CN111855831A - 大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法 - Google Patents

大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，包括采用超高效液相色谱串联质谱检测NRK‑49F细胞纤维化和单侧输尿管结扎诱发的肾纤维化及大黄酸与姜黄素联用干预后的内源性代谢产物，获得指纹图谱；利用多元统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出8显著发生变化的代谢物，作为与肾纤维化发生潜在相关差异代谢物；通过Metaboanalyst富集出与肾纤维化相关的3条代谢通路。本发明利用细胞和大鼠尿液代谢组学方法研究肾纤维化发生发展过程及大黄酸和姜黄素联用治疗过程中相关的内源性代谢变化，有助于揭示肾纤维化疾病发生发展机制，以及揭示治疗过程中联用所调控的异常代谢网络。

Description

大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路 及研究方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法。
背景技术
慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)是一类慢性肾脏结构及功能障碍性疾病，是全球范围内的公共健康问题之一。近年来慢性肾病发病率估计在11％～13％，严重影响人体健康，同时给患者和社会带来了沉重的经济负担与压力。肾间质纤维化是各种肾慢性疾病发展到终末期的共同生理过程。研究发现，肾间质纤维化的成因复杂多样，例如肾成纤维细胞活化和增殖、上皮细胞-间充质的转换失衡等。预防和延缓肾间质纤维化是治疗慢性肾病的重要治疗策略。目前，临床上针对肾间质纤维化尚无特效药物，对其病程的评估主要采取创伤的肾活检。然而，活组织检查是一种侵入性手术，可导致严重的并发症，对医生的操作水平也要求较高。因此，如何对肾间质纤维化病程进行方便高效的早期诊断以及开发有效的治疗策略，是治疗慢性肾病的关键。
1999年由Nicholson教授首次提出代谢组学(metabonomics)概念，它被定义为定量测定生物系统对生理刺激以及基因改变产生的多参数代谢的动态应答。代谢组学分析是鉴定和量化给定样品中所有代谢物的过程，可以检测到单个样品中成百上千种代谢物，内源性和外源性代谢物均可通过代谢组学检测，使用代谢组学鉴定的多种代谢物被称为代谢组。代谢组学最早应用在筛选疾病的生物标志物研究，结合多元统计分析，可以将治疗组、疾病模型组和空白组的代谢轮廓可视化，分析代谢轮廓的变化以及辨识组间显著差异的内源性代谢物。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，利用细胞代谢组学和尿液代谢组学方法研究肾纤维化及其治疗过程中相关的代谢变化，有助于揭示慢性肾病的发病机制，以及阐明治疗过程中大黄酸和姜黄素联用所调控的异常代谢网络。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，包括：采用超高效液相色谱串联质谱检测NRK-49F细胞和单侧输尿管结扎(UUO)引发的大鼠肾间质纤维化及大黄酸和姜黄素联用的内源性代谢产物，获得UPLC指纹图谱；
利用PCA、OPLS-DA等模式识别方法，分别细胞和大鼠尿液中从多个变量中筛选并鉴定出3个和5个显著发生变化的内源性代谢物，作为肾纤维化发生潜在相关差异代谢物；
通过Metaboanalyst 4.0软件富集出肾纤维化及其治疗相关的3条代谢通路。
作为优选的，所述的大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，获得大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)大黄和姜黄素的制备
将大黄酸(25mg/kg)和姜黄素(25mg/kg)溶解在CMC-Na制备。
(2)细胞和动物模型的确定
NRK-49F细胞的纤维化过程通过TGF-β1诱导：NRK-49F细胞培养于含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。TGF-β1溶于过滤的蒸馏水中至浓度为50mg/mL，并将其储存在-20℃。在每次实验之前，将TGF-β1的储备溶液用含有2mg/mL BSA的磷酸盐缓冲盐水稀释至10ng/mL。
雄性SD大鼠30只，每组6只，共5组，体重220-250g，由温州医科大学动物实验中心提供。将SD大鼠随机分别为sham组、UUO模型组、给药组：大黄酸给药组、姜黄素给药组、联合给药组。UUO模型的建立：模型组和给药组进行单侧输尿管结扎手术，用10％的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，将大鼠手术处剃毛，竖切口打开腹腔，找到肾脏后小心分离输尿管将两端结扎，中间剪断。假手术组只分离但不结扎。
