CN109813813B - 基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，包括：1)对超高温灭菌乳样品和复原乳样品进行提脂预处理，得到脂质样品；2)采用高分辨质谱技术，对超高温灭菌乳和复原乳的脂质样品进行色谱分离‑质谱扫描；3)对两种乳的脂质样品的峰进行提取、过滤，对各脂质成分进行定性分析，并对各脂质成分进行积分处理；4)将积分结果进行正交偏最小二乘方差判别分析，确定出可将两种类型乳完全分类的表征因子；5)利用筛选出的表征因子建立正交偏最小二乘方差判别模型。本发明采用高分辨质谱仪进行测定，前处理方法简单，易操作，且可对两种乳中物质的种类和含量进行全面分析，实现样品的在线自动化检测，极大提高了样品的检测效率。

Description

基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法
技术领域
本发明属于食品检验领域，具体涉及一种乳制品的检测判别方法。
背景技术
牛乳具有独特的口感和丰富的营养价值，广受消费者喜爱。随着消费水平的提高，牛乳的需求量不断增大，导致原料乳供应不足，许多企业为了降低成本，在生产过程中使用乳粉勾兑复原乳，而不加标识，极大地降低了牛乳的营养价值，严重侵犯了消费者合法权益。常见的市售液态牛乳主要有超高温灭菌乳和巴氏杀菌乳，而超高温灭菌乳中掺入乳粉的现象尤为突出。超高温灭菌乳加工过程中采用的温度是138-145℃，2-5s，而乳粉的加工需要经过超高温瞬时杀菌和喷雾干燥，因此其营养价值损失较大。目前检测复原乳的方法主要集中于某些特定的目标物，如糠氨酸、乳果糖及热变性蛋白，这些方法不仅前处理复杂、耗时长，并且容易造成假阳性。因此，为了保障消费者的权益和健康，消除消费恐慌，更加准确、高效地判别复原乳，建立判别超高温灭菌和复原乳的检测方法，意义重大。
高分辨质谱技术与色谱技术联用，能很好地把一个混合样品分离开，质谱分别得到各组分的质谱图，通过分子离子峰和碎片离子峰加以结构剖析-定性，在食品成分安全检测中发挥着重大作用，该技术检测灵敏度高，可对牛乳中各代谢物进行全面分析。结合化学计量学方法，找出超高温灭菌乳和复原乳中差异物质，并建立可行性强，准确度高的复原乳和超高温灭菌乳判别模型，可为日后乳品的真实性鉴别提供强有力的技术支撑。
发明内容
针对市场上出现的复原乳冒充超高温灭菌乳问题，本发明的目的是提出一种基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，利用高分辨质谱建立方便、灵敏、精确的检测方法和判别模型，实现对超高温灭菌乳和复原乳判别的快速自动化测定。
实现本发明上述目的技术方案为：
一种基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，包括步骤：
1)对超高温灭菌乳样品和复原乳样品进行提脂预处理，得到脂质样品；
2)采用高分辨质谱技术，分别对超高温灭菌乳和复原乳的脂质样品进行色谱分离-质谱扫描，包括一级扫描(MS)和二级离子碎片扫描(MS/MS)；
3)对两种乳的脂质样品的峰进行提取、过滤，对各脂质成分进行定性分析，并对各脂质成分峰面积进行积分处理；
4)将积分结果进行正交偏最小二乘方差判别分析，确定出可将两种类型乳完全分类的表征因子；
5)利用筛选出的表征因子建立正交偏最小二乘方差判别模型，以区分超高温灭菌乳和复原乳。
其中，所述复原乳样品是用全脂奶粉，按照蛋白质含量为3.0g/100mL配制而得。
其中，所述提脂预处理为：向1体积份的超高温灭菌乳或复原乳的样品中加3～8体积份的水，涡旋；再加入10～20体积份的CHCl3和MeOH混合溶液，涡旋、离心；取下层溶液进行氮吹；用5～15体积份的CHCl3和MeOH混合溶液复溶。
其中，所述CHCl3和MeOH混合溶液中CHCl3:MeOH的体积比为(2～3):1；所述CHCl3和MeOH混合溶液中CHCl3:MeOH的体积比为(2～3):1。
进一步地，所述色谱分离的条件为：
采用的流动相A为含1～50mmol/L乙酸铵的乙腈水溶液，流动相B为含1～50mmol/L乙酸铵的异丙醇乙腈溶液。
上述的流动相中，乙腈水溶液可以是乙腈和水体积比(5～6)：(5～4)的溶液。异丙醇乙腈溶液，可以是异丙醇和乙腈体积比(8～10)：1的溶液。
更优选地，洗脱梯度为:
