CN105969839B - 同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒 - Google Patents

同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman‑LNA多重荧光定量PCR的方法。本发明利用序列相对较短但Tm较高的LNA探针序列，可在确保特异性的前提下，有效提高体系的稳定性，建立了一套多重荧光定量PCR检测体系，该体系能够同时检测牛、猪源性成分，可检测肉或肉制品中DNA含量低至0.05ng的牛源性成分和0.05ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%的对应动物成分。本发明的方法具有通量高、特异性强、灵敏度高、应用性好等优点，能较好应用于肉及肉制品中牛、猪源性成分的检测。

Description

同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光 定量PCR方法及引物探针以及试剂盒
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测肉或肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法和引物探针组。
背景技术
肉或肉制品的掺假一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法商家为了个人利益，以低价肉制品假冒高价肉制品，或在高价肉制品中掺入低价肉，这严重损害了消费者的权益。目前，打击肉制品掺假已成为监管部门关注的重点，而肉或肉制品的成分检测技术是监管的基础。
目前，动物源性成分的检测技术以检测DNA为基础的分子生物学方法应用最为广泛，尤其是PCR技术以稳定、准确、快速等优势收到关注。其中，荧光定量PCR法在特异性、灵敏度、重现性等方面具有巨大的优势，成为该领域的主要技术之一。Taqman荧光PCR技术虽然克服了普通PCR的上述缺点，但在探针设计时，需要通过较长的探针序列来获得较高的Tm值，在特异性目标基因序列较短的情况下，常常会因此难以找到理想的探针序列，无法获得高效、特异的扩增效果，在检测中不时发现这些方法存在一定的假阳性或假阴性结果。
Taqman-LNA荧光探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，通过提高探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种同时检测肉或肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的特异性引物探针组。
本发明的另一个目的在于提供一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法；
本发明的另一个目的在于提供一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的试剂盒；
本发明的目的通过下述技术方案实现：
同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的引物探针组，包括牛源性成分特异性引物和探针，猪源性成分特异性引物和探针，其核苷酸序列如表1所示：
表1：Taqman-LNA多重荧光定量PCR的引物探针组
Figure 919445DEST_PATH_IMAGE002
注：探针中的“C”为LNA修饰碱基，FAM和ROX为荧光基团，BHQ1和BHQ2为猝灭基团。
同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的检测试剂盒，包括表2成分：
表2：Taqman-LNA多重荧光定量PCR的试剂盒组成
Figure 571006DEST_PATH_IMAGE004
同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法，包括以下步骤：
（1）待检样品DNA的提取。将样品与水按照1:4的比例（M/V）进行匀浆，取制备的悬浊液50μL，采用试剂盒法提取DNA，但将DNA的定容体积改为100μL。试剂盒可选用WizardGenomic DNA purification kit （Promega，A1120）、核酸提取试剂盒（达安基因，DA-Z146）、动物组织基因组DNA提取试剂盒（迪奥生物，T004）等DNA 提取试剂盒。
（2）多重荧光定量PCR。反应体系见表3，荧光定量PCR反应条件为：95°C 30 s；95°C5 s，59°C 25 s，35个循环，在每个循环的59°C阶段结束后收集FAM和ROX的荧光信号。
表3：多重荧光定量PCR的反应体系
Figure 944219DEST_PATH_IMAGE006
（3）结果判断：根据FAM和ROX两个通道下的循环阈值（Ct值）进行判断，其中FAM通道下是牛源性成分的检测，ROX通道下是猪源性成分的检测。若阳性对照Ct 值≤18，阴性对照无Ct 值或Ct≥30，则试验有效；当样品Ct值≤25时判为阳性，即样品中含有牛源性成分（FAM通道）和/或猪源性成分（ROX通道）；当样品Ct值≥30或无Ct 值时判为阴性，即样品中不含有牛源性成分（FAM通道）和/或猪源性成分（ROX通道）；当25＜样本Ct值＜30时须复检，复检结果与原结果一致的判为弱阳性，提示样品中含有微量（被污染）的牛源性成分（FAM通道）和/或猪源性成分（ROX通道）。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）通量高。本发明可通过一次实验同时检测牛、猪源性成分。
（2）特异性强。本发明通过运用牛、猪、鸡、鸭、鹅、山羊、绵羊、驴、马、鹿等动物源性成分样品进行实验，证明本发明的高特异性。
（3）灵敏度高。本发明可检测肉或肉制品中DNA含量为0.05ng的牛源性成分和0.05ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%对应动物成分。
（4）应用性好。本发明考虑初始模板量及该引物探针组的扩增效率，引入弱阳性的界定方法，可指示样本有无遭受微量被检动物成分的污染。
附图说明
图1是Taqman-LNA多重荧光定量PCR同时检测牛、猪源性成分。
图2是本发明特异性测试。
图3是本发明灵敏度测试。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1
（1）DNA的提取
称取相同重量的纯牛肉和纯猪肉样本，再与水按照1:4的比例（M/V）进行匀浆，取制备的悬浊液50μL，采用试剂盒法（Wizard Genomic DNA purification kit，A1120，Promega）提取基因组DNA，最终DNA的定容体积为100μL。
（2）Taqman-LNA多重荧光定量PCR
反应体系见表3，荧光定量PCR反应条件为：95°C 30 s；95°C 5 s，59°C 25 s，35个循环，在每个循环的59°C阶段结束后收集FAM和ROX的荧光信号。
（3）结果：FAM通道下Ct值为16.15，表明该样品中含有牛源性成分，ROX通道下Ct值为16.88，表明该样品中含有猪源性成分。
实施例2
用实施例1的方法分别对牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅血、山羊肉、绵羊肉、马肉、驴肉、鹿肉样品进行试验。
结果见表4，表明本发明具有很好的特异性，可明确区分所有的受试样本。
表4 多重荧光定量PCR特异性实验结果
Figure 808270DEST_PATH_IMAGE008
实施例3
称取相同重量的纯牛肉和纯猪肉样本，用实施例1方法提取DNA，按照10倍系列稀释，制备DNA含量分别为500ng、50ng、5ng、0.5ng、0.05ng和0.005ng（与肉类含量50%、5%、0.5%、0.05%、0.005%和0.0005%相当）的灵敏度测试样本，并按照实施例1进行试验。
结果见表5，可见本发明具有较高的灵敏度，可检测DNA低至0.05ng的牛源性成分和0.05ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%对应动物成分。
表5 多重荧光定量PCR灵敏度实验结果
Figure 216117DEST_PATH_IMAGE010
实施例4
采用本发明检测市售鲜禽畜肉及火腿肠、肉丸等加工产品30份，并与《SN/T 2051-2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法》进行比较。结果显示：二者检测情况完全一致，并发现5份阳性结果与商品的标识不符合，详见表6。
表6 多重荧光定量PCR应用检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE011
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000867013660000011
Figure IDA0000867013660000021