根据文献分别确定了实验药物浓度。大黄酸给药组：在术后每天给以大黄酸25mg/kg，姜黄素给药组：在术后每天给以姜黄素25mg/kg，联合给药组：在术后每天给以大黄酸+姜黄素(25+25mg/kg)。大黄酸和姜黄素使用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制，假手术组和模型组每天给予相同体积的CMC-Na溶液。本研究的给药方法为：在建模期间治疗组每天灌胃大黄酸和姜黄素，空白组和模型组则平行给与等剂量的蒸馏水灌胃，每天一次，持续14天。
(3)细胞和大鼠尿液的采集、保存和前处理
取对数生长期NRK-49F细胞胰蛋白酶消化后，将约7.5×105个/孔NRK-49F细胞接种到6孔板中。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜使细胞同步，后随即分为5组(n＝8)对照组、模型组(10ng/mL TGF-β1)、大黄酸给药组(5ng/mL)、姜黄素给药组(5μM)、大黄酸与姜黄素联用组(5ng/mL+5μM)在37℃和5％CO2下48小时。
快速弃去培养基，加入1m L冷PBS快速洗涤细胞3次，加入1mL-80℃预冷的提取剂(甲醇：乙醇：水＝2：2：1)淬灭，用细胞刮刀收集细胞后，采用超声波细胞破碎仪进行破碎30min，12000rpm，4℃，离心20min后收集细胞上清液，待测。
术后七天处死，处死前收集大鼠12小时尿液，取样品，25℃解冻后进行甲醇沉淀蛋白前处理，尿液按样品：甲醇＝1：5的比例加入甲醇，涡旋混合30s后，4500rpm离心10min，取上清液待测。
(4)数据预处理
将从UPLC-Q-TOF获得的原始数据导入Progenesis QI ver.2.2(NonlinearDynamic)进行峰对齐、解卷积和归一化等处理。
(5)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异
采用SIMCA(version 14.0)对细胞和尿液代谢组学数据进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)；通过载荷图代谢物的变量权重重要性排序(variable importance in the projection,VIP)，进一步筛选离子。采用IBMSPSS(version 22.0,IBM Corporation,USA)软件进行t检验分析和ROC曲线分析；采用GraphPad Prism软件进行箱式图分析。
(6)筛选潜在生物标志物
以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析模型(OPLS-DA)，对两组间的差异代谢物进行筛选，采用SPSS22.0软件进行统计学处理；差异代谢物的筛选条件为：选择变量VIP>1，且差异在两组间具有统计学意义；
(7)潜在生物标志物的鉴定及代谢通路富集分析
对筛选出的离子通过QI软件自带的HMDB和LIPD MAPS数据库进行结构鉴定。最后运用Metabo Analyst 4.0(http://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)平台对差异代谢物进行代谢通路富集。从细胞差异代谢物中共富集得到3条代谢通路：甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢。从尿液差异代谢物中，获得5个潜在生物标志物。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，超高效液相色谱检测采用Waters公司超高效液相系统进行检测，采用ACQUITYUPLC HSS T3C18色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)；流动相：0.1％的甲酸水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成；采用梯度洗脱模式，程序如下：0～0.5min，5％B；0.5～20min，5％～95％B；20.5～25min，5％B。流速为0.3mL·min-1，始终保持恒定。设定自动进样器温度10℃，柱温40℃，进样量10μL。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，质谱检测采用Waters公司四极杆-飞行时间质谱仪进行检测，采集质谱质量数范围为100-1000Da，实验采用电喷雾电离源(ESI)正离子扫描模式进行质谱分析，参数如下：锥孔电压50V；毛细管电压2.5kV；脱溶剂气体，氮气，800L/Hr；锥孔气体，氮气，50L/Hr；脱溶剂气温度，400℃；质量扫描范围m/z为50～1200。采用Waters公司的LockSprayTM系统进行实时校正，以亮氨酸-脑啡肽为质量参比成分，在序列中每分析8个尿液样本，进样一次QC样本。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，数据预处理的主要的处理参数如下：保留时间范围0-20min；质量数范围100-1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6，数据经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，将各个尿液样本离心去沉淀时先以4500rpm的转速低速离心10分钟，接着以12000rpm的转速高速离心10分钟，取上清液待测。