Figure BDA0001949575490000031
其中，质谱的条件为：正离子模式喷雾电压3.2kV，离子源温度320℃，鞘气流速35Arb,辅助气体流速10Arb；
负离子模式喷雾电压2.8kV，离子源温度320℃，鞘气流速35Arb,辅助气体流速10Arb。
进一步地，对两种模式下判别分析的VIP值(重要性投影值)进行分析，正离子模式下，提取VIP>1.5的脂质成分作为区别两种乳的表征因子，共计13个；利用单因素方差法(one-way ANOVA法)对正、负离子模式下的分析各表征因子的方差显著性，
VIP值大于1就说明对分类有重要贡献，根据每个表征因子在两种奶中的差异度，选择了不同的VIP值。
其中，对两种模式下判别分析的VIP值(重要性投影值)进行分析，负离子模式下，提取VIP>1.3的脂质成分作为区别两种乳的表征因子，共计12个。
利用单因素方差法(one-way ANOVA法)对正、负离子模式下的分析各表征因子的方差显著性，
采用上述的提取方法，正离子模式下，提取的表征因子计13个，为PC(18:0/18:1)，PE(16:0/18:1)，PE(18:0/18:1，PE(18:1/18:1)，PE(18:1/20:3，TG(15:0/10:0/14:0)，TG(16:0/8:0/18:1)，TG(4:0/10:0/15:0)，TG(4:0/11:2/16:1)，TG(4:0/8:0/15:0)，TG(6:0/14:1/18:3)，TG(6:0/15:0/18:2)，TG(6:0/18:0/18:1)。
采用上述的提取方法，负离子模式下，提取的表征因子12个，为12-Hydroxydodecanoic acid，16-Hydroxyhexadecanoic acid，3-Oxotetradecanoic acid，CL(18:1/18:0/18:0/18:1)，CL(22:3/16:0/18:1/18:1)，LPE(18:0)-H，LPE(18:1)，PE(16:0/18:2)，PE(18:1/14:0)，CL(18:1/16:0/18:0/18:0)-H，CL(22:3/18:1/18:1/18:1)-H，MGDG(18:1/18:1)。
上述表征因子中，MGDG为脂肪酸甘油酯，PC为卵磷脂，PE为脑磷脂，TG为甘油三酯，LPE为溶血磷脂，CL为心磷脂，括号里是碳原子数。
更进一步地，所述的利用高分辨质谱鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，还包括操作：用色谱分离-质谱扫描未知乳样的脂质样品，基于所述正交偏最小二乘方差判别模型，对未知乳样进行鉴别。积分数值落在超高温灭菌乳区域内的判定为超高温灭菌乳，落在复原乳区域内的判定为复原乳。
本发明的有益效果在于：
(一)本发明提出的基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，采用高分辨质谱仪进行测定，前处理方法简单，易操作，且可对两种乳中物质的种类和含量进行全面分析，实现样品的在线自动化检测，极大提高了样品的检测效率。
(二)本发明方法建立的鉴别模型可行性强，准确度高，为日后乳品的真实性鉴别提供了方便实用的技术支撑。
附图说明
图1分别为正(A)、负(B)离子模式下，超高温灭菌乳和复原乳的正交偏最小二乘方差判别分析二维图。其中实心点代表超高温灭菌乳，空心点代表复原乳。
图2分别为正(A)、负(B)离子模式下，超高温灭菌乳和复原乳的正交偏最小二乘方差判别分析三维图。左边灰色点代表复原乳，右边黑色点代表超高温灭菌乳。
图3为正离子模式下判别超高温灭菌乳和复原乳的表征因子的VIP列图。
图4为负离子模式下判别超高温灭菌乳和复原乳的表征因子的VIP列图。
图5分别为正(A)、负(B)离子模式下超高温灭菌乳和复原乳的判别模型二维图；及正(C)、负(D)离子模式下判别模型的交叉验证结果图。C图和D图中R2、Q2分别是判定系数和交叉验证系数。
图6分别为正(A)、负(B)离子模式下超高温灭菌乳和复原乳的正交偏最小二乘方差判别模型三维图。左边黑色点代表超高温灭菌乳，右边灰色点代表复原乳。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。本领域技术人员应当知晓，本发明的范围不仅限于特定的实施方案，在不脱离本发明的精神下可以进行各种修饰和改变。
