CN105010735B - 一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，其步骤包括培养基制备以及微生物培养、制备基础液体培养基与锰梯度培养基、微生物梯度培养、制备种子培养基、制备发酵种子、制备发酵液、微生物发酵、制作酵母发酵态锰饲料添加剂与包装。本发明提供了一种利用啤酒生产过程中糖化废水和发酵废水生产酵母发酵态锰饲料添加剂的处理方法，方法简单，容易操作，效果理想，既提高了资源利用效率，降低了生产成本，又可以对啤酒生产中的废水进行生物处理，减少了环境污染，所制备的酵母发酵态锰饲料添加剂生物有效性高，对动物的添加量低，并能提高动物的生产性能。

Description

一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂及生物技术领域，尤其是一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法。

背景技术

锰是动物体必需的微量矿物元素之一，其在动物体内的含量约0.2~0.3mg/kg。锰主要营养作用是在碳水化合物、脂类、蛋白质和胆固醇代谢中作为酶活化因子或组成部分。缺锰可导致动物采食量下降、生长减慢、饲料利用率降低、骨异常、共济失调和繁殖功能异常等。日粮添加一定量锰是满足动物体锰需要的重要措施。目前，锰主要以无机锰盐的形式添加，其吸收率一般为5%~10%，大量的锰随粪便排出污染环境。

我国是啤酒生产消费大国，在其生产过程中会产生20-30倍的废水，其中糖化废水和发酵废水中有机养分含量丰富。研究表明，糖化和发酵后排放的废水COD浓度在2000~4000mg/L，并且以可溶态的糖类、氨基酸、醇类、维生素等为主。因此，通过对其营养成分调控后，能够作为微生物的营养基质来生产一系列微生物发酵类产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，将啤酒生产过程中的废液（糖化废液和发酵废液）经过适当理化性质调控后作为发酵液，以酵母菌作为发酵菌种，对无机锰盐进行发酵处理，研制酵母发酵态的锰饲料添加剂，从而提高锰的吸收利用率，降低粪便锰排出对环境的污染。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锰为可溶解在稀酸溶液中的无机锰化合物，具体制备步骤如下：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min-30min，调pH至5.0~5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与锰梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0~5.2，备用；

锰梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入可溶解在稀酸溶液中的无机锰化合物，得到锰含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/L的培养基，并与锰含量为0mg/L的基础液体培养基构成锰梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得锰梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15~20min，并调pH至5.0~5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，一份种子培养基接种一种酵母菌，然后将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液或发酵废液制成的，具体制备方法如下：

a、利用糖化废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15~20min，调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

b、利用发酵废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，再在60~65℃水浴锅内水浴加热30~40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入 2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

将待发酵的无机锰化合物重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%待发酵的无机锰化合物，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%待发酵的无机锰化合物，搅拌均匀，使发酵液中锰含量达到1200mg/L，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的待发酵无机锰化合物，搅拌均匀，继续发酵24h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锰饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500~4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锰饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锰饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。

本发明的有益效果是：

第一，本发明提供了一种利用啤酒生产过程中糖化废水和发酵废水生产酵母发酵态锰饲料添加剂的处理方法，方法简单，容易操作，效果理想，既提高了资源利用效率，降低了生产成本，又可以对啤酒生产中的废水进行生物处理，减少了环境污染；

第二、本发明提供的酵母发酵态锰饲料添加剂生物有效性高，采用Caco-2细胞模型分析表明，本发明提供的酵母发酵态锰生物有效性为33.10%，五水硫酸锰中的生物有效性仅为6.13%，酵母发酵态锰生物有效性较五水硫酸锰高26.97%；

第三、本发明提供的酵母发酵态锰饲料添加剂对动物添加量低，采用蛋鸡饲养试验表明，当其添加量仅为五水硫酸锰的2/3（以锰计）时，蛋鸡产蛋率不但未降低，且较硫酸锰组提高了0.04%；

第四，本发明采用啤酒酵母与产朊假丝酵母联合发酵锰的方法，并提供了一种少量多次加入无机锰盐的发酵方法，而非一次性加入待发酵的锰盐，因而避免了大量无机锰盐对微生物的毒性，提高了发酵效率。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，酵母菌选择市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，所添加的锰源选择五水硫酸锰，具体制备步骤如下：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min，调pH至5.0，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与锰梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0，备用；

