CN112986430B - 一种娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物筛选方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物筛选方法及其应用,涉及液相色谱‑质谱检测技术领域。所述方法包括:(A)采用蛋白沉淀法对奶粉样品进行处理以获取代谢物;(B)利用超高效液相色谱‑高分辨质谱采集代谢组学数据;(C)对采集的代谢组学数据进行化学计量学分析,提取特征信息,建立分析模型,筛选娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉之间的差异代谢物;(D)将所述差异代谢物与对比数据库对比后得到差异标志物。所述方法基于非靶向代谢组学结合化学计量学筛选差异代谢物,能够实现对不同奶粉的快速、准确判别。
Description
技术领域
本发明涉及液相色谱-质谱检测技术领域,尤其是涉及一种娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物筛选方法及其应用。
背景技术
在我国,人们对乳品的消费由数量型向质量型转变,不仅要求乳品数量充足,而且更关心其品种、安全及质量。奶牛品种是影响奶品质的因素之一。国内大部分奶牛是荷斯坦牛,90%以上的商品奶都是荷斯坦奶牛所产。荷斯坦奶牛是源自欧洲荷兰地区的奶牛品种,荷斯坦的特点主要是产量高,适应性相对较强。娟姗牛是源自英吉利海峡杰茜岛的进口奶牛,是英国政府颁布法令保护的珍贵牛种。娟珊牛体型比荷斯坦要小,产奶量稍低。娟珊牛奶因浓稠,奶香,口感好而成为受消费者欢迎的一种高值乳。
掺假物质和掺假手段的多元化使乳及乳制品的真实性鉴别技术越来元多。按照检测目标物的不同,可以分为特异性检测方法和非特异性检测方法两大类。特异性检测方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、免疫学方法、PCR法、电泳法、光谱法等,非特异性检测方法包括凯氏定氮法、双缩脲比色法、乳粉蛋白质数字图像检测法、等电点沉淀法、电泳法、酶-比色法、分光光度法等,主要应用于蛋白质、糖类物质、防腐保鲜类的物质的检测。急需开发一种准确鉴别牛奶奶源或牛奶是否掺假的方法,以维护市场公平,保护消费者权益。
代谢组学技术是指同时分析一个生物样品所有代谢物特征的技术,用在食品分析上,为食品的质量、安全性和真实性等直接相关的潜在生物标志物以及化学污染物提供了重要的分析手段。代谢组学技术尤其是非靶向代谢组学可以方便的找到两个或几个样品的组成成分差异特征,然后根据这种差异特征一方面可以实现几个样品的鉴别。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物筛选方法及其应用。所述方法基于非靶向代谢组学结合化学计量学筛选差异代谢物,能够实现对不同奶粉的快速、准确判别。
本发明提供的技术方案如下:
一种娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物筛选方法,所述方法包括:
(A)采用蛋白沉淀法对奶粉样品进行处理以获取代谢物;
(B)利用超高效液相色谱-高分辨质谱采集代谢组学数据;
(C)对采集的代谢组学数据进行化学计量学分析,提取特征信息,建立分析模型,筛选娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉之间的差异代谢物;
(D)将所述差异代谢物与对比数据库对比后得到差异标志物。
在一个实施方案中,步骤(A)包括以下步骤:
(a)将奶粉样品溶于去离子水中,离心;
(b)取中层清液与有机溶剂混合,涡旋震荡后二次离心,取上清液过滤,获得所述代谢物。
在一个实施方案中,步骤(a)中,将每0.3~0.8g奶粉样品溶于1.8~2.5mL去离子水中,在4000~6000r/min下离心20min~30min;
步骤(b)中,所述中层清液与所述有机溶剂的体积比为1:4~1:2;所述有机溶剂选自乙腈;
所述二次离心在8500~9500r/min条件下离心8-12min。
优选地,步骤(a)中的离心在温度4℃,转速为5000r/min条件下,离心20min。
优选地,步骤(b)中,中层清液与所述有机溶剂的体积比为1:3;所述有机溶剂优选乙腈。
在一个实施方案中,所述上清液过滤采用滤膜过滤,优选为0.22μm滤膜。
在一个实施方案中,步骤(B)中,所述超高效液相色谱以流动相A和流动相B进行梯度洗脱;
正离子模式下,流动相A的组成为:含0.1~0.2%甲酸的水溶液:流动相B的组成为:含0.1~0.2%甲酸的乙腈溶液;
负离子模式下,流动相A的组成为:4~6mM乙酸铵的水溶液:流动相B的组成为:4~6mM乙酸铵的乙腈溶液;
优选地,所述梯度洗脱的程序如下:
0~1min时,98%流动相A;
1~5min时,流动相B从2%升至10%;
5~8min时,流动相B从10%升至30%;
8~12min时,流动相B从30%升至95%;