如未特别说明，具体实施方式中所采用的手段均为本领域常规的技术手段。
实施例1、样品的预处理
10个品牌的超高温灭菌乳，10个品牌的全脂奶粉分别购自北京的各大超市，分别取0.2mL乳样于玻璃离心管，加1ml水，涡旋5min；向其中加入3mLCHCl3:MeOH(2:1,V/V)，涡旋10min；2000rpm离心15min；取下层溶液进行氮吹；用2mL CH2Cl2:MeOH(2:1,V/V)复溶，取1mL于进样小瓶中，作为脂质样品供下一步检测使用；
每个样品取平行样5次。
实施例2两种乳中各表征因子的积分面积分析：
1)利用高分辨质谱技术进行检测：
实验所用的高分辨质谱仪型号为UPLC-Q-Exactive orbitrap massspectrometer(Thermo,CA)，正、负离子模式采用的色谱柱型号为XSelect CSH C18column，柱温箱温度为45℃。
将样品进行提脂预处理后，对脂质样品进行色谱分离-高分辨质谱分析，质谱包括MS和MS/MS；正、负离子模式采用的流动相A、流动相B分别为含10mM乙酸铵的乙腈:水(6:4体积比)、含10mM乙酸铵的异丙醇:乙腈(9:1体积比)，洗脱梯度如下所示:
步骤 总时间(min) 流速(μL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 0.00 250 63.0 37.0
1 1.50 250 63.0 37.0
2 4.00 250 55.0 45.0
3 5.00 250 48.0 52.0
4 8.00 250 42.0 58.0
5 11.00 250 34.0 66.0
6 14.00 250 30.0 70.0
7 18.00 250 25.0 75.0
8 20.00 250 2.00 98.0
质谱分析条件为：
Figure BDA0001949575490000061
Figure BDA0001949575490000071
2)不同种类乳中各峰积分、定性分析：
利用Xcalibur 3.2.63(Thermo Fisher,USA)分析软件对两种乳中峰进行提取，峰面积积分。对前体和产物离子分别采用8ppm和15ppm的质量公差。在“对齐”中进行0.25min的保留时间偏移，将各峰与本单位多年对乳特征峰研究得出的谱库比较，对乳中脂质进行定性分析。
对高分辨质谱采集的峰进行提取、过滤，通过匹配谱库，最终正离子模式下共确定509种脂质，负离子模式下确定249种脂质；
将上述定性的脂质进行积分处理，并将正、负离子模式下的积分结果利用正交偏最小二乘方差判别分析法分别进行分析，所得结果见图1、图2。通过正交偏最小二乘方差判别分析，两种乳得到很好的区分。进一步对两种模式下判别分析的VIP值(重要性投影值)进行分析，正离子模式下，提取VIP>1.5的脂质作为区别两种乳的表征因子，共计13个(表1)；负离子模式下，提取VIP>1.3的脂质作为区别两种乳的表征因子，共计12个(表2)。VIP值结果见图3、图4。
根据确定的表征因子，分别建立超高温灭菌乳和复原乳的正、负离子模式下的判别模型，所得模型见附图5、图6。并利用one-way ANOVA法对正、负离子模式下的分析各表征因子的方差显著性，见表1、表2。
使用方法：利用高分辨质谱检测未知乳样，在正、负离子模式下，分别对表1、2中脂质的峰面积进行积分，积分数值利用此模型进行判别。落在左边黑点区域即为超高温灭菌乳，落在右边灰点区域即为复原乳。
表1.正离子模式One-way ANOVA分析结果
Figure BDA0001949575490000081
表2.负离子模式One-way ANOVA分析结果
Figure BDA0001949575490000082
***代表P<0.001；b P值是由SPSS 21.0版软件计算所得；UM代表超高温灭菌乳；RM代表复原乳。
实施例3
利用高分辨质谱检测未知乳样的脂质样品，在正、负离子模式下，提取两种模式下区分两种乳的表征因子，分别对表1、2中脂质的峰面积进行积分，积分数值利用实施例2建立的模型进行判别。具体按照图5和图6，落在左边黑色点区域内即为超高温灭菌乳，落在右边灰色点区域内即为复原乳。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域科研人员对本发明的技术方案作出的各种修饰和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，其特征在于，包括步骤：
