CN104543400A - 一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，首先采用酒精工业黄水、麸皮、粉渣、玉米粉等工农业副产物为原料制备发酵基质，然后通过微生物筛选与驯化培养获得富锌微生物，并将其接种在所得的发酵基质中进行发酵，再将发酵后的物料进行干燥、粉碎、包装即制得产品。与化学合成的锌饲料添加剂相比，本发明采用粉渣、麸皮、酒精工业黄水等副产物作为培养原料和基质，从而扩大了资源利用，降低了锌饲料添加剂的生产成本，而且制备的发酵态锌饲料添加剂生物有效性更稳定，吸收率更高，其锌吸收率在30%~42%，是无机硫酸锌吸收率的2.3~3.3倍，是氨基酸螯合锌吸收率的2.1~3.0倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物饲料加工领域，尤其是利用微生物制备发酵态锌饲料添加剂的方法。
背景技术
锌是动物体必需的微量矿物元素之一，其参与动物体内多种酶的组成和激活等。缺锌可引起动物食欲减退、采食量和生产性能下降、皮肤和被毛损害、雄性生殖器官发育不良、母畜繁殖性能降低和骨骼异常等症状。由于大多饲料原料中锌利用率较低，因此，通过在饲料中额外添加锌制剂是满足动物体锌需要的重要措施。但是大量研究表明，无机态锌制剂的生物有效性较低，需要大量添加才能满足动物需求，同时又会造成大量锌排入环境，造成污染。近些年的研究发现，有机合成态锌制剂利用率显著高于无机态锌，但随后的一些研究也发现有机合成态锌制剂利用率并不稳定，再加上其价格高于无机态锌，使得有机合成态锌在实际生产中利用率并不高。
微生物是广泛存在于自然界的生物体，近些年来，一些有益于人体、动物体的微生物种类被发现，并被开发成保健品、药物、饲料添加剂等。
本发明从中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》批准使用的微生物中筛选可用微生物，并通过驯化培养、发酵参数筛选等，研制成本低廉、吸收利用率高的发酵态锌饲料添加剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，通过对微生物的筛选以及驯化培养获得富锌能力强的微生物菌种，并且采用酒精工业黄水、麸皮等工、农业副产物作为微生物培养基质，进行发酵态锌饲料添加剂的制备，提高锌的吸收利用率，并大大降低了有机态锌饲料添加剂的生产成本，同时达到资源再利用，降低环境污染等目的，而且也解决了制备过程中各项参数的确定及发酵物料的干燥、包装等技术问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，首先，将固体原料和液体原料以1:1~2的比例混合得到发酵底物，再向其中接种微生物进行发酵，发酵完毕后将得到的物料干燥、包装即制得产品，其中所述的微生物为经过筛选及驯化培养而获得的富锌能力强的微生物，所述制备方法具体如下：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料，其中的固体原料按照重量百分比，其组成为：锌原料8.62%、粉渣24.4%、麸皮48.2%、玉米粉18.4%、尿素0.15%、糖0.18%、碳酸氢钠0.05%，并混合均匀备用，其中所述锌原料为硫酸锌、氯化锌、氧化锌、锌粉等无机态锌；所述的液体原料为从板框压滤机的板框直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用碳酸氢钠或氢氧化钠将pH调节至6.8~7.2后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、配制含锌基础培养基和含锌梯度培养基
含锌基础培养基的制法是：将牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、锌100mg溶解于蒸馏水中并定容至1L，然后调整pH至6.8~7.2，备用；
含锌梯度培养基的制法是：按照上述含锌基础培养基的制法，将锌含量在100mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置含锌梯度培养基备用；
2.2、微生物的筛选
按照5~8%的接种比例，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别接种在步骤2.1所制备的含锌基础培养基中，并且一个含锌基础培养基上接种一种微生物，在37.2~37.6℃、55r/min的恒温培养箱内培养24h后，记录各种微生物数量，数量最多者被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的微生物菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锌梯度培养基中，然后测定微生物中的锌含量，锌含量高者为富锌能力强，从而获得富锌能力强的微生物菌种，备用。
3、微生物的接种发酵
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中经驯化培养后的微生物菌种按照5~8%的比例接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度37.2~37.6℃，培养时间24h，从而获得用于发酵的微生物菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的微生物菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照5~8%的接种比例接种于步骤1中所述的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加经步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至6.8~7.2得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于37.2~37.6℃的恒温培养箱内发酵24~28h，得到发酵物料。
4、发酵物料的干燥与包装
将步骤3.3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，直至物料含水量降至12%~14%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锌饲料添加剂成品，并真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
