CN103776773A

CN103776773A - 一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法

Info

Publication number: CN103776773A
Application number: CN201410012308.8A
Authority: CN
Inventors: 刘贤; 蒲乾坤; 韩鲁佳; 杨增玲
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2034-01-10
Also published as: CN103776773B

Abstract

本发明涉及一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法，包括以下步骤：1）收集与制备已知来源的不同种属动物源性饲料原料样本；2）提取脂质样品；3）采集脂质样品红外光谱信息数据；4）依据步骤3）中所采集的脂质样品红外光谱信息数据，建立反刍动物源性饲料原料判别分析模型；5）评价步骤4）所建立的判别分析模型；6）提取待测动物源性饲料脂质样品，并采集红外光谱信息数据，输入步骤4）中所建立的判别分析模型进行种属鉴别分析。本发明方法可实现反刍动物源性饲料原料的快速、有效鉴别分析。

Description

一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法

技术领域

本发明涉及动物源性饲料的鉴别分析领域，具体地说，涉及一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法。

背景技术

近年来，“疯牛病”事件对欧盟乃至世界范围的畜牧业、公共安全、饲料工业和畜产品国际贸易均带来了巨大冲击，严重威胁动物和人类健康的同时，也造成了巨大的经济损失。已有研究表明疯牛病是由于使用患有疯牛病和羊搔痒病的牛、羊等动物的肉骨粉添加在饲料中喂养反刍动物而引起，反刍动物食用同源性动物源性饲料是传播疯牛病的主要途径。为了高效防范疯牛病，从源头上切断疯牛病的传播途径，世界各国纷纷制定相关措施并通过法律、法规控制反刍动物肉骨粉等动物源性饲料的使用。但是由于蛋白质饲料资源匮乏，加之利益的驱使，非法进口、制假售假和违禁添加等违规使用动物源性饲料的行为屡禁不止，这不仅严重扰乱市场秩序，侵害消费者的利益，也造成了很大的疯牛病隐患。要满足饲料质量安全监管需求，确保相关法律法规的有效实施，科学可靠的检测技术和方法是重要的保障。而为了更好地实施饲料产业的可持续发展和循环利用，逐步细化至不同种属之间是否相互饲用是动物源性饲料禁用法律法规的必然发展趋势，这也对不同种属尤其是反刍动物源性饲料的鉴别技术提出更高的要求。

目前，国际范围内研究和应用较多的动物源性饲料检测技术主要有：以组织学特性为基础的显微镜分析法、以蛋白质为基础的酶联免疫吸附分析法、以DNA为基础的聚合酶链反应法以及近红外光谱快速分析和显微近红外分析技术。其中用于官方仲裁检测的动物源性饲料检测标准方法主要为显微镜分析法和聚合酶链反应法，我们国家目前主要采用聚合酶链反应法。上述这两种方法虽然可以进行不同种属动物源性成分的鉴别分析，但均存在一定的局限性，单一使用难以满足高效准确的种属鉴别分析要求。显微镜法没法进行反刍动物种属的检测，PCR法可以进行反刍动物种属鉴别但自身存在很多不足如温度敏感、假阳性问题。现有的近红外和显微镜技术都是基于原料进行检测的，属于快速方法但检测精度都相对偏低，而且同样对于种属的分析有局限性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法。

本发明所述的动物源性饲料原料包括陆生动物肉骨粉、陆生动物肉粉、陆生动物骨粉和鱼粉等蛋白饲料。当前市场上动物源性饲料多为单一种属动物制成，本发明也是针对多种不同的单一种属动物制成的动物源性饲料原料进行鉴别分析。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法，包括以下步骤：

