CN107988395B

CN107988395B - 用于区分牦牛与黄牛的引物对、引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN107988395B
Application number: CN201711470010.1A
Authority: CN
Inventors: 陈爱亮; 赵杰; 杨曙明; 李婷婷
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Xinyi Manufacturing Technology Hebei Co ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107988395A

Abstract

本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于区分牦牛与黄牛的引物对、引物组、试剂盒及方法。本发明能引物能够扩增一条牦牛与黄牛的150bp的差异片段，本发明的鉴定方法包括样本基因组DNA提取，PCR扩增及样本鉴定的主要步骤。本发明的鉴定方法具有快速、简单、经济、准确的特点，能在新鲜肉类和商品化肉干、或骨粉制品样本大规模检测中应用。该方法的建立在牦牛食品检验检疫、防止商业欺诈、建立食品回溯追查系统几方面都具有重要意义。

Description

用于区分牦牛与黄牛的引物对、引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种用于区分牦牛与黄牛的引物对、引物组、试剂盒及方法。

背景技术

近年，牦牛肉以高蛋白、低脂肪、无污染等特点日益受到广大消费者的青睐。由于其价格与其他普通牛肉相比存在较大差异，因此在肉类市场经常出现被其他低价格的黄牛肉冒充的现象。不仅扰乱了正常的市场秩序，侵犯了消费者权益，而且还会对牦牛产业的健康发展造成影响。因此急需需要开发一种行之有效的方法对市场上的牛肉来源进行鉴别。灵敏度高的DNA分子检测技术进行可以对不同品种来源的牛肉进行真假鉴别，该方法操作方便简单，可以高效准确地进行牦牛肉和本地黄牛肉的真实性鉴定，保护消费者及生产者切身利益。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简单、经济、准确的鉴别牦牛与黄牛的方法，该方法可用于区分牦牛与黄牛肉制品及骨制品等，以防止商业欺诈。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种用于区分牦牛与黄牛的引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

该引物对在PCR扩增过程中不会形成引物二聚体和非特异扩增，避免非目的产物的出现对鉴定结果的影响，同时扩增效率高，检测信号强。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于区分牦牛与黄牛的引物组，其包括如上所述的引物对以及阳性对照引物对；所述阳性对照引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3和4所示。

阳性对照引物对在扩增牦牛与黄牛样品时都能扩增出条带；如果扩增不出条带，表面模板DNA质量不好，应重新抽提DNA再进行PCR扩增。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于区分牦牛与黄牛的试剂盒，其含有如上所述的引物组，还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种区分牦牛与黄牛的方法，包括：

提取检测牦牛和/或黄牛样本的基因组DNA，使用如上所述的引物组、或如上所述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增并电泳检测；

若扩增产物中同时出现212bp和150bp条带，则为黄牛；若扩增产物中仅出现212bp条带，则为牦牛。

该方法能准确地使用微量的新鲜组织和商品化肉干、或牦牛骨粉产品中成功鉴别黄牛和牦牛，适合于在大规模样本检测中推广应用。在牦牛食品检验检疫、防止商业欺诈、建立食品回溯追查系统方面具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中典型的牦牛样本和黄牛样本的电泳图。

具体实施方式

优选的，如上所述的试剂盒，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段；

更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。

优选的，如上所述的试剂盒，所述水选自双蒸水或去离子水。

优选的，如上所述的方法，在进行所述PCR扩增时，退火温度为58℃-62℃；

更优选的，退火温度为60℃。

通常PCR扩增时的退火温度为40℃～60℃。退火温度是由引物的Tm值来决定的，在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。本发明所采用的引物退火温度为60℃，具有较高的特异性。

更优选的，如上所述的方法，在进行所述PCR扩增时，PCR反应程序为：

⑤将②③④重复30～40个循环；

⑥71℃-73℃ 5～9min；

随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTPs等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本发明限定为30～40个循环。

⑤将②③④重复35个循环；

⑥72℃ 5～9min。

优选的，如上所述的方法，所述基因组DNA通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

优选的，如上所述的方法，在进行所述PCR扩增时，在PCR扩增体系中，各引物的浓度均为4-6μM；

优选的，各引物的浓度均为5μM。

优选的，如上所述的方法，所述电泳检测的条件为：

用1.5％-2.5％琼脂糖电泳检测扩增产物，电压110V-130V，电泳时间20min-30min；

更优选的，所述电泳检测的条件为：

用2％琼脂糖电泳检测扩增产物，电压120V，电泳时间25min.