其中，所述的碳酸氢钠为分析纯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）与化学合成的有机态锌饲料添加剂相比，本发明采用粉渣、麸皮、酒精工业黄水等副产物作为培养原料和基质，从而扩大了资源利用，降低了锌饲料添加剂的生产成本；
（2）与化学合成的有机态锌饲料添加剂相比，本发明研制的发酵态锌饲料添加剂生物有效性更稳定，吸收率更高。采用Caco-2上皮细胞吸收模型研究发现，发酵态锌饲料添加剂锌吸收率在30%~42%，无机硫酸锌的吸收率为12.8%，氨基酸螯合锌（复合氨基酸，市售品）为14.2%。本发明提供的发酵态锌饲料添加剂吸收率是无机硫酸锌的2.3~3.3倍，是氨基酸螯合锌的2.1~3.0倍；
（3）本发明通过对微生物进行筛选和驯化培养，更具针对性，提高了微生物发酵的效率，并保证了发酵态锌饲料添加剂中具有较高的锌吸收率；
（4）提供了一种基于酒精工业黄水、麸皮等工、农业副产物为基质制作发酵态锌饲料添加剂的一系列方法步骤，包括固体物料组成与比例、培养物料化学性质调控、发酵参数筛选等。
具体实施方式
下面通过具体实施例以及相关的试验例对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，经过发酵原料的准备、微生物筛选及驯化培养、微生物的接种发酵以及发酵物料的干燥与包装得到发酵态锌饲料添加剂，所述制备方法包括以下具体步骤：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料。
固体原料包括锌原料、粉渣、麸皮、玉米粉、尿素以及作为营养补充剂的糖和碳酸氢钠，其中，锌原料为硫酸锌，并通过查找产品说明或实验室测定的方法确定锌含量；粉渣为马铃薯粉渣，风干基础，粗蛋白含量22.5%；麸皮为小麦麸，风干基础，粗蛋白含量15.3%；玉米粉为市售品，并过80目筛；尿素为市售品，使用前要求不结块、不潮解；糖可以为葡萄糖、白砂糖、红糖、糖蜜等；碳酸氢钠为分析纯。按照固体原料的重量百分比，将上述固体原料进行混合均匀备用，其具体组成为：锌原料（以锌计）8.62%、粉渣24.4%、麸皮48.2%、玉米粉18.4%、尿素0.15%、糖0.18%、碳酸氢钠0.05%。
所述的液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用氢氧化钠或碳酸氢钠将pH调节至6.8后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、配制含锌基础培养基和含锌梯度培养基
含锌基础培养基的制法是：将牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、锌100mg溶解于蒸馏水中，并定容至1L，然后调整pH至6.8，备用；
含锌梯度培养基的制法是：按照上述含锌基础培养基的制法，将锌含量在100mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置含锌梯度培养基，备用；
2.2、微生物的筛选
按照5%的接种比例，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别加入步骤2.1所制备的含锌基础培养基中，在37.2℃、55r/min的恒温培养箱内培养24h后，记录各种微生物数量，枯草芽孢杆菌数量最多，被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的枯草芽孢杆菌菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锌梯度培养基中，通过平板计数法统计在一定高锌浓度下微生物能够生存繁殖的数量，生存繁殖数量越多说明耐锌能力强；同时，在3000r/min下离心，获得微生物，采用传统湿法消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定微生物中的锌含量，锌含量高即为富锌能力强，从而获得富锌能力强的枯草芽孢杆菌菌种，备用。
3、所述微生物的接种发酵包括以下步骤：
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中经驯化培养后的枯草芽孢杆菌菌种按照5%的比例接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度37.2℃，培养时间24h，从而获得用于发酵的枯草芽孢杆菌菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的枯草芽孢杆菌菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照5%的接种比例接种于步骤1制备的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至6.8得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于37.2℃的恒温培养箱内发酵24h，得到发酵物料。
4、发酵物料的干燥与包装
将步骤3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，至物料含水量降至12%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，并过80目筛，从而获得发酵态锌饲料添加剂成品，以1000g为单位用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085Mpa。
实施例2：一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，经过发酵原料的准备、微生物筛选及驯化培养、微生物的接种发酵以及发酵物料的干燥与包装得到发酵态锌饲料添加剂，所述制备方法包括以下具体步骤：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料。