本发明的优点是：与现有技术相比，本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对NRK-49F细胞和大鼠不同尿液样品内代谢产物进行分析，发现了肾纤维化相关的差异代谢物；
2、本发明通过细胞和尿液代谢组学发现肾纤维化的生物标志物的含量变化，对差异尿液代谢物进行代谢通路分析，得到了肾纤维化发生发展中所扰动的代谢通路；
3、本发明通过分析发现大黄酸和姜黄素干预肾纤维化的标志物，并通过ROC分析，发现了有较高诊断价值的肾纤维化差异代谢物；
4、本发明从整体水平高效、快速、全面综合地揭示了肾纤维化发生发展机制及大黄酸和姜黄素联用的作用机制，为传统中药方剂有效成分组合的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例的各组细胞样本正离子PCA得分图；
图2为本发明实施例的对照组与模型组细胞样本正离子OPLS-DA得分图；
图3为本发明实施例基于Metabo Analyst平台的细胞样品代谢拓扑图；
图4为本发明实施例的3种生物标志物箱式图；
图5为本发明实施例基于3种生物标志物的各组细胞样本PCA得分图；
图6为本发明实施例各组大鼠术后七天尿液样本正离子PCA得分图；
图7为本发明实施例sham组与模型组大鼠术后七天尿液样本正离子OPLS-DA得分图；
图8为本发明实施例的5种潜在生物标志物的箱式图；
图9为本发明实施例的5种差异代谢物验证的各组尿液样本PCA得分图。
具体实施方式
在本实施例的描述中，需要说明的是，如出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、“前”、“后”等，其所指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此，不能理解为对本发明的限制。此外，如出现术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
参见图1至图9，本发明公开的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，包括：采用超高效液相色谱串联质谱检测NRK-49F细胞和单侧输尿管结扎(UUO)引发的大鼠肾间质纤维化及大黄酸和姜黄素联用的内源性代谢产物，获得UPLC指纹图谱；
利用PCA、OPLS-DA等模式识别方法，分别细胞和大鼠尿液中从多个变量中筛选并鉴定出3个和5个显著发生变化的内源性代谢物，作为肾纤维化发生潜在相关差异代谢物；
通过Metaboanalyst 4.0软件富集出肾纤维化及其治疗相关的3条代谢通路。
作为优选的，所述的大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，获得大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(8)大黄和姜黄素的制备
将大黄酸(25mg/kg)和姜黄素(25mg/kg)溶解在CMC-Na制备。
(9)细胞和动物模型的确定
NRK-49F细胞的纤维化过程通过TGF-β1诱导：NRK-49F细胞培养于含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。TGF-β1溶于过滤的蒸馏水中至浓度为50mg/mL，并将其储存在-20℃。在每次实验之前，将TGF-β1的储备溶液用含有2mg/mL BSA的磷酸盐缓冲盐水稀释至10ng/mL。
雄性SD大鼠30只，每组6只，共5组，体重220-250g，由温州医科大学动物实验中心提供。将SD大鼠随机分别为sham组、UUO模型组、给药组：大黄酸给药组、姜黄素给药组、联合给药组。UUO模型的建立：模型组和给药组进行单侧输尿管结扎手术，用10％的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，将大鼠手术处剃毛，竖切口打开腹腔，找到肾脏后小心分离输尿管将两端结扎，中间剪断。假手术组只分离但不结扎。
根据文献分别确定了实验药物浓度。大黄酸给药组：在术后每天给以大黄酸25mg/kg，姜黄素给药组：在术后每天给以姜黄素25mg/kg，联合给药组：在术后每天给以大黄酸+姜黄素(25+25mg/kg)。大黄酸和姜黄素使用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制，假手术组和模型组每天给予相同体积的CMC-Na溶液。本研究的给药方法为：在建模期间治疗组每天灌胃大黄酸和姜黄素，空白组和模型组则平行给与等剂量的蒸馏水灌胃，每天一次，持续14天。
(10)细胞和大鼠尿液的采集、保存和前处理
取对数生长期NRK-49F细胞胰蛋白酶消化后，将约7.5×105个/孔NRK-49F细胞接种到6孔板中。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜使细胞同步，后随即分为5组(n＝8)对照组、模型组(10ng/mL TGF-β1)、大黄酸给药组(5ng/mL)、姜黄素给药组(5μM)、大黄酸与姜黄素联用组(5ng/mL+5μM)在37℃和5％CO2下48小时。
快速弃去培养基，加入1m L冷PBS快速洗涤细胞3次，加入1mL-80℃预冷的提取剂(甲醇：乙醇：水＝2：2：1)淬灭，用细胞刮刀收集细胞后，采用超声波细胞破碎仪进行破碎30min，12000rpm，4℃，离心20min后收集细胞上清液，待测。