12~16min时,95%流动相B;
16.1~20min时,98%流动相A;
以上各流动相数值参数可在该数值参数±5%的范围内波动;
更优选地,所述梯度洗脱的流速为0.4mL/min。
在一个实施方案中,所述超高效液相色谱使用C18色谱柱。优选地,所述C18色谱柱为30×150,1.8μm。
在一个实施方案中,柱温为35℃~45℃,优选40℃。
在一个具体的实施方案中,所述超高效液相色谱以流动A和流动相B进行梯度洗脱;所述流动相A的组成为:正离子模式为含0.1%甲酸的水溶液,负离子模式为含5mM乙酸铵的水溶液;所述流动相B的组成为:正离子模式为含0.1%甲酸的乙腈溶液,负离子模式为含5mM乙酸铵的乙腈溶液。
在一个实施方案中,步骤(B)中,所述高分辨质谱为四极杆飞行时间高分辨率质谱,质谱的条件为以下至少一个:
(1)雾化气为50psi;
(2)辅助干燥气为50psi;
(3)气帘气为5psi;
(4)温度为500℃;
(5)喷雾电压:正离子模式为5000V,负离子模式为-4500V;
(6)去簇电压:正离子模式为80V,负离子模式为-80V;
其中上述条件中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10%。
在一个实施方案中,数据采集范围为50-1000Da。
在一个实施方案中,所述代谢组学数据包括在进行基线校正、峰提取、峰校正,标准化和归一化后获得的代谢物相对峰面积和保留时间。
具体地,代谢组学数据包括所有代谢物的相对峰面积与保留时间。
具体地,对采集的数据进行预处理,所述预处理包括基线校正,峰提取,峰校正,标准化和归一化,获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间,变异系数将超过30%化合物剔除;缺失值超过50%的特征值剔除,其余的缺失值采用该特征值在所有样品中的最小值的1/2进行填充。
进一步地,基于主成分分析判断两组样品是否存在差异,基于正交偏最小二乘分析模型获得差异标志物。
具体地,基于正交偏最小二乘分析的分析模型,以变量重要性(VIP)>1,显著性水平(P value)<0.05,差异倍数(FC)>1.25或者差异倍数<0.80作为门槛值获取潜在差异标志物。
在一个实施方案中,步骤(C)中,所述化学计量学分析包括显著性分析、差异倍数分析、主成分分析和正交偏最小二乘分析。在化学计量学分析中通过正、负离子模式娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉进行潜在的差异标志物获取。
所述分析模型为使用差异标志物构建PCA class模型。
在一个实施方案中,所述方法还包括检验所述PCA class模型的准确度。
在具体的实施方案中,可多次使用PCA主成分分析以检测分组是否合理,标志物是否更优。
在一个实施方案中,步骤(C)中,所述差异代谢化合物的筛选条件包括:P value<0.05,变化倍数(Fold Change)>1.25或者<0.8,VIP>1。
在一个实施方案中,步骤(D)中,所述对比数据库为牛奶代谢组学数据库(TheMilk Composition Database,MCDB)。在于MCDB代谢库对比后得到差异标志物。
在另一个方面,本发明还提供了所述方法筛选得到的差异标志物在鉴别娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉中的应用。以差异代谢化合物为鉴别娟珊牛奶和常规牛奶的差异标志物。
有益效果:
本发明的方法为筛选娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物提供了一种精确的方法,该方法方便、灵敏,通过分析模型筛选差异标志物能够实现对牛奶奶源或牛奶种类的快速判别。
本发明的筛选方法基于非靶向代谢组学的分析,在正离子模式下筛选到13种差异标志物,在负离子模式下筛选到8种差异标志物在两种奶粉之间存在显著差异,借由此可以建立判别模型,准确判别娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉,结果可靠。
本发明对奶粉代谢组信息的采集和分析方法进行了大量的优化,尤其是通过前处理过程以及合适的色谱质谱条件,广泛地检测了奶粉代谢物,提高了结果的可信度和准确度。
本发明的方法操作简单,结果稳定,本发明的方法在奶源以及奶粉种类的鉴别和质量控制方面有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的代谢组质谱图(ESI+为正离子模式下的质谱图;ESI-为负离子模式下的质谱图);
图2为本发明实施例提供的娟珊牛奶代谢组与荷斯坦牛奶组代谢组PCA分析得分图(其中JS指娟珊牛奶代谢组,HST指荷斯坦牛奶代谢组);
图3为本发明实施例提供的娟珊牛奶代谢组与荷斯坦牛奶组代谢组OPLS-DA分析得分图;
图4为本发明实施例提供的荷斯坦牛奶代谢组与娟珊牛奶代谢组的PCA-class模型;