优选的，如上所述的方法，所述牦牛和/或黄牛样本为牦牛和/或黄牛的组织、细胞、血液、唾液、精液、骨骼或毛发；更优选的，所述组织为肌肉组织。

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

1、样本采集及基因组DNA提取

采集牦牛肉样56个，本地黄牛肉样53个，包括郏县红牛肉样16个、南阳黄牛肉样15个、鲁西黄牛肉样22个，共计109个牛肉样品。分别提取基因组DNA。DNA提取采用Thermo#k0512 DNA提取试剂盒提取。具体步骤如下：

(1)取30mg组织样品，置于1.5ml离心管中，加入200μl TE。200μl组织样品中加入400μl溶胞液(lysis solution)，65℃孵化5min。(冻存样品：解冻前加入400μl lysissolution，倒置，65℃孵化10min。)

(2)立刻加入600μl氯仿，倒转3-5次使乳化，10000rpm离心2min。

(3)配制沉淀试剂：720μl ddH₂O+80μl(10×)Precipilation Solution。

(4)转移含DNA的上层水相至新EP管中，加800μl新配的沉淀试剂，室温下来回倒置混合1-2min，10000rpm离心2min。

(5)彻底除去上清(勿干燥)，并用100μl NaCl涡旋，溶解DNA沉淀(需完全溶解)。

(6)加300μl冷乙醇(-20℃)，让DNA沉淀(-20℃沉淀20min)，10000rpm离心4min，弃去乙醇。70％冷乙醇清洗沉淀一次，最后用100μl ddH₂O溶解DNA。

(7)用Nanodrop 2000c测DNA浓度，0.8％琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段完整性，合格样本-20℃保存备用，不合格样本重新提取基因组DNA。

2、引物序列设计合成

设计合成如下两对引物对，具体见表1。

表1引物序列

3、多重PCR扩增

将表1中的2对引物，分别对109个模板进行扩增。PCR扩增体系见表2，PCR扩增程序见表3。

表2 PCR扩增体系

表3 PCR反应程序

4、2.0％琼脂糖电泳检测

取2μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，稳压120V，电泳时间25min。凝胶成像系统拍照。

5、结果分析

阳性对照引物对样本DNA质量进行质控，在黄牛群体和牦牛群体中均能扩增出212bp的条带，而牛特异引物在牦牛群体里扩增不产生条带，而在黄牛品种中可以产生150bp左右的条带，据此可以将牦牛样本与黄牛品种进行很好的区分。图1是典型的牦牛样本和黄牛样本的电泳图。可见，仅通过一次PCR即可将牦牛肉与黄牛肉进行区分，区分效果较好，同时操作简便，成本低，适于推广使用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 用于区分牦牛与黄牛的引物对、引物组、试剂盒及方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaggatcac ttgttaggga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agacgttagt gtacattaac 20

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acttcgagca ggagatggcc accgcggcc 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttcgtgaat gccgcaggat tccatgcctg g 31

Claims

1.一种用于区分牦牛与黄牛的引物组，其由核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和2所示的引物对以及阳性对照引物对组成；所述阳性对照引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。

2.一种用于区分牦牛与黄牛的试剂盒，其含有权利要求1所述的引物组，还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水、上样缓冲液和DNA分子量内标中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq DNA 聚合酶。

5.一种区分牦牛与黄牛的方法，其特征在于，包括：

提取检测牦牛和黄牛样本的基因组DNA，使用权利要求1所述的引物组、或权利要求2-4任一项所述的试剂盒对所述基因组DNA进行PCR扩增并电泳检测；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述PCR扩增时，退火温度为58℃-62℃。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述PCR扩增时，退火温度为60℃。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行所述PCR扩增时，在PCR扩增体系中，各引物的浓度均为4-6μM。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电泳检测的条件为：

用1.5％-2.5％琼脂糖电泳检测扩增产物，电压110V-130V，电泳时间20min-30min。

11.根据权利要求5-10任一项所述的方法，其特征在于，所述牦牛和黄牛样本为牦牛和黄牛的组织、细胞、血液、唾液、精液、骨骼或毛发。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述组织为肌肉组织。