1）收集与制备已知来源的不同种属动物源性饲料原料样本；

2）提取脂质样品；

3）采集脂质样品红外光谱信息数据；

4）依据步骤3）中所采集的脂质样品红外光谱信息数据，建立反刍动物源性饲料原料判别分析模型；

5）评价步骤4）所建立的判别分析模型；

6）提取待测动物源性饲料脂质样品，并采集红外光谱信息数据，输入步骤4）中所建立的判别分析模型进行种属鉴别分析。

其中，步骤1）还包括对所收集与制备的已知来源的不同种属动物源性饲料进行旋风磨粉碎，然后过1.0mm筛。

其中，步骤2）中，采用索氏提取法提取脂质样品。

其中，步骤3）中脂质样品红外光谱信息基础数据的采集方式为衰减全反射方式。

其中，步骤3）中光谱采集范围为4000到400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。

其中，步骤4）中，采用回归法和留一法交互验证，建立反刍动物源性饲料原料偏最小二乘判别分析模型。

其中，步骤5）中，采用识别率Sensitivity和拒绝率Specificity两个指标对判别模型进行评价，Sensitivity和Specificity越接近于1，判别模型精度越高。

Sensitivity=PA/（PA+ND）（1）

Specificity=NA/（PD+NA）（2）

式中：PA为判别阳性样品数,ND为判别假阴性样品数，NA为判别阴性样品数，PD为判别假阳性样品数。

优选地，所述识别率Sensitivity和拒绝率Specificity为0.85-1.0时，所述判别分析模型有效。

其中，步骤6）中用索氏提取法提取待测动物源性饲料原料样品的脂质样品，用衰减全反射方式采集脂质样品红外光谱信息基础数据，输入步骤4）中所建立的判别分析模型进行反刍动物源性饲料原料的鉴别分析。

本发明的优点：

1）本发明采用索氏提取法进行脂质样品提取，可常规、简便获取不同种属动物源性饲料原料的预处理样品。

2）本发明通过衰减全反射方式进行脂质样品红外光谱信息基础数据的采集，可直观并显著体现不同种属动物源性饲料原料脂质组成差异特性。

3）本发明利用回归法和留一法交互验证建立不同种属动物源性饲料偏最小二乘判别分析模型，并通过识别率Sensitivity和拒绝率Specificity两个指标进行评价，有效保证判别模型稳定性的同时并直观显示模型的鉴别分析能力。

4）本发明直接采集脂质样品的红外光谱，将光谱信息与种属来源信息相关联，可实现反刍动物源性饲料原料的快速、有效鉴别分析，从而满足我国饲料质量安全监管对于反刍动物源性饲料种属鉴别的分析要求，可保证在高效防范“疯牛病”的同时有效实施饲料产业的可持续发展和循环利用。

附图说明

图1为实施例1中基于脂质红外光谱的不同种属动物源性饲料主成分分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1）研究样本收集与制备

研究样本为51份已知动物种属的动物源性饲料，包括经相关质检部门收集自国内和国外蛋白饲料企业的产品和自制样本两部分，样本涵盖了陆生动物肉粉、骨粉、肉骨粉、羽毛粉和鱼粉等，其中反刍动物源样本20个（牛源9个，羊源11个），非反刍动物源样本18个（猪源10个，鸡源8个）和鱼源样本13个。

所有研究样本采用旋风磨进行粉碎，然后过1.0mm筛。

2）脂质样品提取

采用索氏提取法利用全自动脂肪测定仪（SoxtecTM 2050，丹麦FOSS公司）提取上述研究样本脂质样品。

3）脂质样品红外光谱信息数据

采用Perkin Elmer FT-IR Spectrum 400（美国Perkin Elmer公司）和衰减全反射ATR（Attenuated Total Reflectance）附件进行脂质样品红外光谱信息基础数据的采集。其中光谱采集范围为4000到400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。每次扫描样品之前，以空气光谱为背景光谱。

4）判别分析模型建立与评价

采用Matlab软件（R2010b，美国Mathworks公司），首先对不同种属来源的动物源性饲料脂质红外光谱信息数据进行主成分分析（PCA）。

图1显示：前三个主成分分别占总变异数的42.71%，28.00%和15.66%，研究样本中反刍动物源与非反刍动物源和鱼源的样品分别处于相互分离的族群，具有较好的分离度。