术后七天处死，处死前收集大鼠12小时尿液，取样品，25℃解冻后进行甲醇沉淀蛋白前处理，尿液按样品：甲醇＝1：5的比例加入甲醇，涡旋混合30s后，4500rpm离心10min，取上清液待测。
(11)数据预处理
将从UPLC-Q-TOF获得的原始数据导入Progenesis QI ver.2.2(NonlinearDynamic)进行峰对齐、解卷积和归一化等处理。
(12)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异
采用SIMCA(version 14.0)对细胞和尿液代谢组学数据进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)；通过载荷图代谢物的变量权重重要性排序(variable importance in the projection,VIP)，进一步筛选离子。采用IBMSPSS(version 22.0,IBM Corporation,USA)软件进行t检验分析和ROC曲线分析；采用GraphPad Prism软件进行箱式图分析。
(13)筛选潜在生物标志物
以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析模型(OPLS-DA)，对两组间的差异代谢物进行筛选，采用SPSS22.0软件进行统计学处理；差异代谢物的筛选条件为：选择变量VIP>1，且差异在两组间具有统计学意义；
(14)潜在生物标志物的鉴定及代谢通路富集分析
对筛选出的离子通过QI软件自带的HMDB和LIPD MAPS数据库进行结构鉴定。最后运用Metabo Analyst 4.0(http://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)平台对差异代谢物进行代谢通路富集。从细胞差异代谢物中共富集得到3条代谢通路：甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢。从尿液差异代谢物中，获得5个潜在生物标志物。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，超高效液相色谱检测采用Waters公司超高效液相系统进行检测，采用ACQUITYUPLC HSS T3C18色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)；流动相：0.1％的甲酸水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成；采用梯度洗脱模式，程序如下：0～0.5min，5％B；0.5～20min，5％～95％B；20.5～25min，5％B。流速为0.3mL·min-1，始终保持恒定。设定自动进样器温度10℃，柱温40℃，进样量10μL。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，质谱检测采用Waters公司四极杆-飞行时间质谱仪进行检测，采集质谱质量数范围为100-1000Da，实验采用电喷雾电离源(ESI)正离子扫描模式进行质谱分析，参数如下：锥孔电压50V；毛细管电压2.5kV；脱溶剂气体，氮气，800L/Hr；锥孔气体，氮气，50L/Hr；脱溶剂气温度，400℃；质量扫描范围m/z为50～1200。采用Waters公司的LockSprayTM系统进行实时校正，以亮氨酸-脑啡肽为质量参比成分，在序列中每分析8个尿液样本，进样一次QC样本。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，数据预处理的主要的处理参数如下：保留时间范围0-20min；质量数范围100-1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6，数据经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。
优选的是，所述的大黄酸和姜黄素联用延缓肾纤维化差异代谢物代谢通路及研究方法中，将各个尿液样本离心去沉淀时先以4500rpm的转速低速离心10分钟，接着以12000rpm的转速高速离心10分钟，取上清液待测。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对NRK-49F细胞和大鼠不同尿液样品内代谢产物进行分析，发现了肾纤维化相关的差异代谢物；
2、本发明通过细胞和尿液代谢组学发现肾纤维化的生物标志物的含量变化，对差异尿液代谢物进行代谢通路分析，得到了肾纤维化发生发展中所扰动的代谢通路；
3、本发明通过分析发现大黄酸和姜黄素干预肾纤维化的标志物，并通过ROC分析，发现了有较高诊断价值的肾纤维化差异代谢物；
4、本发明从整体水平高效、快速、全面综合地揭示了肾纤维化发生发展机制及大黄酸和姜黄素联用的作用机制，为传统中药方剂有效成分组合的代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
图1：各组细胞样本正离子PCA得分图。Control为对照组；Model为模型组；Combine为大黄酸和姜黄素联合给药组。