图5为本发明提供的娟珊牛奶与荷斯坦牛奶盲样验证图(其中M-JS、M-HST代表盲样)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
娟珊牛奶和荷斯坦牛奶的差异标志物筛选过程:
1.样本信息
样品选择冻干奶粉,包括:娟珊牛奶样品12份,荷斯坦牛奶样品12份。
2.样品前处理
精确称取0.50g(精确到0.01g)样品于10mL离心管中,加入2mL去离子水,颠倒混匀;于4℃5000rpm离心20min,转移1mL中层液体(即不移取上层的脂肪层和下层的沉淀)于另一干净离心管中;加入3mL乙腈,涡旋震荡10min;于4℃9000rpm离心10min,取上清液过0.22μm滤膜,上机检测。
3.超高液相色谱-高分辨质谱串联分析
色谱条件:SCIEX ExionLCTM系统,色谱柱Agilent Eclipse Plus C18(30×150,1.8um);
柱温:40℃;
进样量:5μL;
流速:0.4mL/min。
流动相A的组成为:正离子模式为含0.1%甲酸的水溶液,负离子模式为含5mM乙酸铵的水溶液;
流动相B的组成为:正离子模式为含0.1%甲酸的乙腈溶液,负离子模式为含5mM乙酸铵的乙腈溶液;
色谱洗脱条件:
0~1min时,98%流动相A;
1~5min时,流动相B从2%升至10%;
5~8min时,流动相B从10%升至30%;
8~12min时,流动相B从30%升至95%;
12~16min时,流动相B 95%;
16.1~20min时,98%流动相A;各数值参数可在±5%的范围内波动;
质谱条件:SCIEX Triple TOFTM 6600系统;
电喷雾离子源参数设置如下:雾化气(GS1),50psi;辅助干燥气(GS2),50psi;气帘气(CUR),25psi;温度(TEM),500℃;喷雾电压(ISVF),5000V(正离子模式)或-4500V(负离子模式);去簇电压(DP),80V(正离子模式)或-80V(负离子模式)。
本实验采用IDA数据采集方法,在每个数据采集循环中,筛选强度最强且大于50的母离子采集其对应的二级质谱数据。一个循环设定的时间为560ms,包括了1个TOF-MS扫描和12个MS2扫描。其中TOF-MS扫描时间为150ms,质量检测范围为50-1000Da;每个MS2扫描时间为30ms,质量检测范围为50-1000Da,且MS2谱图均在High Sensitivity模式下采集,碰撞能量(CE)为30±15Ev,质谱图见图1。
4.主成分分析
使用Peakview 2.2软件(AB Sciex,USA)对原始数据进行预处理,包括基线校正、峰提取、峰校正、标准化和归一化,获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间。将处理后的数据导入Excel中,计算QC样品的变异系数(CV%)将超过30%的化合物剔除,缺失值超过50%的特征值剔除,其余的缺失值采用该特征值在所有样品中的最小值的一半进行填充,获得两组样品的代谢组学数据。
对所述代谢组学数据进行主成分分析(见图2),观察到娟珊牛奶组与荷斯坦牛奶组能够较好的区分。
5.差异标志物筛选分析
对上述两组样品的代谢组学数据进行正交偏最小二乘法判别分析(见图3),观察到娟珊牛奶与荷斯坦牛奶组能够较好的区分。
计算代谢物的娟珊牛奶和荷斯坦牛奶的组间差异倍数(Fold change,FC),并对预处理后的数据进行显著性分析。采用正交偏最小二乘分析法(图2)分析娟珊牛奶和荷斯坦牛奶中潜在差异性代谢标志物。通过变量重要性(VIP>1)、显著性水平(P value<0.05)以及差异倍数(FC>1.25或者<0.8)进行过滤,获得具有显著性差异的代谢化合物。
接着使用Peakview 2.2软件获得MS2碎片数据,与Metlin小分子代谢物数据库以及在线开源牛奶代谢数据库(MCDB)中的碎片信息进行比对,从而确证化合物。最终共鉴定出21种差异性代谢标志物(表1)。
表1差异代谢物定性分析表
负离子模式下8种:吡咯2-羧酸(Pyrrole 2-carboxylic acid)、辛酸(Caprylicacid)、乳清酸(Orotic acid)、2-癸烯酸(2-Decylenic acid)、4-丙酮酸(4-Pyridoxicacid)、十二烷基硫酸盐(Lauryl sulfate)、芹菜素(Apigenin)以及尿苷二磷酸(Uridinediphosphate);
正离子模式下13种:马尿酸(Hippuric Acid)、哌啶酸(Pipecolic acid)、脯氨酸甜菜碱(Proline betaine)、氨甲环酸(Tranexamic acid)、7-甲基鸟嘌呤(7-Methylguanine)、尿酸(Uric acid)、苯乙酰甘氨酸(Phenylacetylglycine)、泛酸(Pantothenic acid)、丁酰左旋肉碱(Butyryl-L-carnitine)、16-羟基十六烷酸(16-Hydroxyhexadecanoic acid)、表雄酮(Epiandrosterone)、二十三烷酸(Tricosanoicacid)以及哌啶(Piperidine)。
