CN113151105A

CN113151105A - 一种厌氧微生物的纯培养方法

Info

Publication number: CN113151105A
Application number: CN202110534485.2A
Authority: CN
Inventors: 郭膘虎; 刘倩; 林辉; 吕斯濠; 文震
Original assignee: Dongguan University of Technology
Current assignee: Dongguan University of Technology
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明公开了一种厌氧微生物的纯培养方法。包括以下步骤：步骤1：配制液体培养液，煮沸，滴加刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：通入N₂/H₂混合气体，曝气，迅速盖紧橡胶塞；步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌；转移至超净台中紫外灭菌；步骤4：使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将厌氧微生物种子液注入培养管中，放入恒温培养箱中培养，得到厌氧微生物群。有益效果：(1)本发明无需利用厌氧培养箱，操作简单便利；(2)本发明中磁性抗氧化剂不溶于液体培养液，不易被厌氧微生物吸收，不影响生长，且可以通过磁性分离，从而简化厌氧微生物的分离，得到较纯的厌氧微生物群。

Description

一种厌氧微生物的纯培养方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种厌氧微生物的纯培养方法。

背景技术

常见的厌氧微生物培养过程中，有发酵方式、多种微生物共培养方式，但都会存在分离问题。而纯培养方式中，一般使用厌氧培养箱或厌氧培养罐来培养厌氧微生物，但该方式操作较复杂，较适合固体培养基培养，不适合液体培养基培养。目前，常见的液体培养基中，会预先加入还原剂如半胱氨酸、抗坏血酸等，来降低氧化还原电位，隔绝氧气，从而形成厌氧环境，进行培养微生物。但是该方法，加入的还原剂量过多，溶解性较大，存在被微生物食用，影响厌氧微生物的生长；同时，该还原剂不易与微生物分离回收，影响最终微生物菌液的纯度，造成培养废液污染。

综上，解决上述问题，制备一种可分离回收的抗氧化剂，用于降低氧化还原电位，形成一种厌氧微生物的纯培养方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种厌氧微生物的纯培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种厌氧微生物的纯培养方法，包括以下步骤：

步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加NaOH调节pH；煮沸，滴加刃天青，分装至细口管中，得到培养管；

步骤2：将曝气针插入培养管，通入N₂/H₂混合气体，曝气，迅速盖紧橡胶塞；

步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌；冷却，放入恒温培养箱中；转移至超净台中紫外灭菌；

步骤4：使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将厌氧微生物种子液注入培养管中，放入恒温培养箱中培养，得到厌氧微生物群。

较为优化地，所述厌氧微生物为产乙酸嗜蛋白菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液；每升微量元素原液中包括以下成分：0.2g CaCl₂、0.4g MgSO₄·7H₂O、1.0gK₂HPO₄、1.0g KH₂PO₄、10.0g NaHCO₃、2.0g NaCl、1L蒸馏水。

较为优化地，所述厌氧微生物为硫还原地杆菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：1.5g NH₄Cl、0.6g Na₂HPO₄、0.1g KCl、0.82g CH₃COONa、2.5g NaHCO₃、8.0g富马酸二钠、10mL微量元素原液；10mL维生素液；每升微量元素原液中包括以下成分：1.5g氨三乙酸、3.0g MgSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·H₂O、1.0g NaCl、0.1g FeSO₄·7H₂O、0.1g CoCl₂·6H₂O、0.76g CaCl₂、0.1g ZnSO₄·7H₂O、0.01g CuSO₄·5H₂O、0.02g KAl(SO₄)₂·12H₂O、0.01gH₃BO₃、0.01g Na₂MoO₄·12H₂O；每升维生素液中包括以下成分：2mg生物素、2mg叶酸、10mg维生素B₆盐酸盐、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg维生素B₃、5mgD-泛酸钙、0.1mg维生素B₁₂、5mg对氨基苯甲酸、5mg硫辛酸。