图2：对照组与模型组细胞样本正离子OPLS-DA得分图；Control为对照组；Model为模型组。
图5：基于3种生物标志物的各组细胞样本PCA得分图；Control为对照组；Model为模型组；Combine为大黄酸和姜黄素联合给药组。
图6：各组大鼠术后七天尿液样本正离子PCA得分图；Control为sham组；Combine为大黄酸和姜黄素联合给药组；Model为UUO模型组。
图7：sham组与模型组大鼠术后七天尿液样本正离子OPLS-DA得分图；Model为UUO模型组。
图8：5种潜在生物标志物的箱式图。纵坐标为相对峰面积，横坐标从左到右分别为假手术组、UUO模型组、大黄酸给药组、姜黄素给药组、大黄酸和姜黄素联合给药组。*表示各给药组组与UUO模型组比较有统计学差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。#表示大黄酸和姜黄素联合给药组与大黄酸给药组或姜黄素给药组比较有统计学差异，#P<0.05，##P<0.01。
图9：5种差异代谢物验证的各组尿液样本PCA得分图。Control为sham组；Combine大黄酸和姜黄素联合给药组；Model为UUO模型组。
本研究初步探讨了差异代谢物对肾纤维化的诊断价值。经过受试者特征曲线(ROC)分析，有8个代谢物的曲线下面积(AUC)>0.9，其作为肾纤维化的诊断指标具有较高的诊断价值。
获得细胞代谢组学和尿液代谢组学延缓肾纤维化进程的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
1.细胞代谢组学部分：
1.1试剂配制
NRK-49F细胞培养于含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。TGF-β1溶于过滤的蒸馏水中至浓度为50mg/mL，并将其储存在-20℃。在每次实验之前，将TGF-β1的储备溶液用含有2mg/mL BSA的磷酸盐缓冲盐水稀释至10ng/mL。
1.2细胞培养及样品前处理
取对数生长期NRK-49F细胞胰蛋白酶消化后，将约7.5×105个/孔NRK-49F细胞接种到6孔板中。24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜使细胞同步，后随即分为5组(n＝8)对照组、模型组(10ng/mL TGF-β1)、大黄酸给药组(5ng/mL)、姜黄素给药组(5μM)、大黄酸与姜黄素联用组(5ng/mL+5μM)在37℃和5％CO2下48小时。快速弃去培养基，加入1m L冷PBS快速洗涤细胞3次，加入1mL-80℃预冷的提取剂(甲醇：乙醇：水＝2：2：1)淬灭，用细胞刮刀收集细胞后，采用超声波细胞破碎仪进行破碎30min，12000rpm，4℃，离心20min后收集细胞上清液，待测。
1.3质控样品准备
取所有待测样品10μL混匀作为质控样品，样品分析前连续检测3～5个质控样品，然后每随机检测10个样品检测1个质控样品。
1.4色谱条件
采用ACQUITY UPLC HSS T3C18色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)(Waters，Milford，MA，USA)；流动相：0.1％的甲酸水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成；采用梯度洗脱模式，程序如下：0～0.5min，5％B；0.5～20min，5％～95％B；20.5～25min，5％B。流速为0.3mL·min-1，始终保持恒定。设定自动进样器温度10℃，柱温40℃，进样量10μL。
1.5质谱条件
实验采用电喷雾电离源(ESI)正离子扫描模式进行质谱分析，参数如下：锥孔电压50V；毛细管电压2.5kV；脱溶剂气体，氮气，800L/Hr；锥孔气体，氮气，50L/Hr；脱溶剂气温度，400℃；质量扫描范围m/z为50～1200。
1.6数据分析
将从UPLC-Q-TOF获得的原始数据导入Progenesis QI ver.2.2(NonlinearDynamic)进行峰对齐、解卷积和归一化等处理。然后采用SIMCA(version 14.0,UmetricsAB,Sweden)对细胞代谢组学数据进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)；通过载荷图代谢物的变量权重重要性排序(variableimportance in the projection,VIP)，进一步筛选离子。采用IBM SPSS(version 22.0,IBM Corporation,USA)软件进行t检验分析和ROC曲线分析；采用GraphPad Prism软件进行箱式图分析。对筛选出的离子通过QI软件自带的HMDB和LIPD MAPS数据库进行结构鉴定。最后运用Metabo Analyst 4.0平台对差异代谢物进行代谢通路富集。
1.7细胞样本与质控样本分析
细胞样本数据经过处理后，UPLC-QTOF正离子模式下共收集得到934个离子。PCA作为一种无监督模式识别方式，能够反映数据的原始状态，因此，首先对所有组细胞样本的代谢轮廓进行PCA分析。如图1，对照组和TGF-β1模型组能够明显分开，表明TGF-β1诱导了NRK-49F纤维化。大黄酸与姜黄素联用组明显偏离模型组，向对照组靠近，表明大黄酸和姜黄素给药后出现肾间质纤维化的细胞中的代谢物明显发生改变，抗肾间质纤维化作用明显。
