CN105349625A - 一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法 - Google Patents

一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105349625A
CN105349625A CN201510555035.6A CN201510555035A CN105349625A CN 105349625 A CN105349625 A CN 105349625A CN 201510555035 A CN201510555035 A CN 201510555035A CN 105349625 A CN105349625 A CN 105349625A
Authority
CN
China
Prior art keywords
beef
ratio
detection
pork
meat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510555035.6A
Other languages
English (en)
Inventor
宗凯
周莉质
陈雪娇
李云飞
孙娟娟
姚剑
余晓峰
郑海松
吕侠影
王满满
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection & Quarantine Technology Center Of Anhui Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection & Quarantine Technology Center Of Anhui Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection & Quarantine Technology Center Of Anhui Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau filed Critical Inspection & Quarantine Technology Center Of Anhui Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Priority to CN201510555035.6A priority Critical patent/CN105349625A/zh
Publication of CN105349625A publication Critical patent/CN105349625A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，包括三步：一、建立牛肉和猪肉实际掺入比例与检测比例之间的线性关系；二、检测待检肉的牛肉的比例；三、根据线性关系计算得出待检肉中牛肉的比例；在PCR检测法的基础上，结合毛细管电泳进行定量检测，采用QIAxcel？Advanced？DNA分析系统对PCR片段进行高灵敏度的检测，获得可靠核酸浓度结果，再通过统计学的方法，得出牛肉检测比例和实际牛肉比例之间的关系，排除干扰因素的影响；利用牛肉检测比例和实际牛肉比例之间的关系，可以在PCR检测法的基础上，结合毛细管电泳进行定量检测，从而计算出牛肉比例。

