CN113984935B - 基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，本发明采集产乙酸嗜蛋白菌从生长初期到生长稳定期的菌液，通过液相色谱‑质谱联用技术确定主要代谢物成分，通过对高质量数据的比较，进一步分析得到产乙酸嗜蛋白菌生长中的差异代谢物，通过对差异代谢物之间的相关性分析和富集通路分析，根据显著富集通路中的差异代谢物转换路径，明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性，本申请能够为了解产乙酸嗜蛋白菌的生理学过程提供一个重要途径，为从分子水平研究微生物功能提供新思路，并为细菌类的代谢组学研究提供一种可行方案，为产乙酸嗜蛋白菌代谢调控机制的研究提供突破口。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法。
背景技术
产乙酸嗜蛋白菌为棒状，是革兰氏阴性的厌氧蛋白降解菌，可以将酵母提取物、蛋白胨、丙酮酸、甘氨酸和L-精氨酸作为碳源；能够利用酵母提取物、蛋白胨、丙酮酸以及其他复杂的底物反应生成乙酸。然而与产乙酸嗜蛋白菌有关的文献或报道相对较少。根据已有文献记载，该菌起初是从UASB(上流式厌氧污泥床)反应器处理啤酒废水的颗粒污泥中分离得到的，其利用底物转化和代谢的机制依旧不明确。
综上，分析产乙酸嗜蛋白菌的代谢物质，对研究该细菌的生长代谢过程具有重要参考意义。
发明内容
本发明的目的在于提供基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
包括以下步骤：
S1：接种产乙酸嗜蛋白菌，取菌液样本，使用甲醇提取法处理样本；
S2：对菌液样本进行分析，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据，确定产乙酸嗜蛋白菌的代谢物成分；
S3：对质谱分析得到的原始数据进行分析，设置筛选条件，得到高质量数据；
S4：建立PLS-DA模型对高质量数据进行比较，筛选产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物；
S5：对差异代谢物进行相关性分析和代谢路径分析，明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
进一步地，包括以下步骤：
S1：制备培养液，将产乙酸嗜蛋白菌接种至培养液中，使用甲醇提取法处理菌液样本以及对照样本，并设置质控样本；
S2：将菌液样本和质控样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据A，将对照样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据B；
S3：对质谱分析得到的原始数据A、原始数据B进行分析，将菌液样本和对照样本中检测到的色谱峰进行积分，用总峰面积对相对定量结果标准化，得到代谢物的相对定量结果，设置筛选条件进行初筛，得高质量数据A和高质量数据B；
S4：采用PLS-DA模型对高质量数据A和高质量数据B进行比较，根据PLS-DA模型中的筛选条件，筛选出产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物；
S5：对差异代谢物进行相关性分析和差异代谢物的路径分析，得到产乙酸嗜蛋白菌的显著富集通路，根据显著富集通路中的差异代谢物转换路径，明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
进一步地，所述S3步骤中，筛选条件设置为：mzCloud best match≥85.00，分子准确质量数的最大偏差在5ppm内，峰面积≥2×106、两组间的倍数变化FC>2或<0.5和 P-value<0.05。
进一步地，所述代谢路径分析是通过KEGG数据库搜索产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物，得到差异代谢物的所有相关代谢路径，满足条件时，则该通路为KEGG富集通路，借助超几何检验方法，得到通路富集的P-value值，满足阈值条件即为产乙酸嗜蛋白菌差异代谢物中显著富集的KEGG通路，通过KEGG通路富集分析能确定差产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
进一步地，所述KEGG富集通路满足条件为：x/n>y/N，其中，N为所有代谢物中参与KEGG代谢通路的代谢物数目，n为N中差异代谢的数目，y为注释到某个KEGG通路的代谢物数目，x为富集到某个KEGG通路的差异代谢物数目。
进一步地，所述阈值条件为P-value≤0.05。
进一步地，所述PLS-DA模型筛选条件为：第一主成分的变量投影重要度>1和 P-value<0.05。
进一步地，所述甲醇提取法为；用80％冷甲醇配制浓度为1mg/mL的2-氯-L-苯丙氨酸作为内标液，在菌液样本中加入4μL的1mg/mL的2-氯-L-苯丙氨酸，在菌液样本和对照样本中加入296μL的80％冷甲醇，涡旋10s，冰水浴中超声10min，重复3次，在-20℃下静置0.5h，在4℃，15000g离心力下离心10min，收集上清液。