1.8差异代谢物的发现
为了寻找在细胞中显著改变的与肾间质纤维化疾病相关的代谢物，进一步对对照组和模型组数据进行有监督的OPLS-DA方法分析，如图2所示。结果显示对照组和模型组在所建立的数据模型中表现出良好的拟合度和预测能力(正离子：R2X：0.53，R2Y：0.983，Q2：0.938)。此外VIP值反映了各变量在模型建立中的重要性，本研究以VIP≥1.0、FC>2或<0.5、P<0.05作为截断标准，共筛选并鉴定得到134个差异代谢物。
1.9代谢通路富集分析
将筛选出的134个差异代谢物利用metaboanalyst 4.0进行代谢通路分析。如图3所示，横纵坐标分别表示由拓扑分析计算所得通路影响值和-LOG(P)。将图中的数字与表中代谢通路对应，通过富集分析共得到3条与肾间质纤维化疾病相关相关的代谢通路(P<0.05)(表1)，分别为甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢。
基于Metabo Analyst平台的3条代谢通路具体信息
Figure BDA0002493264400000151
表1
1.10潜在生物标志物的发现
为了发现细胞样本中潜在的纤维化生物标志物，对134种差异代谢物进行进一步筛选。为了评估可以区分对照组与模型组差异代谢物的潜在价值，进行了ROC曲线分析，显示43种代谢物AUC值大于0.90。基于逐步回归分析，筛选出3中显著影响的生物标志物(表2)，MG(0:0/20:3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))、PC(18:0/20:3(5Z,8Z,11Z))。
3种潜在生物标志物的具体信息
Compound HMDB ID VIP FC P AUC
MG(0:0/20:3(11Z,14Z,17Z)/0:0) HMDB0011545 5.98294 0.028988627 0.001 1
LysoPE(0:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)) HMDB0011480 1.5793 0.169884454 0.001 1
PC(18:0/20:3(5Z,8Z,11Z)) HMDB0008046 1.77898 0.197559724 0.001 1
表2
对以上3种代谢物进行箱式图分析，结果表明MG(0:0/20:3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))、PC(18:0/20:3(5Z,8Z,11Z))这3种代谢物可以有效区分对照组、模型组以及大黄酸和姜黄素联合给药组(图4)，可能为肾间质纤维化的潜在生物标志物。
1.11生物标志物的验证
选择上一步获得的3种潜在生物标志物对各组细胞样本进行PCA分析。如图5所示，对照组和模型组能够明显分开，表明这3种代谢物可以有效区分体外肾间质纤维化。大黄酸、姜黄素联用组，明显偏离模型组更靠近对照组，证明大黄酸和姜黄素给药后可以通过影响这3种代谢物延缓体外肾间质纤维化的发展。
2.大鼠尿液部分：
2.1动物实验
雄性SD大鼠30只，每组6只，共3组，体重220-250g，由温州医科大学动物实验中心提供。将SD大鼠随机分别为sham组、UUO模型组、大黄酸与姜黄素联合给药组。UUO模型的建立：模型组和给药组进行单侧输尿管结扎手术，用10％的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，将大鼠手术处剃毛，竖切口打开腹腔，找到肾脏后小心分离输尿管将两端结扎，中间剪断。假手术组只分离但不结扎。在术后每天给以大黄酸+姜黄素(25+25mg/kg)。大黄酸和姜黄素使用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制，假手术组和模型组每天给予相同体积的CMC-Na溶液。
2.2样品前处理
取样品，25℃解冻后进行甲醇沉淀蛋白前处理，尿液按样品：甲醇＝1：5的比例加入甲醇，涡旋混合30s后，4500rpm离心10min，取上清液待测。
2.3色谱条件
采用ACQUITY UPLC HSS T3C18色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)；流动相：0.1％的甲酸水溶液(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成；采用梯度洗脱模式，程序如下：0～0.5min，3％B；0.5～19min，3％～98％B；19.5～25min，3％B。流速为0.3mL·min-1，始终保持恒定。设定自动进样器温度10℃，柱温40℃，进样量2μL。
2.4质谱条件
实验采用电喷雾电离源(ESI)正离子扫描模式进行质谱分析，参数如下：锥孔电压50V；毛细管电压2.5kV；脱溶剂气体，氮气，800L/Hr；锥孔气体，氮气，50L/Hr；脱溶剂气温度，400℃；质量扫描范围m/z为50～1200。
2.5大鼠尿液样本与质控样本分析