1)对超高温灭菌乳样品和复原乳样品进行提脂预处理，得到脂质样品；
2)采用高分辨质谱技术，分别对超高温灭菌乳和复原乳的脂质样品进行色谱分离-质谱扫描，包括一级扫描和二级离子碎片扫描；
3)对两种乳的脂质样品的峰进行提取、过滤，对各脂质成分进行定性分析，并对各脂质成分峰面积进行积分处理；
4)将积分结果进行正交偏最小二乘方差判别分析，确定出可将两种类型乳完全分类的表征因子；
5)利用筛选出的表征因子建立正交偏最小二乘方差判别模型，以区分超高温灭菌乳和复原乳；用色谱分离-质谱扫描未知乳样的脂质样品，基于所述正交偏最小二乘方差判别模型，对未知乳样进行鉴别；积分数值落在超高温灭菌乳区域内的判定为超高温灭菌乳，落在复原乳区域内的判定为复原乳；
所述提脂预处理为：向1体积份的超高温灭菌乳或复原乳的样品中加3～8体积份的水，涡旋；再加入10～20体积份的CHCl3和MeOH混合溶液，涡旋、离心；取下层溶液进行氮吹；用5～15体积份的CHCl3和MeOH混合溶液复溶；所述CHCl3和MeOH混合溶液中CHCl3:MeOH的体积比为2:1；
所述色谱分离的条件为：
采用的流动相A为含1～50mmol/L乙酸铵的乙腈水溶液，乙腈:水体积比为6:4，流动相B为含1～50mmol/L乙酸铵的异丙醇乙腈溶液，异丙醇:乙腈体积比为9:1；
洗脱梯度为:
Figure FDA0003292892950000011
Figure FDA0003292892950000021
质谱的条件为：正离子模式喷雾电压3.2kV，离子源温度320℃，鞘气流速35Arb,辅助气体流速10Arb；
负离子模式喷雾电压2.8kV，离子源温度320℃，鞘气流速35Arb,辅助气体流速10Arb；
正离子模式下，提取的表征因子计13个，为PC(18:0/18:1)，PE(16:0/18:1)，PE(18:0/18:1，PE(18:1/18:1)，PE(18:1/20:3，TG(15:0/10:0/14:0)，TG(16:0/8:0/18:1)，TG(4:0/10:0/15:0)，TG(4:0/11:2/16:1)，TG(4:0/8:0/15:0)，TG(6:0/14:1/18:3)，TG(6:0/15:0/18:2)，TG(6:0/18:0/18:1)；
负离子模式下，提取的表征因子12个，为12-Hydroxydodecanoic acid，16-Hydroxyhexadecanoic acid，3-Oxotetradecanoic acid，CL(18:1/18:0/18:0/18:1)，CL(22:3/16:0/18:1/18:1)，LPE(18:0)-H，LPE(18:1)，PE(16:0/18:2)，PE(18:1/14:0)，CL(18:1/16:0/18:0/18:0)-H，CL(22:3/18:1/18:1/18:1)-H，MGDG(18:1/18:1)；上述表征因子中，MGDG为脂肪酸甘油酯，PC为卵磷脂，PE为脑磷脂，TG为甘油三酯，LPE为溶血磷脂，CL为心磷脂，括号里是碳原子数。
2.根据权利要求1所述的基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，其特征在于，所述复原乳样品是用全脂奶粉，按照蛋白质含量为3.0g/100mL配制而得。
3.根据权利要求1所述的基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，其特征在于，对两种模式下判别分析的VIP值进行分析，正离子模式下，提取VIP>1.5的脂质成分作为区别两种乳的表征因子；利用单因素方差法分析各表征因子的方差显著性。
4.根据权利要求1所述的基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法，其特征在于，对两种模式下判别分析的VIP值进行分析，负离子模式下，提取VIP>1.3的脂质成分作为区别两种乳的表征因子，利用单因素方差法分析各表征因子的方差显著性。
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