Claims (1)

1.同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法，包括以下步骤：
(1)待检样品DNA的提取：将样品与水按照M/V的比例为1:4进行匀浆，取制备的悬浊液50μL，采用试剂盒法提取DNA，但将DNA的定容体积改为100μL，试剂盒选用Wizard GenomicDNA purification kit、核酸提取试剂盒；
(2)多重荧光定量PCR，荧光定量PCR反应条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，59℃ 25s，35个循环，在每个循环的59℃阶段结束后收集FAM和ROX的荧光信号；其反应体系如下所示：
Figure FDA0002457694930000011
上述成分具体如下：
Figure FDA0002457694930000012
所述引物N-F的序列为：5'-ttgaattaggccatgaagca-3'；
所述引物N-R的序列为：5'-cgacttgtctcctctcatgtagc-3'；
所述探针T1的序列为：5’-FAM-cgcccgtcaCcctcctcaaata-BHQ1-3'；
所述引物Z-F的序列为：5’-aaccccgatagaccttaccaa-3'；
所述引物Z-R的序列为：5‘-tcctttttagggtttgctgaag-3'；
所述探针T2的序列为：5‘-Rox-tgccaattcagcctatataCCgcca-BHQ2-3'；
其中探针中的“C”为LNA修饰碱基，FAM和ROX为荧光基团，BHQ1和BHQ2为猝灭基团；
(3)结果判断：根据FAM和ROX两个通道下的循环阈值(Ct值)进行判断，其中FAM通道下是牛源性成分的检测，ROX通道下是猪源性成分的检测，若阳性对照Ct值≤18，阴性对照无Ct值或Ct≥30，则试验有效；当样品Ct值≤25时判为阳性，即样品中含有牛源性成分和/或猪源性成分；当样品Ct值≥30或无Ct值时判为阴性，即样品中不含有牛源性成分和/或猪源性成分；当25＜样本Ct值＜30时须复检，复检结果与原结果一致的判为弱阳性，提示样品中含有微量的牛源性成分和/或猪源性成分。
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