对质控样品(QC)进行检测，对待测物的峰面积进行日内精密度分析。55％和73％的峰的变异系数(CV)分别低于15％和30％，QC样品中峰分布的变化系数表明，本分析稳定且可重复。大鼠术后7天尿液样本数据经过处理后，UPLC-QTOF正离子模式下共收集得到2585个离子。PCA作为一种无监督模式识别方式，能够反映数据的原始状态，因此，首先对所有组尿液样本的代谢轮廓进行PCA分析。如图6所示，sham组和UUO模型组能够明显分开，说明UUO造模成功，大鼠出现肾间质纤维化。大黄酸、姜黄素联用给药组，明显偏离模型组更靠近假手术(sham)组，表明大黄酸和姜黄素给药后肾间质纤维化大鼠体内的代谢物明显发生改变，抗肾间质纤维化作用明显。
2.6差异代谢物的发现
为了寻找肾间质纤维化疾病的代谢物，进一步采用有监督的OPLS-DA方法对sham组和模型组数据进行分析，如图7所示。结果显示sham组和模型组在所建立的数据模型中表现出良好的拟合度和预测能力(正离子：R2X：0.277，R2Y：0.994，Q2：0.714)。此外VIP值反映了各变量在模型建立中的重要性，本研究以VIP≥1.5、FC>2或<0.5)、P<0.05作为截断标准，共筛选并鉴定得到172个差异代谢物。
2.7潜在生物标志物的发现
为了发现潜在的生物标志物，对172种差异代谢物进行进一步筛选。做ROC曲线分析，选择AUC≥0.90，再对代谢物进行箱式图分析，选择能明显区分sham组、模型组以及各给药组的代谢物。同时满足条件的共5个代谢物，分别L-谷氨酸5-磷酸、α-亚麻酸、二十二碳六烯酸、美立比醇和脱氧肌苷(表3)。结果(图8)表明L-谷氨酸5-磷酸、α-亚麻酸、二十二碳六烯酸、美立比醇和脱氧肌苷这5种代谢物可以有效区分sham组、UUO模型组以及大黄酸和姜黄素联合给药组，可能肾间质纤维化的潜在生物标志物。
5种可能潜在生物标志物
Compound HMDBID VIP FC P AUC
1 L-Glutamic acid 5-phosphate HMDB0001228 1.7 4.0590 0.002186676 0.944
2 Alpha-Linolenicacid HMDB0001388 1.6362 8.72266 0.00507318 0.972
3 Docosahexaenoicacid HMDB0002183 1.62326 4.87381 0.008122803 1
4 Melibiitol HMDB0006791 1.54747 6.35780 0.010954964 0.944
5 Deoxyinosine HMDB0000071 1.54032 2.38704 0.015570625 0.917
表3
2.8生物标志物的验证
选择上一步筛选出的5种可能的肾间质纤维化标志物对各组尿液样本进行PCA分析。如图9所示，sham组和UUO模型组能够明显分开，说明这5种代谢物可以有效区分体内肾间质纤维化疾病。大黄酸、姜黄素联用给药组，明显偏离模型组更靠近sham组，表明大黄酸和姜黄素给药后可以通过影响这5种代谢物延缓体内肾间质纤维化的发展。分析结果证明这5种代谢物确实可能为体内肾间质纤维化的生物标志物。
在中医药研究中，中药对慢性肾病的治疗引起了广泛关注。在治疗复杂疾病方面，中药具有独特的优势。近年来，中医以其独特的理论体系和悠久历史的临床实践，在世界范围内得到广泛应用。大黄酸和姜黄素是补肾活血汤的主要活性成分，研究表明两者联用具有显著延缓慢性肾病进程的功效。
上述实施例对本发明的具体描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术工程师根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：包括采用超高效液相色谱串联质谱检测NRK-49F细胞纤维化和单侧输尿管结扎诱发的肾纤维化及大黄酸与姜黄素联用干预后的内源性代谢产物，获得指纹图谱；
利用多元统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出8显著发生变化的代谢物，作为与肾纤维化发生潜在相关差异代谢物；
通过Metaboanalyst富集出与肾纤维化相关的3条代谢通路。
2.根据权利要求1所述的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：获得大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)大黄酸与姜黄素的制备：将大黄酸25mg/kg和姜黄素25mg/kg溶解在CMC-Na制备；
(2)模型的确定：NRK-49F细胞培养于含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中；TGF-β1溶于过滤的蒸馏水中至浓度为50mg/mL，并将其储存在-20℃；在每次实验之前，将TGF-β1的储备溶液用含有2mg/mLBSA的磷酸盐缓冲盐水稀释至10ng/mL；雄性SD大鼠18只，每组6只，共3组，体重220-250g，将SD大鼠随机分别为sham组、UUO模型组、大黄酸与姜黄素联合给药组；
UUO模型的建立：模型组和给药组进行单侧输尿管结扎手术，用10％的水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉后，将大鼠手术处剃毛，竖切口打开腹腔，找到肾脏后小心分离输尿管将两端结扎，中间剪断；假手术组只分离但不结扎；
