CN102994637A - 一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法。该方法包括一对牛特异性引物，上游引物为：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；下游引物为：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；及与其配合使用的探针5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’，以及包含所述引物和探针的试剂盒。本发明方法最大程度地降低了定量误差，具有较高的准确性和抗干扰能力，能够准确、便捷的检出牛肉及其制品中牛源性分占总肉成分的百分比含量。本发明提供了单重和双重两种PCR模式，分别适用于不同的需求。

Description

一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法

技术领域

本发明涉及食品检验和生物技术领域，具体地说，涉及一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法。

背景技术

食品"掺杂使假"一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法企业和商家为了降低成本，在肉制品加工过程中以猪肉冒充牛羊肉，或以其它低价肉替代高价肉而未在标签上注明。这不仅严重侵害了消费者利益，而且如果清真食品中掺有猪肉成分还会涉及到民族和宗教等问题，造成恶劣的社会影响。此外，流行病学研究证明饲料中的动物源性成分是造成“疯牛病”等神经系统疾病传播的主要因素。

目前，用于肉种成分鉴定的技术大多建立在对蛋白质结构与DNA序列特异性分析的基本上，包括酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应（PCR)、电泳、色谱、生物传感分析等技术。其中，Taqman实时荧光PCR（Taqman PCR）法在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，成为该领域的主流技术，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型，是现行国家和行业标准中指定的方法之一。

然而，现有的研究大多集中在对饲料中猪、牛、羊等动物源性成分的定性检测上，而用于食品掺假鉴别，特别是涉及有关核酸成分定量检测技术的研究较为滞后。单纯的定性检测已不能满足需求，如在肉、奶等食品“掺杂使假”案件的处理中，如何判定掺假成分是添加还是污染所致，如何确定掺假严重程度都需要有可靠的定量技术作为依托。生物样品的复杂性，如动物种别、年龄、性别、器官、肌肉类型差别等，导致DNA提取总量和扩增靶序列模板总量差异，给标准样品的选定和制备造成困难。因此急需系统误差小、可信度高的食品掺假行为判定方法的出现。

发明内容

本发明目的是提供一种牛特异性引物和探针，用于检测肉及肉制品中牛源性成分。

本发明再一目的是提供含有上述引物的试剂盒。

本发明又一目的是提供一种检测试样中牛源性成分含量的方法，用于量化判定待测牛肉产品中牛肉纯度，是否存在掺假行为和掺假情况的严重程度。

本发明所述牛特异性引物是根据牛线粒体DNA中NADH脱氢酶4亚基基因上牛特异性碱基序列设计而成，其核苷酸序列为：

上游引物为：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；

下游引物为：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；

并设计了与上述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为：

5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

优选地，F为FAM；M为TAMRA。

为实现本发明目的，本发明还提供一种脊椎动物通用引物和探针，其是根据脊椎动物线粒体DNA（16s rDNA）上的保守序列设计，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针为：

5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于单重PCR）

或5’-HEX-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于双重PCR）。

本发明进一步提供一种利用上述引物和探针通过单重PCR测定样品中牛肉成分占总肉成百分比含量的方法，具体包括以下步骤：

1）制备待测样品匀浆，提取DNA。

2）提取纯牛肉DNA，稀释至至少5个浓度梯度作为标准品，制作标准曲线，浓度跨度范围可根据实际需求调整，提取过程与1）同步，或事先制备好。

3）单重PCR，采用上述牛特异性引物和探针，通用引物和探针（F为FAM）对步骤1）和2）获得的DNA模板，在1个PCR板上的不同反应管同时进行PCR扩增，按照表1进行加样，PCR过程在1个通道收集荧光信号；然后按照公式1计算出待测样品中牛源性成分的百分含量。

表1单重PCR 96孔板加样方案

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	S1	S2	S3	S4	S5	Sample1	Sample2	Sample3	...	...	...	...
B	S1	S2	S3	S4	S5	Sample1	Sample2	Sample3	...	...	...	...
													C	S1	S2	S3	S4	S5	Sample1	Sample2	Sample3	...	...	...	...
D	S1	S2	S3	S4	S5	Sample1	Sample2	Sample3	...	...	...	...
													E	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...
F	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...