固体原料包括锌原料、粉渣、麸皮、玉米粉、尿素以及作为营养补充剂的糖和碳酸氢钠，其中，锌原料为氯化锌，并通过查找产品说明或实验室测定的方法确定锌含量；粉渣为马铃薯粉渣，风干基础，粗蛋白含量22.5%；麸皮为小麦麸，风干基础，粗蛋白含量15.3%；玉米粉为市售品，并过80目筛；尿素为市售品，使用前要求不结块、不潮解；糖可以为葡萄糖、白砂糖、红糖、糖蜜等；碳酸氢钠为分析纯。按照固体原料的重量百分比，将上述固体原料进行混合均匀备用，其具体组成为：锌原料（以锌计）8.62%、粉渣24.4%、麸皮48.2%、玉米粉18.4%、尿素0.15%、糖0.18%、碳酸氢钠0.05%。
所述的液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用氢氧化钠或碳酸氢钠将pH调节至7.0后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌18min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、配制含锌基础培养基和含锌梯度培养基
含锌基础培养基的制法是：将牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、锌100mg溶解于蒸馏水中，并定容至1L，然后调整pH至7.0，备用；
含锌梯度培养基的制法是：按照上述含锌基础培养基的制法，将锌含量在100mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置含锌梯度培养基，备用；
2.2、微生物的筛选
按照7%的接种比例，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别加入步骤2.1所制备的含锌基础培养基中，在37.4℃、55r/min的恒温培养箱内培养24h后，记录各种微生物数量，枯草芽孢杆菌数量最多，被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的枯草芽孢杆菌菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锌梯度培养基中，通过平板计数法统计在一定高锌浓度下微生物能够生存繁殖的数量，生存繁殖数量越多说明耐锌能力强；同时，在3000r/min下离心，获得微生物，采用传统湿法消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定微生物中的锌含量，锌含量高即为富锌能力强，从而获得富锌能力强的枯草芽孢杆菌菌种，备用。
3、所述微生物的接种发酵包括以下步骤：
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中经驯化培养后的枯草芽孢杆菌菌种按照7%的比例接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度37.4℃，培养时间24h，从而获得用于发酵的枯草芽孢杆菌菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的枯草芽孢杆菌菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照7%的接种比例接种于步骤1制备的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.0得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于37.4℃的恒温培养箱内发酵26h，得到发酵物料。
4、发酵物料的干燥与包装
将步骤3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，至物料含水量降至13%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，并过80目筛，从而获得发酵态锌饲料添加剂成品，以1000g为单位用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.09Mpa。
实施例3：一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，经过发酵原料的准备、微生物筛选及驯化培养、微生物的接种发酵以及发酵物料的干燥与包装得到发酵态锌饲料添加剂，所述制备方法包括以下具体步骤：
1、发酵原料的准备
所述发酵原料包括固体原料与液体原料。
固体原料包括锌原料、粉渣、麸皮、玉米粉、尿素以及作为营养补充剂的糖和碳酸氢钠，其中，锌原料为氧化锌，并通过查找产品说明或实验室测定的方法确定锌含量；粉渣为马铃薯粉渣，风干基础，粗蛋白含量22.5%；麸皮为小麦麸，风干基础，粗蛋白含量15.3%；玉米粉为市售品，并过80目筛；尿素为市售品，使用前要求不结块、不潮解；糖可以为葡萄糖、白砂糖、红糖、糖蜜等；碳酸氢钠为分析纯。按照固体原料的重量百分比，将上述固体原料进行混合均匀备用，其具体组成为：锌原料（以锌计）8.62%、粉渣24.4%、麸皮48.2%、玉米粉18.4%、尿素0.15%、糖0.18%、碳酸氢钠0.05%。
所述的液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，在密封的容器中过滤、灭菌，然后利用氢氧化钠或碳酸氢钠将pH调节至7.2后，放入冰箱中贮存备用，其中，所述的灭菌方法为：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20min，冷却。
2、微生物的筛选及驯化培养
2.1、配制含锌基础培养基和含锌梯度培养基
含锌基础培养基的制法是：将牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、锌100mg溶解于蒸馏水中，并定容至1L，然后调整pH至7.2，备用；
含锌梯度培养基的制法是：按照上述含锌基础培养基的制法，将锌含量在100mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置含锌梯度培养基，备用；
2.2、微生物的筛选
按照8%的接种比例，将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物分别加入步骤2.1所制备的含锌基础培养基中，在37.6℃、55r/min的恒温培养箱内培养24h后，记录各种微生物数量，枯草芽孢杆菌数量最多，被筛选作为发酵用的微生物菌种；