(3)取对数生长期NRK-49F细胞胰蛋白酶消化后，将约7.5×105个/孔NRK-49F细胞接种到6孔板中；24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜使细胞同步，后随即分为3组(n＝8)对照组、模型组10ng/mL TGF-β1、大黄酸与姜黄素联用组5ng/mL+5μM在37℃和5％CO2下48小时；快速弃去培养基，加入1mL冷PBS快速洗涤细胞3次，加入1mL-80℃预冷的提取剂淬灭，用细胞刮刀收集细胞后，采用超声波细胞破碎仪进行破碎30min，12000rpm，4℃，离心20min后收集细胞上清液，待测；对于大鼠，术后七天处死，处死前收集大鼠12小时尿液，取样品，25℃解冻后进行甲醇沉淀蛋白前处理，尿液按样品：甲醇＝1：5的比例加入甲醇，涡旋混合30s后，4500rpm离心10min，取上清液待测；
(4)细胞和尿液样本的超高效液相色谱串联质谱检测分析；
(5)将从UPLC-Q-TOF获得的原始数据导入Progenesis QI ver.2.2(NonlinearDynamic)进行峰对齐、解卷积和归一化等处理；
(6)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异；采用SIMCA(version 14.0)对细胞和尿液代谢组学不同组别数据进行多元统计分析，包括主成分分析PCA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA；通过载荷图代谢物的变量权重重要性排序variable importance in theprojection,VIP，进一步筛选离子；采用IBM SPSS(version 22.0,IBM Corporation,USA)软件进行t检验分析和ROC曲线分析；采用GraphPad Prism软件进行箱式图分析；
(7)筛选潜在生物标志物以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析模型OPLS-DA，对两组间的差异代谢物进行筛选，采用SPSS22.0软件进行统计学处理；差异代谢物的筛选条件为：选择变量VIP>1，且差异在两组间具有统计学意义；
(8)潜在生物标志物的鉴定对筛选出的离子通过QI软件自带的HMDB和LIPD MAPS数据库进行结构鉴定；最终共鉴定8与肾纤维化发生相关的差异代谢产物；
(9)代谢通路富集分析：将细胞和尿液鉴定出的差异代谢产物上传到Metaboanalyst代谢组学分析网站，将代谢产物名字标准化后，选择KEGG数据库，进行相关通路的富集；最后运用Metabo Analyst 4.0平台对差异代谢物进行代谢通路富集；共富集得到3条代谢通路：甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢。
3.根据权利要求2所述的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：超高效液相色谱检测采用超高效液相系统进行检测，采用ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)；流动相：0.1％的甲酸水溶液溶剂A和乙腈溶剂B组成；采用梯度洗脱模式，程序如下：0～0.5min，5％B；0.5～20min，5％～95％B；20.5～25min，5％B。流速为0.3mL·min-1，始终保持恒定；设定自动进样器温度10℃，柱温40℃，进样量10μL。
4.根据权利要求2所述的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：质谱检测采用四极杆-飞行时间质谱仪进行检测，采集质谱质量数范围为100-1000Da，实验采用电喷雾电离源ESI正离子扫描模式进行质谱分析，参数如下：锥孔电压50V；毛细管电压2.5kV；脱溶剂气体，氮气，800L/Hr；锥孔气体，氮气，50L/Hr；脱溶剂气温度，400℃；质量扫描范围m/z为50～1200；采用LockSprayTM系统进行实时校正，以亮氨酸-脑啡肽为质量参比成分，在序列中每分析8个尿液样本，进样一次QC样本。
5.根据权利要求2所述的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：数据预处理主要的处理参数如下：保留时间范围0-20min；质量数范围100-1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6，数据经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。
6.根据权利要求2所述的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：将各个尿液样本离心去沉淀时先以4500rpm的转速低速离心10分钟，接着以12000rpm的转速高速离心10分钟，取上清液待测；
对于细胞样本，快速弃去培养基，加入1mL冷PBS快速洗涤细胞3次，加入1mL-80℃预冷的提取剂淬灭，提取剂为甲醇：乙醇：水＝2：2：1，用细胞刮刀收集细胞后，采用超声波细胞破碎仪进行破碎30min，12000rpm，4℃，离心20min后收集细胞上清液待测。
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