CN112501077A - 一种丁酸梭菌的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌的培养方法，所述培养方法，包括制备丁酸梭菌菌悬液、一级种子液制备、二级种子液制备及发酵接种等步骤。本发发明使用优化的种子培养基与发酵培养基，提高了丁酸梭菌发酵过程中的种子质量与发酵质量，降低了发酵成本，该培养方法能够显著提高丁酸梭菌的产酸量，并显著提高其维生素K2含量，以获得稳定的工业化生产工艺。

Description

一种丁酸梭菌的培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌的培养方法。
背景技术
丁酸梭菌，又名酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸菌，主要分布在人的粪便和土壤中，其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌在动物肠道内除了促进动物肠道有益菌群的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生，还能在动物肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶等物质，具有保健作用。丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质，不受胃酸、胆汁酸等影响，对多种饲用抗生素有较强的耐受性，能够作为新饲料添加剂的使用。维生素K2(VK2)在食品中含量极少,有“铀金维生素”之称,可以预防和治疗骨质疏松。
目前培养丁酸梭菌的方法普遍存在丁酸梭菌菌活数不高，菌体生物产量偏低，且大多为提高丁酸梭菌的产酸量，对提高丁酸梭菌的维生素K2含量现有报道，且目前培养丁酸梭菌的方法普遍存在不耐储藏、稳定性差，生产成本高等问题。专利文献CN110846258A公开了一种丁酸梭菌的高密度发酵生产方法，该方法采用优化的种子培养基与发酵培养基，简单的发酵过程控制，确定了丁酸梭菌工业化规模生产工艺，提高了丁酸梭菌发酵过程中的种子质量与发酵质量，但其发酵产物中合成维生素B和K含量偏低。专利文献CN107828688B公开了一株耐丁酸、抗逆性强的丁酸梭菌及其应用，虽然提高了丁酸梭菌发酵水平，但是其采用的是诱变技术对丁酸梭菌菌株进行筛选，成本较高，方法复杂，其产生维生素K的含量较低。
因此，迫切需要一种新的方法来实现丁酸梭菌的规模化生产。
发明内容
本发明旨在提供一种丁酸梭菌的培养方法，该培养方法能够显著提高丁酸梭菌的产酸量，并显著提高其维生素K2含量，降低成本，并显著增加动物小肠蠕动的速度，改善肠道消化功能，促进对饲料中各种营养成分的消化与吸收。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种丁酸梭菌的培养方法，包括以下步骤：
S1、制备丁酸梭菌菌悬液：吸取丁酸梭菌菌液，接种于RCM培养基中厌氧培养12-48h，然后1000-3000转离心2-5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心2-5分钟，重复清洗1-3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成丁酸梭菌菌悬液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1得到的丁酸梭菌菌悬液，接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0～7.0时，得到一级种子培养液；
S3、二级种子液制备：将步骤S2得到的一级种子培养液，接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0～7.0时，接种时往种子培养基中添加罗格列酮0.005-0.05g，发酵完成后，过滤得到二级种子培养液；
S4、发酵培养：将步骤S3得到的二级种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐内，密封厌氧培养，调节至pH值至5.0-6.0。
优选的，所述种子培养基为，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖5.0～15.0g，酵母粉5.0～15.0g，蛋白胨5.0-15.0g，磷酸氢二钾0.25～0.75g，七水合硫酸镁0.2～0.6g，硫酸锰0.05～0.2g，氯化钙0.5～1.5g，硫酸亚铁2.0～7.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.7g，丁酸钠0.1-0.05g，余量为无菌水，pH6.0～7.0，115℃，灭菌30min，即得。
优选的，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖10.0g，酵母粉10.0g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，硫酸锰0.1g，氯化钙1g，硫酸亚铁4g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，丁酸钠0.08g，余量为无菌水，pH6.5，115℃，灭菌30min，即得。
优选的，所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1-5g，葡萄糖5.0～15.0gg，酵母粉10.0～15.0g，蛋白胨5.0-15.0g，磷酸氢二钾0.25～0.75g，短梗霉多糖5-20g，七水合硫酸镁0.01-0.5g，维生素B10.05-0.1g，余量为无菌水，pH6.0～7.0，115℃，灭菌30min，即得。
优选的，所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1-5g，葡萄糖10g，酵母粉13g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾0.5g，短梗霉多糖13g，七水合硫酸镁0.2g，维生素B1 0.08g，余量为无菌水，pH6.5，115℃，灭菌30min，即得。
优选的，所述步骤S2和S3中的接种量为0.5-2％(v/v)。
优选的，所述步骤S4中将二级种子液接入发酵培养基中进行发酵培养的接种量为1-10％。
优选的，所述厌氧培养的温度为28～37℃，所述厌氧培养的压力为0.01～0.05Mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50-100r/min，所述厌氧培养的时间为12～24h。。
在培养基中加入合适的罗格列酮，可大幅度提高细胞对葡萄糖的利用率和细胞膜的通透性，改变了细胞与环境进行物质交换的过程，从而促进丁酸梭菌的合成丁酸和维生素；在发酵培养基中添加药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和短梗霉多糖能够协同促进丁酸梭菌对金属离子和丁酸的耐受性，促进丁酸梭菌的生长。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用以葡萄糖和短梗霉多糖为碳源、以蛋白胨为氮源作为发酵培养基，厌氧培养丁酸梭菌，并在发酵过程中添加适量罗格列酮，可大幅度提高丁酸梭菌中丁酸的产量。
(2)本发明的发酵培养基添加药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物、短梗霉多糖和培养基中其他成分协同促进丁酸梭菌的发酵，并显著提高了丁酸梭菌中维生素K2的含量。