注：表中的方格代表96孔PCR板的反应管，S1-S5代表纯牛肉样DNA梯度浓度样品，用于绘制标准曲线，PCR板的剩余位置为试样DNA模板加样区域（如Sample1~3）。行A、B为表1中1类反应体系，行C、D为表1中2类反应管。标准样品和试样平行个数根据具体要求而定。1类反应体系为使用牛特异性引物和探针，2类反应体系为使用通用引物和探针。 $X(\%)=10^{\frac{C_{\mathrm{ts}}-C_1}{k_1}-\frac{C_{\mathrm{tu}}-C_2}{k_2}}\×100\%$ ——公式1

其中，X，试样中牛肉成分占总肉成分的百分比含量（w/w）；Cts，试样牛特异性引物体系PCR Ct值；Ctu，试样通用引物体系PCRCt值；C1，牛特异性标准曲线截距；C2，通用标准曲线截距；k1，牛特异性标准曲线斜率；k2，通用标准曲线斜率。其中，牛特异性标准曲线是将使用上述牛特异性引物和探针对步骤2）中的梯度浓度标准样品的PCR结果，以lg（纯牛肉DNA样品稀释度）为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标制作标准曲线；通用标准曲线是将使用上述通用引物和探针对步骤2）中的梯度浓度标准样品的PCR结果，以lg（纯牛肉DNA样品稀释度）为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标制作标准曲线。

前述的方法对生肉和熟肉产品均适用。

本发明还提供一种利用上述引物和探针通过双重PCR测定样品中牛肉成分占总肉成百分比含量的方法，具体包括以下步骤：

1）制备待测样品匀浆，提取DNA。

2）提取纯牛肉DNA，稀释至至少5个浓度梯度作为标准品，制作标准曲线，浓度跨度范围可根据实际需求调整，提取过程与1）同步，或事先制备好。

3）双重PCR，上述牛特异性引物和探针，通用引物和探针（F为HEX）对步骤1）和2）获得的DNA模板，分别在同一个反应管同时进行PCR扩增（按照表2进行加样），PCR过程在2个通道收集荧光信号；然后按照上述公式1计算出待测样品中牛源性成分的百分含量。

表2双重PCR 96孔板加样方案

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	S1	S2	S3	S4	S5	Sample1	Sample2	Sample3	...	...	...	...
B	S1	S2	S3	S4	S5	Sample1	Sample2	Sample3	...	...	...	...
													C	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...
D	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...	...

注：表中的方格代表96孔PCR板的反应管，S1-S5代表纯牛肉DNA浓度梯度样品；PCR板的剩余位置为试样DNA模板加样区域（如Sample1~3）。所有反应孔均使用同一种反应体系（加样前将特异性和通用性引物体系按照表4中比例预混）。

进一步地，本发明目的采用以下的技术措施来实现，具体步骤包括：

1、引物、探针序列：通过大量生物信息学比对、分析、试验筛选工作，本发明确定了脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，

上游引物：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针：5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于单重PCR）；

探针：5’-HEX-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于双重PCR）；

牛特异性寡核苷酸引物和探针，

上游引物为：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；

下游引物为：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；

探针为：5’-FAM-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC–TAMRA-3’。

2、样品处理方法：

称取3～50g肉样至均浆杯中（根据样品量选择合适的匀浆杯），按照1：3.2～5.2的重量比加入去离子双蒸水，8000～12000r/min搅拌8～15分钟，用1000μl微量移液器吸取3～5毫升离心管中，用漩涡振荡器震荡1～3min，用100μl微量移液器吸取50～100μl匀浆液至1.5ml离心管中（建议取3个平行），待后续处理。

3、DNA提取方法

在取完样品的1.5ml离心管中，加入600～900μL裂解液，65℃孵育25～50min，期间不时振荡混匀。11000～13000g离心5～10min，转移600～900μL上清液于洁净离心管中，加入400～600μL CTAB蛋白沉淀液，振荡混匀后，11000～13000g离心5～10min，取300～500μL上清液于洁净离心管中，加200～400μL异丙醇，室温下沉淀1-2h。11000～13000g离心5min，弃掉上清液，然后用400～600μL 70%乙醇洗涤一次（11000～13000g离心5min），弃掉上清液，晾干，加人50～200μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。