进一步地，所述质控样本设定方法为：将经过甲醇提取法处理的菌液样本和对照样本 1:1混合均匀，所述对照样本为不接种产乙酸嗜蛋白菌的培养液，同时用80％冷甲醇设置为空白样本。
进一步地，所述模型建立完成后，应完成200次的置信检验。
进一步地，所述样本的进样体积为300μL，所以在色谱进样瓶内安放内衬管，方便进样，同时进样针的进样深度设置为0.6cm，以防进样针触及管底。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明提供基于色谱-质谱联用和生信分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，本发明采用液相色谱-质谱联用技术分别对产乙酸嗜蛋白菌从生长初期到生长稳定期的菌液样品和未接种细菌的培养液样品进行分析，不接种细菌的培养液是细菌生长需要的底物，里面的成分基本上被细菌代谢转化所消耗，也有些成分可能与细菌的代谢产物一样，通过与不接种细菌的培养液比较能够清楚知道整个过程中哪些物质被消耗，哪些物质是逐渐积累。筛选出产乙酸嗜蛋白菌生长过程中的差异代谢物，通过对差异代谢物进行相关性分析、代谢路径分析，能够整体且综合的分析出产乙酸嗜蛋白菌的底物转化和代谢路径，确定产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
本发明的方法能够为产乙酸嗜蛋白菌的生长代谢机理提供重要的理论依据，并为细菌类的代谢组学研究提供一种可行方案，为产乙酸嗜蛋白菌代谢调控机制的研究提供突破口。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是质控样本相关性分析图；
图2是PCA得分图；
图3是产乙酸嗜蛋白菌生长1天的菌液样本与对照样本的PLS-DA模型；
图4是产乙酸嗜蛋白菌生长1天的菌液样本与对照样本的置信检验结果；
图5是产乙酸嗜蛋白菌生长2天的菌液样本与对照样本的PLS-DA模型；
图6是产乙酸嗜蛋白菌生长2天的菌液样本与对照样本的置信检验结果；
图7是产乙酸嗜蛋白菌生长3天的菌液样本与对照样本的PLS-DA模型；
图8是产乙酸嗜蛋白菌生长3天的菌液样本与对照样本的置信检验结果；
图9是产乙酸嗜蛋白菌生长4天的菌液样本与对照样本的PLS-DA模型；
图10是产乙酸嗜蛋白菌生长4天的菌液样本与对照样本的置信检验结果；
图11是产乙酸嗜蛋白菌生长5天的菌液样本与对照样本的PLS-DA模型；
图12是产乙酸嗜蛋白菌生长5天的菌液样本与对照样本的置信检验结果；
图13是总差异代谢物的聚类相关性热图；
图14是主要差异代谢物的代谢路径图。
图中：Leucine-亮氨酸、Isoleucine-异亮氨酸、L-Phenylalanine-L-苯丙胺酸、L-Valine-L-缬氨酸、Spermine-精胺、L-Glutamic acid-L-谷氨酸、L-Threonine-L- 苏氨酸、Choline-胆碱、L-Histidine-组氨酸、L-(+)-Ornithine-鸟氨酸、Guanine-鸟嘌呤、Glycyl-L-Leucine-甘氨酸-L-亮氨酸、Cytosine-胞嘧啶。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：实验样品具体来源：产乙酸嗜蛋白菌(Proteiniphilum acetatigenes)购自中国菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，CGMCC 编号为1.5024。
包括以下步骤：
S1：将5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液和1L蒸馏水混合均匀，调节pH至7.2，即得培养液，将产乙酸嗜蛋白菌接种至培养液中，生长温度为37℃；
S2：在每天同一时间收集产乙酸嗜蛋白菌菌液样本，每天收集3次，共5天；
S3：(1)取100μL甲酸，加甲醇定容至8mL，再加纯水定容至10mL即为80％甲醇(含0.1％的甲酸)，称取10mg2-氯-L-苯丙氨酸加入到80％甲醇(含0.1％甲酸)作为内标液；
(2)向100μL的样本菌液中，加入4μL内标液，296μL的80％冷甲醇(含0.1％的甲酸)；涡旋10s，冰水浴中超声10min，重复3次，在-20℃下静置0.5h，在4℃，15000g离心力下离心10min，收集上清液；
(3)向对照样本中加入296μL的80％冷甲醇(含0.1％的甲酸)，涡旋10s，冰水浴中超声10min，重复3次，在-20℃下静置0.5h，在4℃，15000g离心力下离心10min，收集上清液；
S4：吸取经过甲醇提取法处理的菌液样本和对照样本各5μL，混合均匀，即为质控样本，对照样本为不接种产乙酸嗜蛋白菌的培养液，空白样本为200μL的80％冷甲醇(含0.1％的甲酸)；
S5：进样，菌液样本按照时间顺序排列，每个菌液样本之间放一个质控样本，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据A，将对照样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据B，空白样本用于消除冷甲醇(含0.1％的甲酸)对实验结果的干扰；
