CN105010761A - 一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法 - Google Patents

Abstract

一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法，其步骤包括：培养基制备以及微生物培养、制备基础液体培养基与铜梯度培养基、微生物梯度培养、制备种子培养基、制备发酵种子、制备发酵液、微生物发酵、制作酵母发酵态铜饲料添加剂与包装。本发明提供了一种利用啤酒生产过程中糖化废水和发酵废水生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的处理方法，方法简单，容易操作，效果理想，既提高了资源利用效率，降低了生产成本，又可以对啤酒生产中的废水进行生物处理，减少了环境污染，并且，所制备的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂具有较高的生物有效性。

Description

一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂及生物技术领域，尤其是一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法。

背景技术

锌和硒都是动物体必需的微量元素。锌参与动物体内多种酶的组成和激活等。缺锌可引起动物食欲减退、采食量和生产性能下降、皮肤和被毛损害、雄性生殖器官发育不良、母畜繁殖性能降低和骨骼异常等症状。硒在体内参与谷胱甘肽过氧化物酶的组成，对体内氢或脂过氧化物有较强的还原作用，保护细胞膜结构完整和功能正常。缺硒易导致肌肉营养不良、肝坏死、渗出性素质、胰脏纤维化等典型症状。

目前，动物饲料中添加的锌和硒多以无机态盐类为主，其中无机锌盐吸收率低，添加量大，随粪便污染严重；无机硒盐虽吸收率高于无机锌盐，但其毒性大，容易造成动物毒性。因此，研制一种新型的锌、硒矿物元素意义重大。近年来，利用微生物发酵技术，开发了诸如酵母硒饲料添加剂，取得了很好的效果。而，利用微生物将多种微量元素结合在一起，研制复合的微生物发酵态微量元素较少。

我国是啤酒生产消费大国，在其生产过程中会产生20-30倍的废水，其中糖化废水和发酵废水中有机养分含量丰富。研究表明，糖化和发酵后排放的废水COD浓度在2000~4000mg/L，并且以可溶态的糖类、氨基酸、醇类、维生素等为主。因此，通过对其营养成分调控后，能够作为微生物的营养基质来生产一系列微生物发酵类产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，将啤酒生产过程中的废液（糖化废液和发酵废液）经过适当理化性质调控后作为发酵液，以酵母菌作为发酵菌种，对无机锌、硒进行发酵处理，研制酵母发酵态的锌硒复合饲料添加剂，从而提高锌、硒的吸收利用率。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锌源为氧化锌或无机锌盐，硒源为亚硒酸钠，包括如下步骤：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min-30min，调pH至5.0~5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0~5.2，备用；

梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中分别加入锌源和硒源，进而得到锌含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L和1200mg/L的锌培养基以及硒含量分别为0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L的硒培养基，锌培养基和锌含量为0mg/L的基础液体培养基构成锌梯度培养基，硒培养基和硒含量为0mg/L的基础液体培养基构成硒梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得的锌梯度培养基上，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，培养结束后，再分别依次培养于步骤（2）所制得的硒梯度培养基上，培养时间为24h，培养温度为30.5℃；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15~20min，并调pH至5.0~5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，一份种子培养基接种一种酵母菌，然后将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液或发酵废液制成的，具体制备方法如下：

a、利用糖化废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15~20min，调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

b、利用发酵废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，再在60~65℃水浴锅内水浴加热30~40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入 2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

将待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠按照重量分别取其中的20%加入步骤（6）所制得的发酵液中并混合均匀，再按照10%的接种比例向发酵液中分别接种由步骤（5）所制备的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后于30.5℃条件下进行发酵，发酵2h后，向发酵液中再次加入20%的待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠，搅拌均匀，继续发酵至6h后，向发酵液中再次加入20%的待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠，搅拌均匀，继续发酵至12h后，将剩余的40%的待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠加入发酵液中，搅拌均匀，使发酵液中的锌含量达到1400 mg/L、硒含量达到20 mg/L，继续发酵至24h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500~4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。

本发明具有以下有益效果：

第一，本发明提供了一种利用啤酒生产过程中糖化废水和发酵废水生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的处理方法，方法简单，容易操作，效果理想，既提高了资源利用效率，降低了生产成本，又可以对啤酒生产中的废水进行生物处理，减少了环境污染；

第二，与传统的酵母发酵单一微量元素相比，本发明提供了一种酵母发酵复合态微量元素的方法，大大提高了发酵效率，并且便于饲喂添加；

第三，本发明提供的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的生物有效性高，采用Caco-2细胞模型分析表明，酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂中的锌、硒生物有效性分别为35.12%和58.45%，而硫酸锌生物有效性仅为8.74%，亚硒酸钠生物有效性为32.33%；

第四，对酵母发酵态锌硒组和硫酸锌和亚硒酸钠复合组分别进行细胞毒性试验分析表明，在相同添加量下（以金属元素计）酵母发酵态锌硒组细胞MTT活性较硫酸锌和亚硒酸钠复合组高83.10%，LDH渗漏降低了55.91%；