4、实时荧光PCR反应

1）实时荧光PCR反应体系（总体积为10μl，可根据使用仪器的需要该比例调整反应体系各组分的量），见表3、4。

表3单重实时荧光PCR反应体系组分及配比（总体积10μl）

注：一个PCR反应管中只含有一套引物、探针，反应体系包含5种试剂组分

表4双重实时荧光PCR反应体系组分及配比（总体积10μl）

注：两套反应体系在同一PCR反应管中进行，每套体系包含5种试剂组分

2）实时荧光PCR反应参数

预变性：95℃30秒；

变性：95℃10～15秒；

退火+延伸：58～62℃45～60秒，35个循环；

降温：40℃60秒。

3）标准样品

标准样品：按照上述样品处理方法和DNA提取步骤，提取3～50g（根据待测样品量而定）纯牛肉的总DNA，用灭菌双蒸水稀释成至少5个浓度梯度（浓度差异根据需求而定），用于制作标准曲线。

5、样品检测

（1）标准曲线设置方法

1）单重PCR

分别使用表3中的2套反应体系按照表1的加样方案，对梯度浓度标准DNA样品进行PCR扩增，在单一波长下收集、记录荧光信号，分别用lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（C_{t牛特异性引物}）和lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（C_{t通用引物}）做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k₁、k₂截距为C₁和C₂。

2）双重PCR

使用表4中的反应体系按照表2的加样方案对梯度浓度标准DNA样品，在两个波长下收集、记录荧光信号，分别用lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（C_{t牛特异性引物}）和lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（C_{t通用引物}）做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k₁、k₂截距为C₁和C₂。

（2）试样PCR

1）单重PCR

将试样按前述方法处理和提取DNA模板，分别使用表1中的2套反应体系按照表3的加样方案对其进行PCR扩增，在单一波长下收集、记录荧光信号，获得C_t值。

2）双重PCR

将试样按前述方法处理和提取DNA模板，使用表2中的反应体系按照表4的加样方案对试样DNA对其进行PCR扩增，在两个波长下收集、记录荧光信号，获得C_t值。

6、结果计算

按照公式1计算试样中牛源性成分占总肉成分的百分比含量，根据计算结果判定试样的掺假情况。牛源性成分百分含量越低，则掺假情况越严重，越高则存在掺假的可能性越小。

7、定性判断

如果不设立标准曲线即可作为定性方法来判定式样中是否含有牛源性成分，并可根据两组引物扩增结果C_t值的差值大致判断其含量多少。

本发明进一步提供含有上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针以及上述牛特异性寡核苷酸引物和探针的检测试剂盒。所述试剂盒包括上述牛特异性寡核苷酸引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、纯牛肉DNA标准品。

本发明还提供上述试剂盒在测定试样中牛源性成分占总肉源成分百分比含量中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明的牛特异性引物对、探针体系和脊椎动物通用引物对和探针体系具有相似属性，Tm值、扩增片段长度、扩增效率都极为接近，最大程度地降低了定量误差，具有较高的准确性和抗干扰能力。

（2）本发明提供了单重和双重两种PCR方法，分别适用于不同的需求。

（3）本发明是基于牛特异性引物与脊椎动物通用引物同一反应体系下C_t值的相关关系确定肉制品中牛肉成分的百分比含量的，受外部条件（PCR仪品牌和型号、试剂、操作等）影响较小，具有较高的稳定性和可信度。

（4）本发明的实时荧光PCR法采用完全封闭管检测，无须PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。

（5）本发明提供的样品处理方法能够获得高度均一的匀浆体系，具有很好的稳定性和重复性。常规检测中肉样一般采取搅拌的方法（搅拌过程中不加水），由于提取DNA所需量很小，给后续精确称量带来了困难，也严重限制了处理速度。本方法通过加入去离子双蒸水、匀浆将样品制作成均匀度极高的悬浊液，后续加样过程可通过微量移液器来完成，大大提高了操作便捷性和效率。

（6）本发明提供的方法可移植性较好，可通过更换特异性引物，测定混合肉制品中猪、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗或鱼等特定肉类成分含量。

附图说明

图1中图1a为本发明牛特异性引物体系多物种PCR扩增曲线，图1b为通用引物扩增曲线结果，其中，1代表鲁西黄牛牛肉DNA提取物，2代表西门塔尔牛牛肉DNA提取物，3代表安格斯牛牛肉DNA提取物，4代表夏洛莱牛牛肉DNA提取物，5-13分别代表猪、羊、鸡、鸭、兔、驴、鹿、狗、驴肉DNA提取物，14代表阴性对照。