较为优化地，步骤1中，所述NaOH的浓度为1mol/L；所述pH＝7.1～7.5；所述刃天青加入的浓度为0.1mg/L。

较为优化地，步骤2中，N₂/H₂混合气体是质量比为80％N₂/20％H₂的混合气体；曝气时间为20～30分钟。

较为优化地，步骤3中，高温灭菌的温度为121℃，时间为15～25分钟；紫外灭菌的时间为20～30分钟。

较为优化地，步骤4中，所述厌氧微生物种子液的注入量为2～5％，培养温度为37℃，培养时间为5～7天。

较为优化地，步骤4中，所述磁性抗氧化剂是以抗坏血酸/磁性离子液体为核心，以抗坏血酸棕榈酸脂为外壳的水凝胶。

较为优化地，步骤4中，所述磁性抗氧化剂的加入量为葡萄糖质量的30％～40％。

较为优化地，步骤4中，所述磁性抗氧化剂的具体制备方法为：

(1)抗坏血酸/磁性离子液体：氮气氛围下，将三辛基甲基氯化铵溶于甲醇；加入四水合氯化锰溶液，室温搅拌22～26小时；旋转蒸发，使用蒸馏水洗涤，减压干燥12～20小时；将其溶于乙醇中，加入磷酸缓冲溶液，加入抗坏血酸水溶液，混合搅拌15～20分钟，浓缩，得到抗坏血酸/磁性离子液体；

(2)磁性抗氧化剂的制备：氮气氛围下，将抗坏血酸棕榈酸脂溶解在二氯亚砜中，加热至40～50℃搅拌15～20分钟，得到5～6wt％的溶液A，将抗坏血酸/磁性离子液体加水稀释，加热至35～45℃，得到10～12wt％的溶液B，将溶液B在快速搅拌中滴加到溶液A中，得到磁性抗氧化剂。

本技术方案中，加入刃天青作为氧化还原指示剂(刃天青未活化是为蓝色，活化后还原为粉色，最终变成无色)；采用曝气基本全部去除氧气，再加入较少的磁性抗氧化剂，去除痕量活性氧，保证绝对厌氧环境，同时，防止漏气情况出现，维持培养过程中营养物质的稳定性。

将四水合氯化锰与三辛基甲基氯化铵合成了锰酸盐阴离子磁性离子液体，利用该液体萃取抗坏血酸，浓缩得到抗坏血酸/磁性离子液体，以此为核心，再利用抗坏血酸与抗坏血酸棕榈酸脂的氢键作用包封形成水凝胶。其中，抗坏血酸棕榈酸脂为常用的抗氧化剂，可以增加液体培养液的稳定性，且其为脂溶性物质，不易被水溶解，从而不易被厌氧微生物食用；而以抗坏血酸/磁性离子液体为核心，同样的抗坏血酸具有抗氧化性，被包封在内部，辅助抗坏血酸棕榈酸脂抗氧化，而磁性离子液体包封在内部是为了可以将磁性抗氧化剂与菌液分离。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：(1)本发明无需利用厌氧培养箱，操作简单便利；(2)本发明中磁性抗氧化剂不溶于液体培养液，不易被厌氧微生物吸收，不影响生长，且可以通过磁性分离，从而简化厌氧微生物的分离，得到较纯的厌氧微生物群，同时该物质可。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是实施例1中硫还原地杆菌生长曲线图；

图2是实施例2中乙酸嗜蛋白菌生长曲线图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施1：以培养硫还原地杆菌为例

液体培养液成分：所述每升液体培养液中包括以下成分：1.5g NH₄Cl、0.6gNa₂HPO₄、0.1g KCl、0.82g CH₃COONa、2.5g NaHCO₃、8.0g富马酸二钠、10mL微量元素原液；10mL维生素液；所述每升微量元素原液中包括以下成分：1.5g氨三乙酸、3.0g MgSO₄·7H₂O、0.5gMnSO₄·H₂O、1.0g NaCl、0.1g FeSO₄·7H₂O、0.1g CoCl₂·6H₂O、0.76g CaCl₂、0.1gZnSO₄·7H₂O、0.01g CuSO₄·5H₂O、0.02g KAl(SO₄)₂·12H₂O、0.01g H₃BO₃、0.01g Na₂MoO₄·12H₂O；所述每升维生素液中包括以下成分：2mg生物素、2mg叶酸、10mg维生素B₆盐酸盐、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg维生素B₃、5mgD-泛酸钙、0.1mg维生素B₁₂、5mg对氨基苯甲酸、5mg硫辛酸。

步骤1：配制液体培养液，富马酸二钠先不加，水浴加热，滴加浓度为1mol/LNaOH调节pH＝6.9；煮沸，滴加浓度为0.1mg/L刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：将曝气针插入培养管，通入质量比为80％N₂/20％H₂的混合气体，曝气20分钟，迅速盖紧橡胶塞；

步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌，设置温度为121℃，时间为20分钟；转移至超净台中冷却至室温，放入恒温培养箱中48小时，紫外灭菌25分钟。