Description

一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法。
背景技术
一场被称为“牛肉丑闻”的风波正席卷欧洲大陆。2013年1月份，英国和爱尔兰的数家大型连锁超市售卖的部分牛肉制品被曝含有马肉或猪肉的成分，两国食品卫生监督部门遂联手展开调查，发现货源供应商可能来自第三甚至第四国。有着最严格食品安全监管制度的欧盟，曝出“牛肉丑闻”再一次给食品安全监管拉响了警报。在国内市场上销售的牛肉及加工制品中，以次充好、以假乱真、欺骗消费者的现象也十分严重。从2013年1月份开始，安徽出入境检验检疫局技术中心对安徽省工商系统各地市级工商局(所)抽查的牛肉及牛肉制品掺假情况进行检测，共检测了近200个样本，经检测截获一批假冒牛羊肉，其中以猪肉假冒牛肉为主。
目前对食品中牛羊源性成分的检测主要有免疫学检测法(ELISA)，PCR检测法。其中PCR检测法被采用最为广泛，出入境行业标准采用的也是荧光定量PCR法，如《SN/T2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》，《GB/T25165-2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》。
SN/T2051-2008采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA(COXI)基因上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。GB/T25165-2010利用实时荧光PCR技术，根据生长激素基因特异性序列对牛源性成分进行鉴定。以上标准均只能对掺假进行定性检测，但目前大量掺假并非样品肉中不含一点牛肉，而是猪肉成分为主含有少量牛成分，目前以上标准均无法解决此类掺假定量检测的问题。
发明内容
为了达到对牛肉成分中掺入猪肉等杂肉的定量检测，结合现有的定量检测方法，能做到定量检测的生物学检测方法：在PCR检测法的基础上，结合毛细管电泳进行定量检测，采用QIAxcelAdvancedDNA分析系统对PCR片段进行高灵敏度的检测，获得可靠核酸浓度结果，再通过统计学的方法，得出牛肉检测比例和实际牛肉比例之间的关系，排除干扰因素的影响；利用牛肉检测比例和实际牛肉比例之间的关系，可以在PCR检测法的基础上，结合毛细管电泳进行定量检测，从而计算出牛肉比例。
本发明的目的旨在提供一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法。
本发明的技术方案为：
一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，该检测方法包括三步：一、建立牛肉和猪肉实际掺入比例与检测比例之间的线性关系；二、检测待检肉的牛肉的比例；三、根据线性关系计算得出待检肉中牛肉的比例；
第一步建立牛肉实际掺入比例与检测比例之间的线性关系，包括以下步骤：
(1)将处理干净的牛肉和猪肉冻干；
(2)冻干后的牛肉和猪肉，研磨成粉末，按牛肉梯度比例掺入牛肉粉末和猪肉粉末，配比成含10％-80％牛肉的混和肉；
(3)称取各浓度的混合肉粉末0.1g，提取DNA；
(4)以所提取的DNA作为模板，以16SRNA作为靶基因，进行PCR扩增；
(5)扩增结束后，进行毛细管电泳检测，对各浓度的牛肉粉末PCR扩增物中的牛肉PCR扩增物浓度定量分析；
(6)根据检测的牛肉比例和实际的牛肉掺入比例建立线性关系；
第二步检测待检肉的牛肉的比例：
检测步骤同第一步中步骤(1)至步骤(5)，记录检测得出的牛肉比例；
第三步计算待检肉中牛肉的比例：
将第二步中检测出的牛肉比例，结合第一步的线性关系，计算得出待检肉中牛肉的比例。
优选的，所述检测方法用于检测牛肉比例在10％-80％的猪肉冒充牛肉的参假肉制品。
优选的，所述步骤(4)中的靶基因，引物序列为：
F:5′-CGAGAAGACCCTATGGAGC-3′
R:5′-CCTTTGATAGCGGTTGC-3′
牛16SRNA扩增目的片段长度为240bp。
优选的，所述步骤(4)中PCR扩增的反应条件为：95℃/5min，95℃/5sec，53℃/45sec，72℃/45sec，72℃/10min，其中95℃/5sec至60℃/45sec过程进行30个循环。
优选的，所述步骤(5)中，以D2000为标准Marker，D2000Marker含有6条标准带，100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，对应每条带浓度为8.3ng/ul，8.3ng/ul，8.3ng/ul，16.6ng/ul，8.3ng/ul，建立峰面积与浓度换算关系，对目标条带片段大小和条带浓度进行定量。
本发明的有益：
本发明使用采用PCR检测法结合毛细管电泳，检测待检肉中牛肉比例，再通过统计学方法，克服牛肉比例检测值和真实值不吻合影响因素，进行牛肉掺假的定量检测。
附图说明
图1，10％-80％牛肉实际掺入比例电泳检测QIAxcel分析结果。
图2，D2000Marker电泳检测QIAxcel分析结果。
图3，牛肉实际掺入比例10％QIAxcel平台电泳检测结果。
图4，牛肉实际掺入比例20％QIAxcel平台电泳检测结果。
图5，牛肉实际掺入比例40％QIAxcel平台电泳检测结果。
图6，牛肉实际掺入比例60％QIAxcel平台电泳检测结果。
图7，牛肉实际掺入比例80％QIAxcel平台电泳检测结果。
图8，样品中牛肉实际掺入比例与样品检测比例之间线性关系。
图9，实际掺入比例66％的参假牛肉的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
1牛肉掺假检测标准曲线的建立
1.1从市场购买新鲜猪肉、牛肉各100g，用水将猪肉和牛肉表面冲洗干净，剔除脂肪组织，置于-30度冰箱中保存3小时，取出，置于冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，至完全冻干猪肉和牛肉，用冷冻研磨仪磨成粉末。用样品袋分别装好粉碎后的猪肉和牛肉粉末。按表1中准确称取猪肉粉和牛肉粉。
表1
1.2CTAB法提取样品肉DNA
(1)0.1g混合肉样中加入1mlCTAB缓冲液，震荡均匀，65℃孵育1小时；
(2)10000rpm离心10min，取上清转入新的离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇＝24：1，震荡摇匀；
(3)10000rpm离心10min，取上清转入新的离心管中，加入等体积氯仿，震荡摇匀；
(4)10000rpm离心10min，取上清转入新的离心管中，加入等体积异丙醇；
(5)14000rpm离心10min，除去上清，在沉淀中加入350ul70％乙醇，14000rpm离心5min,；
(6)除去上清，放置室温干燥10min，后加入200ul超纯水溶解DNA，经ThermalNanodrop2000测定DNA浓度，并将每管浓度稀释到20ng/ul用于作为后续PCR模板。
1.3PCR扩增体系和扩增条件
扩增体系采用25ul,所述的体系包括以下组分：
加水至25ul
扩增条件：95℃/5min，95℃/5sec，53℃/45sec，72℃/45sec，72℃
/10min，其中95℃/5sec至60℃/45sec过程进行30个循环。以16S
RNA为靶基因，引物序列：
F:5′-CGAGAAGACCCTATGGAGC-3′
R:5′-CCTTTGATAGCGGTTGC-3′
猪16SRNA扩增目的片段长度为247bp
牛16SRNA扩增目的片段长度为240bp
1.4QIAxcel平台进行毛细管电泳检测以及结果分析
表2样品中牛肉实际比例和样品检测比例
10％-80％牛肉实际掺入比例电泳检测QIAxcel分析结果见图1，图1为QIAxcel平台提供的样品中牛肉掺入比例10％-80％的毛细管电泳检测结果，H01泳道为D2000Marker，每条带位置已在图1中标出，每条带浓度见图2，泳道H02-H07为牛肉掺入比例10％-80％的实际检测结果。
由表2可看出，样品肉中牛肉与猪肉实际比例与检测获得比例并不吻合，其原因是：(1)样品肉中牛肉与猪肉提取核酸效率存在差异；(2)牛肉DNA和猪肉DNA在同一个体系与引物结合会形成彼此之间竞争关系，两种DNA与引物的亲和性存在差异，因此扩增效率不一致，我们实验表明猪DNA扩增效率要高于牛DNA，故而检测获得牛掺入比例要低于牛实际掺入比例。
图2，D2000Marker电泳检测QIAxcel分析结果，包含6条带，100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，对应每条带浓度为8.3ng/ul，8.3ng/ul，8.3ng/ul，16.6ng/ul，8.3ng/ul。
图3牛肉实际掺入比例10％QIAxcel平台电泳检测结果为8.42％。
图4牛肉实际掺入比例20％牛肉实际掺入比例20％，QIAxcel平台电泳检测结果为18.15％。
图5牛肉实际掺入比例40％，QIAxcel平台电泳检测结果为30.85％。
图6牛肉实际掺入比例60％，，QIAxcel平台电泳检测结果为47.48％。
图7牛肉实际掺入比例80％，，QIAxcel平台电泳检测结果为62.78％。
图8样品中牛肉实际掺入比例与样品检测比例之间线性关系，图8建立了样品中牛肉实际掺入比例与检测比例之间的线性关系。通过图8可以得出，在牛肉中掺入猪肉的情况下，牛肉的实际比例(x)与检测比(y)之间的线性关系两者存在较为良好的线性关系，即y＝0.7651x+0.014，相关系数R2为0.998；因此在牛肉中掺入猪肉的情况下，实际检测中只要保持同样的检测体系，检测出牛肉的比例y，利用图3中线性关系公式即可计算出检测肉品中牛肉实际比例x，误差在±2％以内。
为了更好的验证该线性关系的准确性，通过同样的实验方法和检测体系，将猪肉和牛肉混合，检测了实际牛肉参比5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％的检测比例，实际检测的结果为：4.25％、11.91％、21.16％、29.29％、35.56％、42.59％、52.16％、58.94％、67.40％、74.33％，通过线性关系计算的含量比例：3.72％、13.74％、25.83％、36.45％、44.65％、53.83％、66.34％、75.21％、86.26％、95.32％，由以上结果可得，该线性关系在实际检测中具有很好的准确性。
在实际检测应用中本检测方法在牛肉比例10％-80％之间时，准确度更好。
盲测实施例
从市场购买新鲜猪肉、牛肉各100g，简单冲洗猪肉和牛肉表面，剔除脂肪组织，置于-30度冰箱中保存3小时，取出置于冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，至完全冻干猪肉和牛肉，用冷冻研磨仪磨成粉末，由他人准确称取猪肉粉34g和牛肉粉66g，充分混合均匀，取0.1g肉样，CTAB法提取样品肉DNA；PCR扩增；QIAxcel平台进行电泳检测，检测结果为52.91％，结果如下。
图9实际掺入比例66％的参假牛肉的检测结果：
结合牛肉实际掺入比例与检测比例之间线性关系，可以计算出牛肉的掺入比为67.32％，和实际的掺入比65％相差1.39％，证实本检测系统有很高的准确性，且具有很好的可操作性。