图2为纯牛肉DNA提取物系列10倍比稀释样品单重PCR线性关系图。

图3为含有系列浓度牛肉的混合肉样DNA提取物单重PCR线性关系图。

图4为纯牛肉DNA提取物系列10倍比稀释样品双重PCR线性关系图。

图5含有系列浓度牛肉的混合肉样DNA提取物双重PCR线性关系图。

图6含有系列浓度牛肉的混合肉样DNA提取物单重PCR牛特异性引物和通用引物扩增曲线图，图6a-6f分别为牛肉含量0.1%、1.9%、10%、30%、60%、98%的混合肉样DNA提取物单重PCR牛特异性引物和通用引物扩增曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

主要仪器设备：荧光定量PCR仪（Roche480II，瑞士）、高速台式离心机（Eppendorf 5417R，德国）、微量移液器（10μl、100μl、1000μl）、均质机（ACE，日本）、紫外-可见分光光度计（UNIC 2800A，上海）。

主要试剂：氯仿、异丙醇、EDTA、Tris购于国药集团，TE缓冲液(Tris-HCl,EDTA缓冲液):10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/LEDTA(pH 8.0，1%CTAB裂解液（0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.7mol/LNaCl，0.01mol/L EDTA（pH 8.0））、CTAB沉淀液（三氯甲烷+异戊醇（24：1））均为实验室常用试剂；Premix Ex Taq^TM预混液购于宝生物工程（大连）有限公司；引物及探针由生工生物工程（上海）有限公司合成等。

实施例1本发明牛特异性引物、探针体系的特异性

1、引物、探针序列

牛特异性寡核苷酸引物和探针，

上游引物：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

探针：5’-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3’。

2、样品处理方法

分别称取0.2g猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗、鱼13种常见肉种样品至1.5ml离心管。

3、DNA提取方法

在步骤2取完样品的1.5ml离心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期间不时振荡混匀。12000g离心5min，转移600μL上清液于洁净离心管中，加入400μL CTAB蛋白沉降液，振荡混匀后，12000g离心5min，取400μL上清液于洁净离心管中，加320μL异丙醇，室温下沉淀1h。12000g离心5min，弃掉上清液，然后用500μL 70%乙醇洗涤一次（12000g离心5min），弃掉上清液，晾干，加入50μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。将各DNA提取样品稀释至10ng/μl，进行后续试验。

4、实时荧光PCR反应

1）实时荧光PCR反应体系（总体积为10μl），见表5。

表5PCR反应体系

2）实时荧光PCR反应条件

预变性：95℃30秒；

变性：95℃10秒；

退火+延伸：60℃45秒，35个循环；

降温：40℃60秒。

牛特异性引物体系的实时荧光PCR的扩增结果如图1所示，各反应体系含有模板DNA 20ng。

结果显示，本发明提供牛的特异性引物、探针对受试4种牛肉DNA（见图1a）提取物都可增出牛肉成分，而对其它肉种成分在35个循环内无典型扩增曲线出现；脊椎动物通用引物体系对13种肉品DNA提取物均有典型扩增曲线出现，且扩增曲线属性极为接近，C_t值分布在较窄的区间内，（见图1b）为牛肉成分定量检测提供了良好的基础。

实施例2本发明检测方法体系的线性关系

1、引物、探针序列

牛特异性寡核苷酸引物和探针，

上游引物为：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；

下游引物为：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；

探针为：5’-FAM-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC–TAMRA-3’。

脊椎动物通用性寡核苷酸引物和探针

上游引物：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针：5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于单重PCR）；

探针：5’-HEX-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于双重PCR）；

2、纯牛肉样品处理与含系列浓度牛肉的牛/羊/猪混合肉样制备

分别称取30g牛肉、羊肉和猪肉至3个洁净的匀浆杯中，加入120g去离子双蒸水，12000r/min匀浆8min得到3种匀浆液。用1000μl微量移液器吸取3ml牛肉匀浆液至离心管中，用漩涡振荡器震荡1min，用100μl微量移液器吸取50μl匀浆液至1.5ml离心管中（3个平行）备用。待后续处理。

用分析天平（精确到0.0001g）精确称量牛、羊、猪肉匀浆液，得到牛肉含量为0.1%、1.9%、10.0%、30.0%、60.0%、98.0%的牛/羊/猪混合肉样3g于5ml离心管中，每组样品设有三个平行，用漩涡振荡器震荡1min，用100μl微量移液器吸取50μl匀浆液至1.5ml离心管中，待后续处理。