6.基于差异代谢物的判别分析
采用超高液相色谱-高分辨质谱串联分析对娟珊牛奶和荷斯坦牛奶样品进行非靶向代谢组学数据采集。
采用表1中的代谢化合物作为差异标志物建立PCA Class分类模型,通过ROC曲线检验模型的可靠程度,其中AUC值均为1,说明分组PCA Class能够对样本进行有效判别(图4)。图5为本发明提供的娟珊牛奶与荷斯坦牛奶盲样验证图(其中M-JS、M-HST代表盲样),说明PCA Class分类模型能够将盲样进行判别,判别准确率为100%。即以上述代谢化合物为标志物鉴别娟珊牛奶和荷斯坦牛奶有很高的准确率。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉的差异标志物筛选方法,其特征在于,所述方法包括:
(A)采用蛋白沉淀法对奶粉样品进行处理以获取代谢物;
(B)利用超高效液相色谱-高分辨质谱采集代谢组学数据;
(C)对采集的代谢组学数据进行化学计量学分析,提取特征信息,建立分析模型,筛选娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉之间的差异代谢物;
(D)将所述差异代谢物与对比数据库对比后得到差异标志物;
步骤(B)中,所述超高效液相色谱使用C18色谱柱,所述超高效液相色谱以流动相A和流动相B进行梯度洗脱;正离子模式下,流动相A的组成为:含0.1~0.2%甲酸的水溶液:流动相B的组成为:含0.1~0.2%甲酸的乙腈溶液;负离子模式下,流动相A的组成为:4~6 mM乙酸铵的水溶液:流动相B的组成为:4~6 mM乙酸铵的乙腈溶液;
所述梯度洗脱的程序如下:
0~1 min时,98%流动相A;1~5 min时,流动相B从2%升至10%;5~8 min时,流动相B从10%升至30%;8~12 min时,流动相B从30%升至95%;12~16 min时,95%流动相B;16.1~20min时,98%流动相A;以上各流动相数值参数可在该数值参数±5%的范围内波动;所述梯度洗脱的流速为0.4 mL/min;
步骤(B)中,所述高分辨质谱为四极杆飞行时间高分辨率质谱,质谱的条件为以下:
(1)雾化气为50psi;(2)辅助干燥气为50psi;(3)气帘气为5psi;
(4)温度为500℃;(5)喷雾电压:正离子模式为5000V,负离子模式为-4500V;(6)去簇电压:正离子模式为80V,负离子模式为-80V;其中上述条件中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10%;
所述差异代谢物在负离子模式下8种:吡咯2-羧酸、辛酸、乳清酸、2-癸烯酸、4-丙酮酸、十二烷基硫酸盐、芹菜素以及尿苷二磷酸;
所述差异代谢物在正离子模式下13种:马尿酸、哌啶酸、脯氨酸甜菜碱、氨甲环酸、7-甲基鸟嘌呤、尿酸、苯乙酰甘氨酸、泛酸、丁酰左旋肉碱、16-羟基十六烷酸、表雄酮、二十三烷酸以及哌啶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(A)包括以下步骤:
(a)将奶粉样品溶于去离子水中,离心;
(b)取中层清液与有机溶剂混合,涡旋震荡后二次离心,取上清液过滤,获得所述代谢物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(a)中,将每0.3~0.8 g奶粉样品溶于1.8~2.5 mL去离子水中,在4000~6000 r/min下离心20 min~30 min;
步骤(b)中,所述中层清液与所述有机溶剂的体积比为1:4~1:2;所述有机溶剂选自乙腈;
所述二次离心在8500~9500 r/min条件下离心8-12 min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述代谢组学数据包括在进行基线校正、峰提取、峰校正,标准化和归一化后获得的代谢物相对峰面积和保留时间。
5.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于,步骤(C)中,所述化学计量学分析包括显著性分析、差异倍数分析、主成分分析和正交偏最小二乘分析;
所述分析模型为使用差异标志物构建PCA class模型。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(C)中,所述差异代谢化合物的筛选条件包括:P value<0.05,变化倍数>1.25或者变化倍数<0.8,VIP>1。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(D)中,所述对比数据库为牛奶代谢组学数据库。
8.权利要求1~7任一项所述方法筛选得到的差异标志物在鉴别娟珊牛奶粉和荷斯坦牛奶粉中的应用。
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