Claims (5)

1.一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，其特征在于,所述检测方法包括三步：一、建立牛肉和猪肉实际掺入比例与检测比例之间的线性关系；二、检测待检肉的牛肉的比例；三、根据线性关系计算得出待检肉中牛肉的比例；
所述第一步建立牛肉实际掺入比例与检测比例之间的线性关系，包括以下步骤：
(1)将处理干净的牛肉和猪肉冻干；
(2)冻干后的牛肉和猪肉，研磨成粉末，按牛肉梯度比例掺入牛肉粉末和猪肉粉末，配比成含10％-80％牛肉的混和肉；
(3)称取各浓度的混合肉粉末0.1g，提取DNA；
(4)以所提取的DNA作为模板，以16SRNA作为靶基因，进行PCR扩增；
(5)扩增结束后，进行毛细管电泳检测，对各浓度的牛肉粉末PCR扩增物中的牛肉PCR扩增物浓度定量分析；
(6)根据检测的牛肉比例和实际的牛肉掺入比例建立线性关系；
所述第二步检测待检肉的牛肉的比例：
检测步骤同第一步中步骤(1)至步骤(5)，记录检测得出的牛肉比例；
所述第三步计算待检肉中牛肉的比例：
将第二步中检测出的牛肉比例，结合第一步的线性关系，计算得出待检肉中牛肉的比例。
2.根据权利要求1所述的用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，其特征在于，所述检测方法用于检测牛肉比例在10％-80％的猪肉冒充牛肉的参假肉制品。
3.根据权利要求1或2任一项所述的用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的靶基因，引物序列为：
F:5′-CGAGAAGACCCTATGGAGC-3′
R:5′-CCTTTGATAGCGGTTGC-3′
牛16SRNA扩增目的片段长度为240bp。
4.根据权利要求1或2任一项所述的用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR扩增的反应条件为：95℃/5min，95℃/5sec，53℃/45sec，72℃/45sec，72℃/10min，其中95℃/5sec至60℃/45sec过程进行30个循环。
5.根据权利要求1或2任一项所述的用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中，以D2000为标准Marker，D2000Marker含有6条标准带，100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，对应每条带浓度为8.3ng/ul，8.3ng/ul，8.3ng/ul，16.6ng/ul，8.3ng/ul，建立峰面积与浓度换算关系，对目标条带片段大小和条带浓度进行定量。
CN201510555035.6A 2015-08-28 2015-08-28 一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法 Pending CN105349625A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510555035.6A CN105349625A (zh) 2015-08-28 2015-08-28 一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510555035.6A CN105349625A (zh) 2015-08-28 2015-08-28 一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105349625A true CN105349625A (zh) 2016-02-24