3、DNA提取方法

在步骤2取完样品的1.5ml离心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期间不时振荡混匀。12000g离心5min，转移600μL上清液于洁净离心管中，加入400μL CTAB蛋白沉降液，振荡混匀后，12000g离心5min，取400μL上清液于洁净离心管中，加320μL异丙醇，室温下沉淀1h。12000g离心5min，弃掉上清液，然后用500μL 70%乙醇洗涤一次（12000g离心5min），弃掉上清液，晾干，加入50μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。将各DNA提取样品稀释至10ng/μl，进行后续试验。将纯牛肉样品DNA提取物连续4次10倍比稀释，得到梯度浓度为13.45ng/μl、1.345ng/μl、0.1345ng/μl、0.01345ng/μl、0.001345ng/μl的系列纯牛肉DNA模板样品。

4、实时荧光PCR反应

1）实时荧光PCR反应体系（总体积为10μl，可根据使用仪器的需要该比例调整反应体系各组分的量），见表6、7。

表6单重实时荧光PCR反应体系（总体积10μl）

注：一个PCR反应管中只含有一套引物、探针，反应体系包含5种试剂组分。

表7双重实时荧光PCR反应体系（总体积10μl）

注：两套反应体系在同一PCR反应管中进行，每套体系包含5种试剂组分。

2）实时荧光PCR反应条件

预变性：95℃30秒；

变性：95℃10秒；

退火+延伸：60℃45秒，35个循环；

降温：40℃60秒。

3）实验结果：牛/羊/猪混肉样DNA提取物PCR扩增结果如图3、5所示，系列样品C_t值的拟合曲线如图2、4所示。从图2-5中可以看出，无论从平行样品的一致性和梯度浓度样品扩增Ct值的线性关系上，本发明提供的方法体系（包括样品处理方法、DNA提取方法和PCR体系）都具有很好的表现。为实现肉制品中牛肉成分定量检测提供了很好的解决方案。

实施例3本发明检测方法体系的准确性与精密度

1、待测样品准备

分别称取30g牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉至5个洁净的匀浆杯中，加入120g去离子双蒸水，12000r/min匀浆8min得到5种匀浆液。用分析天平（精确到0.0001g）按照表6中比例，精确称量各匀浆液，得到牛肉含量为0.1%、1.9%、10.0%、30.0%、60.0%、98.0%、5.83%、32.27%、42.87%、22.33%的牛/羊/猪混合肉样3g于5ml离心管中，每组样品设有三个平行，用漩涡振荡器震荡1min，用100μl微量移液器吸取50μl匀浆液至1.5ml离心管中，待后续处理。

表8混合样品各组分比例

样品编号	牛	羊	猪	鸡	鸭
						1	1.90%	98.00%	0.10%	/	/
2	98.00%	0.10%	1.90%	/	/
						3	0.10%	1.90%	98.00%	/	/
4	30.00%	60.00%	10.00%	/	/
						5	60.00%	10.00%	30.00%	/	/
6	10.00%	30.00%	60.00%	/	/
						7	5.83%	34.47%	31.07%	12.53%	16.10%
8	32.27%	/	67.73%	/	/
						9	42.87%	/	/	57.13%	/
10	22.33%	/	/	/	77.67%

2、DNA提取

方法同实施例2，步骤3。

3、试样PCR反应

（1）引物、探针序列

同实施例2。

（2）PCR反应体系（总体积为10μl）

单重PCR使用表9中反应体系，双重PCR使用表10中反应体系。

表9单重实时荧光PCR反应体系（总体积10μl）

注：一个PCR反应管中只含有一套引物、探针，反应体系包含5种试剂组分。

表10双重实时荧光PCR反应体系（总体积10μl）

注：两套反应体系在同一PCR反应管中进行，每套体系包含5种试剂组分。

（3）实时荧光PCR反应条件

预变性：95℃30秒；

变性：95℃10秒；

退火+延伸：60℃45秒，35个循环；

降温：40℃60秒。

（4）标准曲线设置与加样方法

（1）标准曲线设置方法

1）单重PCR

分别使用表3中的2套反应体系按照表1的加样方案，对梯度浓度标准DNA样品进行PCR扩增，在单一波长下收集、记录荧光信号，分别用lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（C_{t牛特异性引物}）和lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（C_{t通用引物}）做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k₁、k₂截距为C₁和C₂。