步骤4：将高浓度富马酸二钠溶液经0.22微米滤膜注入培养液中，放入37℃恒温培养箱中培6天，得到厌氧微生物群。

实施例2～6：均以培养产乙酸嗜蛋白菌(P.Acetatigenes)为例。

液体培养液成分均为：所述每升液体培养液中包括以下成分：5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL盐溶液；所述每升盐溶液中包括以下成分：0.2g CaCl₂、0.4g MgSO₄·7H₂O、1.0g K₂HPO₄、1.0g KH₂PO₄、10.0g NaHCO₃、2.0g NaCl、1L蒸馏水。

实施例2：

步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加浓度为1mol/LNaOH调节pH＝7.2；煮沸，滴加浓度为0.1mg/L刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：将曝气针插入培养管，通入质量比为80％N₂/20％H₂的混合气体，曝气20分钟，迅速盖紧橡胶塞；

步骤4：使用注射器将3％的厌氧微生物种子液注入培养管中，放入37℃恒温培养箱中培6天，得到厌氧微生物群。

实施例3：

步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌，设置温度为121℃，时间为20分钟；转移至超净台中紫外灭菌25分钟。

步骤4：(1)抗坏血酸/磁性离子液体：氮气氛围下，将三辛基甲基氯化铵溶于甲醇；加入四水合氯化锰溶液，室温搅拌24小时；旋转蒸发，使用蒸馏水洗涤，减压干燥15小时；将其溶于乙醇中，加入磷酸缓冲溶液，加入抗坏血酸水溶液，混合搅拌18分钟，浓缩，得到抗坏血酸/磁性离子液体；(2)磁性抗氧化剂的制备：氮气氛围下，将抗坏血酸棕榈酸脂溶解在二氯亚砜中，加热至45℃搅拌16分钟，得到5.5wt％的溶液A，将抗坏血酸/磁性离子液体加水稀释，加热至40℃，得到11wt％的溶液B，将溶液B在快速搅拌中滴加到溶液A中，得到磁性抗氧化剂。(3)使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将3％的厌氧微生物种子液注入培养管中，放入37℃恒温培养箱中培养6天，得到厌氧微生物群。

本实施例中，所述磁性抗氧化剂的加入量为葡萄糖质量的35％。

实施例4：

步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加浓度为1mol/LNaOH调节pH＝7.1；煮沸，滴加浓度为0.1mg/L刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：将曝气针插入培养管，通入质量比为80％N₂/20％H₂的混合气体，曝气25分钟，迅速盖紧橡胶塞；

步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌，设置温度为121℃，时间为15分钟；转移至超净台中紫外灭菌20分钟。

步骤4：(1)抗坏血酸/磁性离子液体：氮气氛围下，将三辛基甲基氯化铵溶于甲醇；加入四水合氯化锰溶液，室温搅拌22小时；旋转蒸发，使用蒸馏水洗涤，减压干燥12小时；将其溶于乙醇中，加入磷酸缓冲溶液，加入抗坏血酸水溶液，混合搅拌15分钟，浓缩，得到抗坏血酸/磁性离子液体；(2)磁性抗氧化剂的制备：氮气氛围下，将抗坏血酸棕榈酸脂溶解在二氯亚砜中，加热至40℃搅拌15分钟，得到5wt％的溶液A，将抗坏血酸/磁性离子液体加水稀释，加热至35℃，得到10wt％的溶液B，将溶液B在快速搅拌中滴加到溶液A中，得到磁性抗氧化剂。(3)使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将2％的厌氧微生物种子液注入培养管中，放入37℃恒温培养箱中培养5天，得到厌氧微生物群。

本实施例中，所述磁性抗氧化剂的加入量为葡萄糖质量的30％。

实施例5：

步骤1：配制液体培养液，水浴加热，滴加浓度为1mol/LNaOH调节pH＝7.5；煮沸，滴加浓度为0.1mg/L刃天青，分装至细口管中，得到培养管；步骤2：将曝气针插入培养管，通入质量比为80％N₂/20％H₂的混合气体，曝气30分钟，迅速盖紧橡胶塞；

步骤3：将培养管置于高压灭菌锅内，高温灭菌，设置温度为121℃，时间为25分钟；转移至超净台中紫外灭菌30分钟。

步骤4：(1)抗坏血酸/磁性离子液体：氮气氛围下，将三辛基甲基氯化铵溶于甲醇；加入四水合氯化锰溶液，室温搅拌26小时；旋转蒸发，使用蒸馏水洗涤，减压干燥20小时；将其溶于乙醇中，加入磷酸缓冲溶液，加入抗坏血酸水溶液，混合搅拌20分钟，浓缩，得到抗坏血酸/磁性离子液体；(2)磁性抗氧化剂的制备：氮气氛围下，将抗坏血酸棕榈酸脂溶解在二氯亚砜中，加热至50℃搅拌20分钟，得到6wt％的溶液A，将抗坏血酸/磁性离子液体加水稀释，加热至45℃，得到12wt％的溶液B，将溶液B在快速搅拌中滴加到溶液A中，得到磁性抗氧化剂。(3)使用注射器将磁性抗氧化剂注入至培养管中，混匀；使用注射器将5％的厌氧微生物种子液注入培养管中，放入37℃恒温培养箱中培养7天，得到厌氧微生物群。