2.3、微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤2.2所筛选的枯草芽孢杆菌菌种依次培养于步骤2.1中所制备的含锌梯度培养基中，通过平板计数法统计在一定高锌浓度下微生物能够生存繁殖的数量，生存繁殖数量越多说明耐锌能力强；同时，在3000r/min下离心，获得微生物，采用传统湿法消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定微生物中的锌含量，锌含量高即为富锌能力强，从而获得富锌能力强的枯草芽孢杆菌菌种，备用。
3、所述微生物的接种发酵包括以下步骤：
3.1、微生物菌种的扩大培养
将步骤2.3中经驯化培养后的枯草芽孢杆菌菌种按照8%的比例接种于经步骤1处理所得的酒精工业黄水中进行培养，培养温度37.6℃，培养时间24h，从而获得用于发酵的枯草芽孢杆菌菌种液，备用；
3.2、制备发酵基质
取3.1所得的枯草芽孢杆菌菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照8%的接种比例接种于步骤1制备的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加步骤1所处理的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至7.2得到发酵基质；
3.3、发酵基质的发酵
将3.2所得的发酵基质置于37.6℃的恒温培养箱内发酵28h，得到发酵物料。
4、发酵物料的干燥与包装
将步骤3中所得的发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，至物料含水量降至14%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，并过80目筛，从而获得发酵态锌饲料添加剂成品，以1000g为单位用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.095Mpa。
试验例：采用Caco-2上皮细胞吸收模型研究发现，本发明所制备的发酵态锌饲料添加剂锌吸收率在30%~42%，无机硫酸锌的吸收率为12.8%，氨基酸螯合锌（复合氨基酸，市售品）的吸收率为14.2%，因此，本发明提供的发酵态锌饲料添加剂吸收率是无机硫酸锌的2.3~3.3倍，是氨基酸螯合锌的2.1~3.0倍。
Claims (4)
1.一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，首先，将固体原料和液体原料以1:1~2的比例混合得到发酵底物，再向其中接种微生物进行发酵，发酵完毕后将得到的物料干燥、包装即制得产品，所述液体原料为从板框压滤机的板框中直接收集的酒精工业黄水，然后经过滤、灭菌后pH调节至6.8~7.2得到，其特征在于：所述的固体原料按照重量百分比，其组成为：锌原料8.62%、粉渣24.4%、麸皮48.2%、玉米粉18.4%、尿素0.15%、糖0.18%、碳酸氢钠0.05%，其中锌原料为无机态锌，所述的微生物为经过筛选及驯化培养而获得的富锌能力强的微生物，微生物的筛选及驯化培养方法如下：
（1）配制含锌基础培养基和含锌梯度培养基
含锌基础培养基的制法是：将牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、锌100mg溶解于蒸馏水中，并定容至1L，然后调整pH至6.8~7.2，备用；
含锌梯度培养基的制法是：按照上述含锌基础培养基的制法，将锌含量在100mg的基础上依次递增10%，培养基的总体积为1L，依次配置含锌梯度培养基，备用；
（2）微生物的筛选
将中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录（2008）》中的微生物按照5~8%的接种量，分别接种在步骤（1）所制备的含锌基础培养基中，并且一个含锌基础培养基上接种一种微生物，在37.2~37.6℃、55r/min的恒温培养箱内培养24h后，记录各种微生物数量，数量最多者被筛选作为发酵用的微生物菌种；
（3）微生物的驯化培养
在同样的培养条件下，将步骤（2）所筛选的微生物菌种依次培养于步骤（1）中所制备的含锌梯度培养基中，然后测定微生物中锌含量，锌含量高者为富锌能力强，从而获得富锌能力强的微生物菌种，备用。
2.根据权利要求1所述的一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，其特征在于：微生物的接种发酵方法如下：
（1）微生物菌种的扩大培养
将经过权利要求1中微生物筛选以及驯化培养得到的富锌能力强的微生物菌种接种于处理过的酒精工业黄水中进行培养，其接种量为5~8%，培养温度为37.2~37.6℃，培养时间为24h，从而获得用于发酵的微生物菌种液，备用；
（2）制备发酵基质
取经扩大培养所得的微生物菌种液进行活菌检查，当活菌数达到1×109 cfu/mL时，将其按照5~8%的接种量接种于所述的固体原料中，并按照固液比1:1.5的比例添加所述处理过的酒精工业黄水，搅拌混匀，然后调整pH至6.8~7.2得到发酵基质；
（1）发酵基质的发酵
将所得的发酵基质置于37.2~37.6℃的恒温培养箱内发酵24~28h，得到发酵物料。
3.根据权利要求2所述的一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述发酵物料的干燥与包装方法是将发酵物料置于65℃电热恒温干燥箱内，并不断翻动物料，每间隔半个小时对物料进行取样测定含水量，直至物料含水量降至12%~14%即为干燥，然后将干燥后的物料取出粉碎，从而获得发酵态锌饲料添加剂成品，并真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。
4.根据权利要求1所述的一种发酵态锌饲料添加剂的制备方法，其特征在于：对所述的酒精工业黄水进行灭菌的方法是：将过滤后的酒精工业黄水在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌15~20min，冷却。
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