Family

ID=55325687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510555035.6A Pending CN105349625A (zh) 2015-08-28 2015-08-28 一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105349625A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734160A (zh) * 2016-04-30 2016-07-06 江苏省家禽科学研究所 畜禽肉猪牛羊源性成分pcr鉴定用引物体系及pcr鉴定方法与试剂盒
CN106755304A (zh) * 2016-11-19 2017-05-31 宋胜辰 一种鉴定牛肉的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296111A (zh) * 2011-08-05 2011-12-28 中国肉类食品综合研究中心 基于rt-pcr测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法
CN102994637A (zh) * 2012-11-26 2013-03-27 中国肉类食品综合研究中心 一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296111A (zh) * 2011-08-05 2011-12-28 中国肉类食品综合研究中心 基于rt-pcr测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法
CN102994637A (zh) * 2012-11-26 2013-03-27 中国肉类食品综合研究中心 一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JORGE H.CALVO ET AL: "Quantitative PCR Detection of Pork in Raw and Heated Ground Beef and Pate", 《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
杨君娜 等: "适于肉种掺杂比例实时荧光PCR测定的样品前处理方法", 《肉类研究》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734160A (zh) * 2016-04-30 2016-07-06 江苏省家禽科学研究所 畜禽肉猪牛羊源性成分pcr鉴定用引物体系及pcr鉴定方法与试剂盒
CN106755304A (zh) * 2016-11-19 2017-05-31 宋胜辰 一种鉴定牛肉的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106676189A (zh) 一种基于微滴式数字pcr的牛、猪源性成分定量检测方法、引物和探针及试剂盒
CN106967838A (zh) 一种检测鸭源性成分的rpa引物、试剂盒及检测方法
CN103776773A (zh) 一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法
CN104946790A (zh) 一种溯源鉴定8种动物源性成分的pcr方法
Xu et al. Rapid method for total phenolic acid determination in rapeseed/canola meals
CN106555000A (zh) 一种鉴定植物蛋白饮料中植物源性成分的方法
CN106521016B (zh) 利用单拷贝核基因检测食品和饲料中牛源性成分的实时荧光pcr检测方法
CN105349625A (zh) 一种用于定量检测猪肉冒充牛肉的检测方法
CN106048034A (zh) 基于pcr‑rlfp‑dhplc技术扫描分析食品中动物源性成份组成
CN105567801A (zh) 牛肉制品中猪肉成分定量检测方法
KR101198654B1 (ko) 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커
CN101845508A (zh) 虎源性、豹源性dna的pcr检测引物、试剂盒及检测方法
CN103525908A (zh) 一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法
CN103451304B (zh) 实时荧光pcr检测貉子源性成分的引物探针及方法
CN105671157A (zh) 同步检测肉及肉制品中动物源性成分的试剂盒及其应用
CN103122373B (zh) 特异性检测鲑科鱼类的实时荧光pcr试剂盒及检测方法
CN105588910B (zh) 塑料制品迁移物对酒产品影响的风险评估方法
CN104789692B (zh) 一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒
CN102559919B (zh) 食品和饲料中水牛成分的实时荧光pcr检测方法
Peake et al. Determination of trace metal concentrations in ginseng (Panax Quinquefolius (American)) roots for forensic comparison using Inductively Coupled Plasma Mass-Spectrometry
CN104962650A (zh) 一种同步鉴别动物源性成分的pcr方法及试剂盒
CN107012247A (zh) 利用单拷贝核基因检测食品和饲料中山羊源性成分的实时荧光pcr检测方法
CN106995852A (zh) 利用单拷贝核基因检测食品和饲料中绵羊源性成分的实时荧光pcr检测方法
Kubiak et al. Evaluation of the quality of postharvest rapeseed by means of an electronic nose
CN107488706A (zh) 用于狐狸源性成分数字pcr精准定量检测的引物探针及方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160224