2）双重PCR

使用表4中的反应体系按照表2的加样方案对梯度浓度标准DNA样品，在两个波长下收集、记录荧光信号，分别用lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（Ct_{牛特异性引物}）和lg（纯牛肉DNA稀释度）vs（Ct_通用引物）做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k₁、k₂截距为C₁和C₂。

（5）试样PCR

1）单重PCR

将试样按前述方法处理和提取DNA模板，分别使用表1中的2套反应体系按照表3的加样方案对其进行PCR扩增，在单一波长下收集、记录荧光信号，获得C_t值。

2）双重PCR

将试样按前述方法处理和提取DNA模板，使用表2中的反应体系按照表4的加样方案对试样DNA对其进行PCR扩增，在两个波长下收集、记录荧光信号，获得C_t值。

4、结果计算

按照公式1计算试样中牛源性成分占总肉成分的百分比含量，根据计算结果判定试样的掺假情况。牛源性成分百分含量越低，则掺假情况越严重，越高则存在掺假的可能性越小。结果见表11。

表11混合肉样中牛源性成分百分比含量计算结果

从见表11可以看出，用本发明提供的方法体系检测各种类型样品中牛源性成分百分含量，无论是单重PCR模式还是双重PCR模式，结果都与真实值之间较为相近，检测结果能够反应样品中牛肉成分的纯度，即是否存在有其他掺杂成分。

因此，使用本发明的方法只需一次测试，便可判断待测样品是否存在掺假情况和掺假情况的严重程度，而无需检测其他肉种成分，大大节约了时间和试验成本，为完善对肉制品市场的监管提供了可靠、便捷的方法手段。

5、定性判断

从图6a-f中可以直观的看到，混合肉样中牛肉成分含量不同，牛特异性引物与通用引物的扩增结果具有显著区别，含牛肉越多，两组扩增曲线距离越为接近，牛肉含量越低（即掺杂成分越多）两组扩增曲线距离越远，据此可大致判断样品中牛肉成分的纯度情况。

因此，如果在PCR过程中不设置标准曲线，则可不计算含量，而通过两组引物的扩增情况和Ct值之差进行半定量判断。实施例4用于肉制品中牛肉成分定量检测的PCR检测试剂盒

所述试剂盒包括实施例1-3中的牛特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、浓度梯度稀释的纯牛肉DNA标准品。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国肉类食品综合研究中心

<120>一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法

<130>KHP12116838.0

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aatataattt gggttaactc cacagc          26

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccatatggt taaaattagt agtggagtg       29

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cacagccttc taattagctt tacaagcctc c    31

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tacgacctcg atgttggatc a               21

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

agatagaaac cgacctggat           20

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccggtctgaa ctcagatcac gtagga    26

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ccggtctgaa ctcagatcac gtagga    26

Claims (10)

1.一种检测肉及肉制品中牛源性成分的牛特异性引物，其特征在于，

上游引物为：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；

下游引物为：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’。

2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。

3.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，其核苷酸序列为：

5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括脊椎动物通用引物和探针，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

所述探针为：

5’-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’,其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团；优选F为FAM或HEX；M为TAMRA。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、纯牛肉DNA标准品中的一种或几种。

7.一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法，其特征在于，

1）待测样品匀浆，提取DNA；

2）提取纯牛肉DNA，进行浓度梯度稀释，制作标准品；

3）分别以步骤1）和步骤2）中提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物、权利要求3所述的探针和权利要求5所述的通用引物和探针进行PCR扩增，以纯牛肉标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算待测样品中牛源性成分的百分含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR为单重PCR，其中10μl反应体系包含：

使用引物/探针类型 牛特异性引物/探针 通用引物/探针 Taq酶预混液 5μl 5μl 上游引物 5μM 0.7-0.9μl 5μM 0.5-0.7μl 下游引物 5μM 0.7-0.9μl 5μM 0.5-0.7μl 探针 5μM 0.3-0.6μl 5μM 0.3-0.6μl 模板DNA 2μl 2μl 蒸馏水 补足10μl 补足10μl

或双重PCR，其中10μl反应体系包含：

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃变性10-15秒，58-62℃退火+延伸45-60秒，35个循环。

10.权利要求1所述引物、权利要求2或5-6任一项所述试剂盒在检测牛肉及其制品掺假中的应用。

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