依据上述所采集的脂质样品红外光谱信息基础数据，将脂质近红外光谱信息与样品的种属来源信息相关联，采用回归法和留一法交互验证，建立反刍动物源性饲料原料偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型，模型的识别率Sensitivity和拒绝率Specificity结果见表1：

表1反刍动物源性饲料原料判别分析模型结果

结果显示，反刍动物源的实验样本识别率Sensitivity和拒绝率Specificity分别为0.95和1.00，表现出较高的判别分析模型精度。

5）判别分析模型验证

选择10个待测实验样本，其中反刍动物源样本4个（牛源2个，羊源2个），非反刍动物源样本4个（猪源2个，鸡源2个）和鱼源样本2个，对所建立的判别分析模型进行验证。验证结果表明，4个反刍动物源样本的种属鉴别分析结果均正确，样本的识别率Sensitivity和拒绝率Specificity均为1.00。

对比例

本实施例将其方法与以下两种分析方法进行了比较分析。

（1）采用索氏提取法利用全自动脂肪测定仪（SoxtecTM 2050，丹麦FOSS公司）提取研究样本脂质样品，通过气相色谱仪（GC-2014C，日本岛津公司）测定样本的脂肪酸含量。将某种脂肪酸检出标记为“1”，未检出标记为“0”，确定不同种类脂肪酸的检出与未检出信息基础数据，依据脂肪酸检出与未检出信息数据，采用回归法和留一法交互验证，建立反刍动物源性饲料偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型。

（2）采用索氏提取法利用全自动脂肪测定仪（SoxtecTM 2050，丹麦FOSS公司）提取研究样本脂质样品，通过气相色谱仪（GC-2014C，日本岛津公司）测定样本的脂肪酸含量。将脂肪酸具体含量信息与样品种类来源信息进行关联，建立反刍动物源性饲料偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型。

试验结果：表2为本发明方法与上述两种方法的判别分析模型结果。结果显示，基于脂质近红外光谱信息的本发明方法，与基于脂肪酸检出/未检出信息和脂肪酸含量信息的鉴别分析结果相差不大，但却省却了样本脂肪酸含量测定这一耗时费力、花费高并且对测定人员有着严格操作技术要求的步骤。因此，本发明方法与其他两种方法相比具有测定速度快,不耗费化学试剂,操作简便等显著优点。

表2反刍动物源性饲料原料判别分析模型对比分析

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种基于脂质红外光谱的反刍动物源性饲料原料鉴别方法，包括以下步骤：

1）收集与制备已知来源的不同种属动物源性饲料原料样本；

2）提取脂质样品；

3）采集脂质样品红外光谱信息数据；

5）评价步骤4）所建立的判别分析模型；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中对所收集的已知来源的不同种属动物源性饲料进行旋风磨粉碎，然后过1.0mm筛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，采用索氏提取法提取脂质样品。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中脂质样品红外光谱信息基础数据的采集方式为衰减全反射方式。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中，采用回归法和留一法交互验证，建立反刍动物源性饲料原料偏最小二乘判别分析模型。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤5）中，采用识别率Sensitivity和拒绝率Specificity两个指标对判别模型进行评价，Sensitivity和Specificity越接近于1，判别模型精度越高；

Sensitivity=PA/（PA+ND）（1）

Specificity=NA/（PD+NA）（2）

式中：PA为判别阳性样品数，ND为判别假阴性样品数，NA为判别阴性样品数，PD为判别假阳性样品数。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述识别率Sensitivity和拒绝率Specificity为0.85-1.0时，所述判别分析模型有效。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）中用索氏提取法提取待测动物源性饲料原料样品的脂质样品，用衰减全反射方式采集脂质样品红外光谱信息基础数据，输入步骤4）中所建立的判别分析模型进行反刍动物源性饲料原料的鉴别分析。