第五，本发明采用啤酒酵母与产朊假丝酵母联合发酵的方法，并提供了一种少量多次加入无机锌盐和无机硒盐的发酵方法，而非一次性加入待发酵的锌盐和硒盐，因而避免了大量无机锌盐或硒盐对微生物的毒性，提高了发酵效率。

附图说明

图1是本发明试验例中Caco-2细胞对锌的转运量的对比图。

图2是本发明试验例中Caco-2细胞对硒的转运量的对比图。

图3是细胞毒性试验分析中Caco-2细胞MTT吸收的对比图。

图4是细胞毒性试验分析中Caco-2细胞LDH渗漏的对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1：

一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锌源为硫酸锌，硒源为亚硒酸钠，包括如下步骤：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min，调pH至5.0，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0，备用；

梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中分别加入硫酸锌和亚硒酸钠，进而得到锌含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L和1200mg/L的锌培养基以及硒含量分别为0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L的硒培养基，锌培养基和锌含量为0mg/L的基础液体培养基构成锌梯度培养基，硒培养基和硒含量为0mg/L的基础液体培养基构成硒梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得的锌梯度培养基上，每个浓度梯度均为培养温度30.5℃，时间24h，培养结束后，再分别依次培养于步骤（2）所制得的硒梯度培养基上，每个浓度梯度均为培养温度30.5℃，时间24h；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15min，并调pH至5.0，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液制成的，具体制备方法如下：

取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500r/min转速下离心5min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15min，调整pH至5.0，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

分别取待发酵的硫酸锌、亚硒酸钠重量的20%加入步骤（6）所制得的发酵液中并混合均匀，再按照10%的接种比例向发酵液中分别接种由步骤（5）所制备的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后于30.5℃条件下进行发酵，发酵2h后，向发酵液中再次加入待发酵的硫酸锌、亚硒酸钠的20%，搅拌均匀，继续发酵至6h后，向发酵液中再次加入待发酵的硫酸锌、亚硒酸钠的20%，搅拌均匀，继续发酵至12h后，将剩余的40%的待发酵的硫酸锌、亚硒酸钠加入发酵液中，搅拌均匀，使发酵液中的锌含量达到1400 mg/L、硒含量达到20 mg/L，继续发酵至24h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085Mpa。

实施例2：

一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锌源为硫酸锌，硒源为亚硒酸钠，包括如下步骤：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌30min，调pH至5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.2，备用；

梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中分别加入硫酸锌和亚硒酸钠，进而得到锌含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L和1200mg/L的锌培养基以及硒含量分别为0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L的硒培养基，锌培养基和锌含量为0mg/L的基础液体培养基构成锌梯度培养基，硒培养基和硒含量为0mg/L的基础液体培养基构成硒梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得的锌梯度培养基上，每个浓度梯度均为培养温度30.5℃，时间24h，培养结束后，再分别依次培养于步骤（2）所制得的硒梯度培养基上，每个浓度梯度均为培养温度30.5℃，时间24h；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌20min，并调pH至5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的发酵废液制成的，具体制备方法如下：

取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在4000r/min转速下离心10min，再在65℃水浴锅内水浴加热40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入 2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.5，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

分别取硫酸锌、亚硒酸钠重量的20%加入步骤（6）所制得的发酵液中并混合均匀，再按照10%的接种比例向发酵液中分别接种由步骤（5）所制备的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后于30.5℃条件下进行发酵，发酵2h后，向发酵液中再次加入硫酸锌、亚硒酸钠的20%，搅拌均匀，继续发酵至6h后，向发酵液中再次加入硫酸锌、亚硒酸钠的20%，搅拌均匀，继续发酵至12h后，将剩余的40%的硫酸锌、亚硒酸钠加入发酵液中，搅拌均匀，使发酵液中的锌含量达到1400 mg/L、硒含量达到20 mg/L，继续发酵至24h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.095Mpa。

实施例3：

一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锌源为硫酸锌，硒源为亚硒酸钠，包括如下步骤：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌25min，调pH至5.2，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0，备用；

梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中分别加入硫酸锌和亚硒酸钠，进而得到锌含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L和1200mg/L的锌培养基以及硒含量分别为0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L的硒培养基，锌培养基和锌含量为0mg/L的基础液体培养基构成锌梯度培养基，硒培养基和硒含量为0mg/L的基础液体培养基构成硒梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得的锌梯度培养基上，每个浓度梯度均为培养温度30.5℃，时间24h，培养结束后，再分别依次培养于步骤（2）所制得的硒梯度培养基上，每个浓度梯度均为培养温度30.5℃，时间24h；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，经测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌18min，并调pH至5.2，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液制成的，具体制备方法如下：

取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3800r/min转速下离心7min，经测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌18min，调整pH至5.2，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

分别取硫酸锌和亚硒酸钠重量的20%加入步骤（6）所制得的发酵液中并混合均匀，再按照10%的接种比例向发酵液中分别接种由步骤（5）所制备的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后于30.5℃条件下进行发酵，发酵2h后，向发酵液中再次加入硫酸锌和亚硒酸钠的20%，搅拌均匀，继续发酵至6h后，向发酵液中再次加入硫酸锌和亚硒酸钠的20%，搅拌均匀，继续发酵至12h后，将剩余的40%的硫酸锌和亚硒酸钠加入发酵液中，搅拌均匀，使发酵液中的锌含量达到1400 mg/L、硒含量达到20 mg/L，继续发酵至24h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3800r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.09Mpa。