本实施例中，所述磁性抗氧化剂的加入量为葡萄糖质量的40％。

实施例6：将磁性抗氧化剂换成抗坏血酸；其余与实施例2相同。

实验：在培养过程中，实时监测前8天内细菌指数的增长趋势，并记录下浸入生长稳定期时的初始时间，以及稳定生物量。所得数据如下所示：

实施例	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
							初始时间/天	7	6	5	5	5	5
稳定生物量	0.26	0.40	0.48	0.46	0.45	0.41

结论：图1为实施例2为硫还原地杆菌的生长曲线图，图中可以看出：该细菌前期生长较慢，从第4～6天时呈现指数生长，与第7天趋于稳定，进入生长稳定期生物量在0.26上下波动。而图二为实施例2中乙酸嗜蛋白菌生长曲线图，其在前期就是指数生长的旺盛期，到6天时趋于稳定，进入生长稳定期生物量在0.4上下波动，培养基明显浑浊，有明显的细小絮状悬浮物，以及底泥的堆积。表明了该培养方法的适用性。

同时，对比实施例2～6的数据可以看出：实施例3～5中的稳定生物量较实施例2、6中明显更高，原因是：磁性抗氧化剂是强抗氧化剂，可以消除溶液中痕量的活性氧，更利于厌氧生物的生长，且该物质不溶于液体培养液，不易被厌氧微生物吸收，不影响活率。而实施例2中未加入，存在活性氧，降低了生物量；实施例6中直接加入抗坏血酸，同样由于抗氧化物质的加入，消除了痕量氧，生长速率同样增加，但是其易溶性，会被微生物食用，影响了厌氧微生物的生长，稳定生物量有所下降。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：所述厌氧微生物为产乙酸嗜蛋白菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：5g多聚蛋白胨、5g胰蛋白胨、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、0.96L蒸馏水、40mL微量元素原液；每升微量元素原液中包括以下成分：0.2g CaCl₂、0.4g MgSO₄·7H₂O、1.0g K₂HPO₄、1.0g KH₂PO₄、10.0g NaHCO₃、2.0gNaCl、1L蒸馏水。

3.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：所述厌氧微生物为硫还原地杆菌时，步骤1中，每升液体培养液中包括以下成分：1.5g NH₄Cl、0.6g Na₂HPO₄、0.1g KCl、0.82g CH₃COONa、2.5g NaHCO₃、8.0g富马酸二钠、10mL微量元素原液；10mL维生素液；每升微量元素原液中包括以下成分：1.5g氨三乙酸、3.0g MgSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄·H₂O、1.0g NaCl、0.1g FeSO₄·7H₂O、0.1g CoCl₂·6H₂O、0.76g CaCl₂、0.1g ZnSO₄·7H₂O、0.01g CuSO₄·5H₂O、0.02g KAl(SO₄)₂·12H₂O、0.01g H₃BO₃、0.01g Na₂MoO₄·12H₂O；每升维生素液中包括以下成分：2mg生物素、2mg叶酸、10mg维生素B₆盐酸盐、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg维生素B₃、5mgD-泛酸钙、0.1mg维生素B₁₂、5mg对氨基苯甲酸、5mg硫辛酸。

4.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤1中，所述NaOH的浓度为1mol/L；所述pH＝6.9～7.5；所述刃天青加入的浓度为0.1mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤2中，N₂/H₂混合气体是质量比为80％N₂/20％H₂的混合气体；曝气时间为20～30分钟。

6.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤3中，高温灭菌的温度为121℃，时间为15～25分钟；紫外灭菌的时间为20～30分钟。

7.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤4中，所述厌氧微生物种子液的注入量为2～5％，培养温度为37℃，培养时间为5～7天。

8.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤4中，所述磁性抗氧化剂是以抗坏血酸/磁性离子液体为核心，以抗坏血酸棕榈酸脂为外壳的水凝胶。

9.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤4中，所述磁性抗氧化剂的加入量为葡萄糖质量的30％～40％。

10.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物的纯培养方法，其特征在于：步骤4中，所述磁性抗氧化剂的具体制备方法为：