(3)本发明简单有效，易于操作，可提高生产效率，有利于高产维生素的丁酸梭菌的工业化生产。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
丁酸梭菌(GIMCC GIM1.676)购自广东省微生物研究所菌种保藏中心；药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物，CAS号：94465-74-4；短梗霉多糖CAS号：9057-02-7。
实施例1
一种丁酸梭菌的培养方法，包括以下步骤：
S1、制备丁酸梭菌菌悬液：吸取丁酸梭菌菌液，接种于RCM培养基中厌氧培养12h，然后3000转离心2分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心2分钟，重复清洗1-3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成丁酸梭菌菌悬液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1得到的丁酸梭菌菌悬液，以0.5％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12h，调节至pH值至6.0时，得到一级种子培养液；
S3、二级种子液制备：将步骤S2得到的一级种子培养液，以0.5％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0时，接种时往种子培养基中添加罗格列酮0.005g，发酵完成后，过滤得到二级种子培养液；
S4、发酵培养：将步骤S3得到的二级种子液以1％(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐内，密封厌氧培养，调节至pH值至5.0；
所述种子培养基为，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖5.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.25g，七水合硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，氯化钙1.5g，硫酸亚铁7.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g，丁酸钠0.05g，余量为无菌水，pH6.0，115℃，灭菌30min，即得；
所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1g，葡萄糖5.0g，酵母粉10.0g，蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾0.25g，短梗霉多糖20g，七水合硫酸镁0.01g，维生素B1 0.05g，余量为无菌水，pH6.0，115℃，灭菌30min，即得；
所述厌氧培养的温度为28℃，所述厌氧培养的压力为0.01Mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50r/min，所述厌氧培养的时间为24h。
实施例2
一种丁酸梭菌的培养方法，包括以下步骤：
S1、制备丁酸梭菌菌悬液：吸取丁酸梭菌菌液，接种于RCM培养基中厌氧培养24h，然后2000转离心3分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心3分钟，重复清洗1-3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成丁酸梭菌菌悬液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1得到的丁酸梭菌菌悬液，以1％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养15h，调节至pH值至6.5时，得到一级种子培养液；
S3、二级种子液制备：将步骤S2得到的一级种子培养液，以1％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.5时，接种时往种子培养基中添加罗格列酮0.01g，发酵完成后，过滤得到二级种子培养液；
S4、发酵培养：将步骤S3得到的二级种子液以5％(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐内，密封厌氧培养调节至pH值至5.5；
所述种子培养基为，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖10.0g，酵母粉10.0g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，硫酸锰0.1g，氯化钙1g，硫酸亚铁4g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，丁酸钠0.08g，余量为无菌水，pH6.5，115℃，灭菌30min，即得
所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1-5g，葡萄糖10g，酵母粉13g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾0.5g，短梗霉多糖13g，七水合硫酸镁0.2g，维生素B1 0.08g，余量为无菌水，pH6.5，115℃，灭菌30min，即得；
所述厌氧培养的温度为35℃，所述厌氧培养的压力为0.03Mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为75r/min，所述厌氧培养的时间为18h。
实施例3
一种丁酸梭菌的培养方法，包括以下步骤：
S1、制备丁酸梭菌菌悬液：吸取丁酸梭菌菌液，接种于RCM培养基中厌氧培养48h，然后1000转离心5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心5分钟，重复清洗1-3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成丁酸梭菌菌悬液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1得到的丁酸梭菌菌悬液，以2％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养18h，调节至pH值至7.0时，得到一级种子培养液；
S3、二级种子液制备：将步骤S2得到的一级种子培养液，以2％(v/v)的接种量接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至7.0时，接种时往种子培养基中添加罗格列酮0.05g，发酵完成后，过滤得到二级种子培养液；
S4、发酵培养：将步骤S3得到的二级种子液以10％(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐内，密封厌氧培养，调节至pH值至6.0。"
所述种子培养基为，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖15.0g，酵母粉15.0g，蛋白胨15.0g，磷酸氢二钾0.75g，七水合硫酸镁0.6g，硫酸锰0.2g，氯化钙0.5g，硫酸亚铁2.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.7g，丁酸钠0.1g，余量为无菌水，pH7.0，115℃，灭菌30min，即得