S6：设定液相色谱-质谱联用技术的测试方法，具体为：(1)色谱条件：色谱柱为BEHC18柱(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm，waters)，正离子模式：流动相A，0.1％甲酸，流动相B，乙腈；负离子模式：流动相A，乙酸铵，流动相B，乙腈；梯度洗脱程序为初始5％B， 3min至20％，至9min线性增长至95％，保持4min，0.1min后恢复至5％B，平衡至16min；样品池温度：15℃；柱温：40min；流速：0.2mL/min；进样量10μL；(2)质谱条件：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，扫描范围：70-1050m/z；喷涂电压为3.2kV； MS/MS二级扫描：ddMS2，设定完毕后，开始检测；
S7：将质谱分析得到的原始数据A和原始数据B导入Compound Discoverer3.1软件，将菌液样本和对照样本中检测到的色谱峰进行积分，每个特征峰的峰面积代表一个代谢物的相对定量值，用总峰面积对相对定量结果标准化，最后得到代谢物的相对定量结果，设置筛选条件按照mzCloud best match≥85.00，分子准确质量数的最大偏差在5ppm内，峰面积≥2×106、两组间的倍数变化FC>2或<0.5和P-value<0.05的筛选条件对代谢进行初筛，筛去中低质量的峰值数据，得到高质量数据A和高质量数据B；
S8：采用PLS-DA模型将高质量数据A与高质量数据B进行比较，根据PLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度>1，筛选出产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物；
S9:将筛选出的所有差异代谢物进行相关性分析和KEGG代谢路径分析，代谢路径分析设定的条件为：设定N为所有代谢物中参与KEGG代谢通路的代谢物数目，n为N中差异代谢的数目，y为注释到某个KEGG通路的代谢物数目，x为富集到某个KEGG通路的差异代谢物数目，若满足比值条件x/n>y/N，则该通路为KEGG富集通路，借助超几何检验方法，得到通路富集的P-value值，其中以P-value≤0.05为阈值，满足此条件的KEGG 通路定义为在差异代谢物中显著富集的KEGG通路，通过显著富集的KEGG通路中的差异代谢物转化过程明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
实验数据
将实施例1进行数据分析，实验结果如下表所示。
表1产乙酸嗜蛋白菌差异代谢物的KEGG Pathway富集结果(显著富集通路部分)
由图1可知，QC样本之间相关性系数均大于0.97，接近于1，说明仪器稳定性好，数据可靠。
将高质量数据代入SIMCA14.1分析软件中进行PCA主要成分分析，从图2可以看出各个组别的离散程度，其中PA1组(第一天)与PA0组(对照样本)比较接近，之后几天均与PA0组偏离。
根据图3、4可知，PLS-DA模型第一主成分分离度好，其200次置信检验结果为R2＝0.916，说明模型解释和可靠性好，由该模型变量的VIP值，筛选出PA1组(第一天)与PA0组(对照样本)之间的差异代谢物。
根据图5、6可知，PLS-DA模型第一主成分分离度好，其200次置信检验结果为R2＝0.936，说明模型解释和可靠性好，由该模型变量的VIP值，筛选出PA2组(第二天)与PA0组(对照样本)之间的差异代谢物。
根据图7、8可知，PLS-DA模型第一主成分分离度好，其200次置信检验结果为R2＝0.85，说明模型解释和可靠性好，由该模型变量的VIP值，筛选出PA3组(第三天)与PA0组(对照样本)之间的差异代谢物。
根据图9、10可知，PLS-DA模型第一主成分分离度好，其200次置信检验结果为 R2＝0.818，说明模型解释和可靠性比较好，由该模型变量的VIP值，筛选出PA4组(第四天)与PA0组(对照样本)之间的差异代谢物。
根据图11、12可知，PLS-DA模型第一主成分分离度好，其200次置信检验结果为 R2＝0.751，说明模型解释和可靠性比较好，由该模型变量的VIP值，筛选出PA5组(第五天)与PA0组(对照样本)之间的差异代谢物。
综上，总差异代谢物有：L-Leucine、L-Valine、L-Isoleucine、L-Threonine、L-Phenylalanine、L-Histidine、L-Glutamic acid、L-Ornithine、Choline、 Glycyl-L-leucine、Adenosine、Spermine、Guanine和Cytosine。
图13为差异代谢物的聚类相关性热图，由白变黑为一个下调趋势，从图中可知道差异代谢物的总体变化趋势。
根据表1富集结果所得到的KEGG pathway可知：Valine,leucine and isoleucinedegradation(Map00280)；Valine,leucine and isoleucine biosynthesis(Map00290)；Protein digestion and absorption(Map04974)这3个pathway为产乙酸嗜蛋白菌通过厌氧发酵将蛋白分解成氨基酸继而代谢生成乙酸的主要路径。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：制备培养液，将产乙酸嗜蛋白菌接种至培养液中，使用甲醇提取法处理菌液样本以及对照样本，并设置质控样本；其中，培养液的制备方法为：将5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液和1L蒸馏水混合均匀，调节pH至7.2；甲醇提取法为：用80％冷甲醇配制浓度为1mg/mL的2-氯-L-苯丙氨酸作为内标液，在菌液样本中加入4μL的1mg/mL的2-氯-L-苯丙氨酸，在菌液样本和对照样本中分别加入296μL的80％冷甲醇，涡旋10s，冰水浴中超声10min，重复3次，在-20℃下静置0.5h，在4℃，15000g离心力下离心10min，收集上清液，所述冷甲醇中均含有0.1％甲酸；