采用原子吸收光谱法对依照本方法所制备的酵母发酵态锌硒复合添加剂中锌、硒含量进行分析，结果表明锌、硒含量分别为15.85g/kg和0.43g/kg。

试验案例：

    1. 试验样品处理：

    胃蛋白酶溶液（pepsin solution），简称胃液：每100mL的0.1N盐酸中含2.5g胃蛋白酶，加入阳离子交换树脂（Chelex-100）5g，室温振荡反应30min，离心或过滤移出树脂以去除试剂中含有的锌和硒。此溶液胃蛋白酶浓度25mg/mL，pH2.0。置于玻璃血清瓶中4℃冰箱保存，于一个星期内使用完。

    胰液－胆盐悬浮液（pancreatin-bile suspension），简称胰液：每100mL的0.1M碳酸氢钠溶液中含有0.2g胰蛋白酶及1.0g胆汁萃取物，加入阳离子交换树脂15g，室温振荡反应30min，离心或过滤移出树脂以去除试剂中的锌和硒，此溶液每毫升含2mg胰蛋白酶和10mg胆汁萃取物，pH7.0。置玻璃血清瓶中，贮存于4℃冰箱，一周内用完。

分别准确称取一定量的硫酸锌、亚硒酸钠和发酵态锌硒，溶解于5mL胃液，pH2.0，于37℃恒温振荡器，55oscillation/min振荡60min。然后，用1mol/L的NaHCO3溶液调pH值至6.0，加入25mL胰液-胆汁悬浮液，用1mol/L的NaHCO3溶液调pH值至7.0，于37℃恒温振荡器上，55oscillation/min振荡120min。将消化液用pH7.0的120mmol/L NaCl和5mmol/L KCl混合溶液稀释，稀释后的消化溶液于4000rpm，4℃下离心5min，获取消化上清液，从而分别制得锌浓度为20μmol/L的锌试验液和硒为0.42μmol/L硒试验液。

    2. 锌、硒生物有效性试验：

该试验采用的模型为Caco-2细胞转运模型，即细胞培养于插入槽上的聚碳酸酯膜上，从而把培养孔分为上下2部分，细胞上部为顶部（相当于肠道肠腔侧），细胞下部为基底部（相当于浆膜层或血液侧）。分别取硫酸锌、亚硒酸钠和发酵态锌硒试验液1.5mL加入细胞顶部，同时在基底部加入2.5mL不含锌、硒的D-Hank’s液，将细胞培养于37℃恒温振荡器上，55oscillation/min振荡24h。试验结束后，取基底部D-Hank’s液，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定其中锌、硒含量。

    3. 结果

根据对图1、图2的分析表明，酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂中的锌、硒生物有效性分别为35.12%和58.45%，而硫酸锌生物有效性仅为8.74%，亚硒酸钠生物有效性为32.33%。

图3、图4是对酵母发酵态锌硒组和硫酸锌和亚硒酸钠复合组分别进行细胞毒性试验进行分析，结果表明，在相同添加量下（以金属元素计）酵母发酵态锌硒组细胞MTT活性较硫酸锌和亚硒酸钠复合组高83.10%，LDH渗漏降低了55.91%。

Claims (1)

1.一种生产酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锌源为无机锌盐，硒源为亚硒酸钠，其特征在于：包括如下步骤：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min-30min，调pH至5.0~5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0~5.2，备用；

梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中分别加入锌源和硒源，进而得到锌含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L和1200mg/L的锌培养基以及硒含量分别为0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L的硒培养基，锌培养基和锌含量为0mg/L的基础液体培养基构成锌梯度培养基，硒培养基和硒含量为0mg/L的基础液体培养基构成硒梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得的锌梯度培养基上，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，培养结束后，再分别依次培养于步骤（2）所制得的硒梯度培养基上，培养时间为24h，培养温度为30.5℃；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15~20min，并调pH至5.0~5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，一份种子培养基上接种一种酵母菌，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液或发酵废液制成的，具体制备方法如下：

a、利用糖化废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15~20min，调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

b、利用发酵废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，再在60~65℃水浴锅内水浴加热30~40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入 2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

将待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠按照重量分别取其中的20%加入步骤（6）所制得的发酵液中并混合均匀，再按照10%的接种比例向发酵液中分别接种由步骤（5）所制备的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后于30.5℃条件下进行发酵，发酵2h后，向发酵液中再次加入20%的待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠，搅拌均匀，继续发酵至6h后，向发酵液中再次加入20%的待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠，搅拌均匀，继续发酵至12h后，将剩余的40%的待发酵的无机锌盐和亚硒酸钠加入发酵液中，搅拌均匀，使发酵液中的锌含量达到1400 mg/L、硒含量达到20 mg/L，继续发酵至24h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500~4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锌硒复合饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。