

1F：5’-GTDGGCYTWAAAGCAGCCAYC-3’；

1R：5’-TKTTTGCCGAGTTCCTTTYAC-3’。

2F：5’-GDTGGCYTWAAAGCAGCCAYC-3’；

2R：5’-TGTTTTTGGTAAACAGKCGGG-3’。

其中，D为A、G或T；Y为T或C；W为A或T；K为G或T。

但是，采用同实施例1相同的方法，上述2对引物在不同物种的扩增片段长度不能完全区分，比如第1对引物扩增片段牛和羊大小相同，第2对引物扩增片段羊和犬大小相同。

<110> 公安部物证鉴定中心

<120> 一种混合动物种属鉴定方法及引物

<130> GNCLN171737

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

tgatctgagt tcagaccgga g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> r为a或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> d为a或g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> y为t或c

<400> 2

gragaggadt tgaayctctg 20

Claims

1.用于混合动物种属鉴定的引物对，为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条引物组成的引物对；

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对中一条引物的5’端标记有荧光基团。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述荧光基团为FAM。

4.用于混合动物种属鉴定的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒除了含有权利要求1-3中任一所述的引物对外，还含有DNA聚合酶、dNTPs、PCR扩增缓冲液。

5.权利要求1-3中任一所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在混合动物种属鉴定中的应用。

6.根据权利要求1-5中任一所述的引物对或试剂盒或应用，其特征在于：所述混合动物种属鉴定中涉及到的动物为常见家养动物和人；所述常见家养动物为猪、牛、羊、鸡、鸭和犬。

7.一种对混合动物样本进行种属鉴定的方法，包括如下步骤：

(a)从待测混合动物样本中提取总DNA作为模板，采用权利要求2或3所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述待测混合动物样本中有来自于常见家养动物和/或人的样本；所述常见家养动物为猪、牛、羊、鸡、鸭、犬。