S2：将菌液样本和质控样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据A，将对照样本进样，通过液相色谱-质谱联用技术分析得到原始数据B；设定液相色谱-质谱联用技术的测试方法，具体为：
（1）色谱条件：色谱柱为BEH C18柱，100mm×2.1mm i.d.，1.7μm，waters；
正离子模式：流动相A，0.1％甲酸，流动相B，乙腈；
负离子模式：流动相A，乙酸铵，流动相B，乙腈；
梯度洗脱程序为初始5％B，3min至20％，至9min线性增长至95％，保持4min，0.1min后恢复至5％B，平衡至16min；样品池温度：15℃；
柱温：40℃；
流速：0.2mL/min；
进样量10μL；
（2）质谱条件：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式；
扫描范围：70-1050m/z；
喷涂电压为3.2kV；
MS/MS二级扫描：ddMS2；
S3：对质谱分析得到的原始数据A、原始数据B进行分析，将菌液样本和对照样本中检测到的色谱峰进行积分，用总峰面积对相对定量结果标准化，得到代谢物的相对定量结果，设置筛选条件进行初筛，得高质量数据A和高质量数据B；
S4：采用PLS-DA模型对高质量数据A和高质量数据B进行比较，根据PLS-DA模型中的筛选条件，筛选出产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物；其中，总差异代谢物有L-Leucine、L-Valine、L-Isoleucine、L-Threonine、L-Phenylalanine、L-Histidine、L-Glutamic acid、L-Ornithine、Choline、Glycyl-L-leucine、Adenosine、Spermine、Guanine和Cytosine；
S5：对差异代谢物进行相关性分析和差异代谢物的路径分析，得到产乙酸嗜蛋白菌的显著富集通路，根据显著富集通路中的差异代谢物转换路径，明确产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
2.根据权利要求1所述的基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：所述S3步骤中，筛选条件设置为：mzCloud best match≥85.00，分子准确质量数的最大偏差在5ppm内，峰面积≥2×106、两组间的倍数变化FC>2或y/N，其中，N为所有代谢物中参与KEGG代谢通路的代谢物数目，n为N中差异代谢的数目，y为注释到某个KEGG通路的代谢物数目，x为富集到某个KEGG通路的差异代谢物数目。
3.根据权利要求1所述的基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：所述代谢路径分析是通过KEGG数据库搜索产乙酸嗜蛋白菌的差异代谢物，得到差异代谢物的所有相关代谢路径，满足条件时，则该通路为KEGG富集通路，借助超几何检验方法，得到通路富集的P-value值，满足阈值条件即为产乙酸嗜蛋白菌差异代谢物中显著富集的KEGG通路，通过KEGG通路富集分析能确定差产乙酸嗜蛋白菌的代谢特性。
4.根据权利要求3所述的基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：所述KEGG富集通路满足条件为：x/n>y/N，其中，N为所有代谢物中参与KEGG代谢通路的代谢物数目，n为N中差异代谢的数目，y为注释到某个KEGG通路的代谢物数目，x为富集到某个KEGG通路的差异代谢物数目。
5.根据权利要求3所述的基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：所述阈值条件为P-value≤0.05。
6.根据权利要求1所述的基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：所述PLS-DA模型筛选条件为：第一主成分的变量投影重要度>1和P-value＜0.05。
7.根据权利要求1所述的基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法，其特征在于：所述质控样本设定方法为：将经过甲醇提取法处理的菌液样本和对照样本1:1混合均匀，所述对照样本为不接种产乙酸嗜蛋白菌的培养液，同时用80％冷甲醇设置为空白样本，所述冷甲醇中含0.1％甲酸。
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