所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1-5g，葡萄糖15g，酵母粉15.0g，蛋白胨15g，磷酸氢二钾0.75g，短梗霉多糖5g，七水合硫酸镁0.5g，维生素B1 0.1g，余量为无菌水，pH7.0，115℃，灭菌30min，即得
所述厌氧培养的温度为37℃，所述厌氧培养的压力为0.05Mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50-100r/min，所述厌氧培养的时间为24h。
对比例1
与实施2的区别在于，步骤S3不添加罗格列酮。
对比例2
与实施2的区别在于，发酵培养基不添加药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物，缺失部分用短梗霉多糖替换。
对比例3
与实施2的区别在于，发酵培养基不添加短梗霉多糖，缺失部分用药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物替换。
试验例1维生素K2的含量
取实施例1-3和对比例1-3培养后12h的发酵液于5000r/min条件下离心10min。弃掉上清液,将所得菌体用15mL蒸馏水制成菌悬液后进行超声破碎5min，破碎完毕后加入15mL正己烷剧烈震荡2min,然后于5000r/min条件下离心10min。在248nm处测吸光值,利用标准品的标准曲线计算目标产物的含量，同时用空白样作对照实验。
表1维生素k2的含量测定结果
组别 维生素K2含量mg/L
实施例1 18.75
实施例2 26.31
实施例3 19.30
对比例1 8.65
对比例2 9.12
对比例3 10.33
由表1可以看出，相对对比例1-3，本发明实施例1-3培养的丁酸梭菌中的维生素K2的含量均得到明显提高，表明发酵过程中添加罗格列酮能够促进丁酸梭菌的生长，发酵培养基的药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和短梗霉多糖能够协同培养基中其他成分，协同促进丁酸梭菌中的维生素K2的合成。
试验例2丁酸的含量
取1-3和对比例1-3培养12h后的发酵液于5000r/min条件下离心10min。弃掉上清液,将所得菌体用15mL蒸馏水制成菌悬液后进行超声破碎5min，破碎完毕后，过滤，用高效液相色谱法测定丁酸的含量，液相色谱仪运行条件为：LC-20AD泵(日本)，C-18柱(日本)；流动相：0.01M Na H2PO4·2H2O，20％甲醇，pH 2.5，流速0.8ml/min，检测波长215nm，进样体积20μl，柱温35℃。
表2丁酸的含量测定结果
Figure BDA0002842444170000061
Figure BDA0002842444170000071
由表2可以看出，相对对比例1-3，本发明实施例1-3培养的丁酸梭菌中的维生素K2的含量均得到明显提高，表明发酵过程中添加罗格列酮能够促进丁酸梭菌的生长，发酵培养基的药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物和短梗霉多糖能够协同培养基中其他成分，协同促进丁酸梭菌中丁酸的合成。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种丁酸梭菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备丁酸梭菌菌悬液：吸取丁酸梭菌菌液，接种于RCM培养基中厌氧培养12-48h，然后1000-3000转离心2-5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心2-5分钟，重复清洗1-3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成丁酸梭菌菌悬液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1得到的丁酸梭菌菌悬液，接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0～7.0时，得到一级种子培养液；
S3、二级种子液制备：将步骤S2得到的一级种子培养液，接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0～7.0时，接种时往种子培养基中添加罗格列酮0.005-0.05g，发酵完成后，过滤得到二级种子培养液；
S4、发酵培养：将步骤S3得到的二级种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐内，密封厌氧培养，调节至pH值至5.0-6.0。
2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述种子培养基为，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖5.0～15.0g，酵母粉5.0～15.0g，蛋白胨5.0-15.0g，磷酸氢二钾0.25～0.75g，七水合硫酸镁0.2～0.6g，硫酸锰0.05～0.2g，氯化钙0.5～1.5g，硫酸亚铁2.0～7.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.7g，丁酸钠0.1-0.05g，余量为无菌水，pH6.0～7.0，115℃，灭菌30min，即得。
3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖10.0g，酵母粉10.0g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，硫酸锰0.1g，氯化钙1g，硫酸亚铁4g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，丁酸钠0.08g，余量为无菌水，pH6.5，115℃，灭菌30min，即得。
4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1-5g，葡萄糖5.0～15.0gg，酵母粉10.0～15.0g，蛋白胨5.0-15.0g，磷酸氢二钾0.25～0.75g，短梗霉多糖5-20g，七水合硫酸镁0.01-0.5g，维生素B1 0.05-0.1g，余量为无菌水，pH6.0～7.0，115℃，灭菌30min，即得。
5.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，所述发酵培养基为，1L培养基由以下组分组成：药用层孔菌(FOMESOFFICINALIS)提取物1-5g，葡萄糖10g，酵母粉13g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾0.5g，短梗霉多糖13g，七水合硫酸镁0.2g，维生素B1 0.08g，余量为无菌水，pH6.5，115℃，灭菌30min，即得。
6.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中的接种量为0.5-2％(v/v)。
7.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述步骤S4中将二级种子液接入发酵培养基中进行发酵培养的接种量为1-10％。
8.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述厌氧培养的温度为28～37℃，所述厌氧培养的压力为0.01～0.05Mpa，所述厌氧培养的搅拌转速为50-100r/min，所述厌氧培养的时间为12～24h。
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