锰梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入五水硫酸锰，得到锰含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/L的培养基，并与锰含量为0mg/L的基础液体培养基构成锰梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得锰梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，从而使啤酒酵母和产朊假丝酵母对锰有较强的适应能力；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15min，并调pH至5.0，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液制成的，具体制备方法如下：

取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500r/min转速下离心5min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15min，调整pH至5.0，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

取待发酵的五水硫酸锰重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的五水硫酸锰，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的五水硫酸锰，搅拌均匀，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的五水硫酸锰，搅拌均匀，使发酵液中锰含量达到1200mg/L，继续发酵24h，即合计发酵时间36h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锰饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物使用双层纱布进行过滤，收取纱布上的固体物，所得滤液在3500r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，至物料水分损失至10%左右即为干燥，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锰饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锰饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085Mpa。

在酵母发酵态锰饲料添加剂制备好之后，采用原子吸收光谱法对添加剂中锰含量分析，发现锰含量为8.11g/kg。

实施例2：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，酵母菌选择市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，锰源选择五水硫酸锰，具体制备步骤如下：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌30min，调pH至5.5，制得培养基，然后将所购买的啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与锰梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.2，备用；

锰梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入五水硫酸锰，得到锰含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/L的培养基，并与锰含量为0mg/L的基础液体培养基构成锰梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得锰梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，从而使啤酒酵母和产朊假丝酵母对锰有较强的适应能力；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心10min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌20min，并调pH至5.5，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的发酵废液制成的，具体制备方法如下：

取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在4000r/min转速下离心10min，再在65℃水浴锅内水浴加热40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入 2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.5，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

取待发酵的五水硫酸锰重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的五水硫酸锰，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的五水硫酸锰，搅拌均匀，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的五水硫酸锰，搅拌均匀，使发酵液中锰含量达到1200mg/L，继续发酵24h，即一共合计发酵36h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锰饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物用双层纱布进行过滤，收取纱布上的固体物，所得滤液在4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，至物料水分损失至10%左右即为干燥，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锰饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锰饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.095Mpa。

在酵母发酵态锰饲料添加剂制备好之后，采用原子吸收光谱法对添加剂中锰含量分析，发现锰含量为8.11g/kg。

实施例3：一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，酵母菌选择市售的啤酒酵母和产朊假丝酵母，锰源选择五水硫酸锰，具体制备步骤如下：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌25min，调pH至5.3，制得培养基，然后将所购买的啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱取出复苏，培养于该培养基上24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与锰梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0，备用；

锰梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入五水硫酸锰，得到锰含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/L的培养基，并与锰含量为0mg/L的基础液体培养基构成锰梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得锰梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃，从而使啤酒酵母和产朊假丝酵母对锰有较强的适应能力；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心7min，经过测定其COD浓度在2800mg/L，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌18min，并调pH至5.2，即制成种子培养基，并将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液制成的，具体制备方法如下：

取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500r/min转速下离心7min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌18min，调整pH至5.2，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

取待发酵的五水硫酸锰重量的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的五水硫酸锰，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的五水硫酸锰，搅拌均匀，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的五水硫酸锰，搅拌均匀，使发酵液中锰含量达到1200mg/L，继续发酵24h，合计一共发酵36h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锰饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，至物料水分损失至10%左右即为干燥，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锰饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锰饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.09Mpa。

在酵母发酵态锰饲料添加剂制备好之后，采用原子吸收光谱法对添加剂中锰含量分析，发现锰含量为8.11g/kg。

本发明所制得的酵母发酵态锰饲料添加剂在动物饲料中的推荐添加量为300~800g/100kg全价料。

试验例1：利用本发明所提供的方法制备酵母发酵态锰饲料添加剂之后，对所制备的酵母发酵态锰饲料添加剂与五水硫酸锰分别采用Caco-2细胞模型分析，分析表明，本发明提供的酵母发酵态锰饲料添加剂中的锰生物有效性为33.10%，五水硫酸锰的生物有效性仅为6.13%，酵母发酵态锰生物有效性较五水硫酸锰高26.97%。

试验例2：蛋鸡饲养试验。

（1）试验设计：选取420日龄海兰褐壳蛋鸡2800只，随机分为4组，每组5个重复，每重复140只蛋鸡。具体分组为：对照组饲喂五水硫酸锰，添加水平（以Mn计）85mg/kg，试验一组、试验二组和试验三组均饲喂本专利提供的发酵态锰制剂，添加水平（以Mn计）分别为85mg/kg（与对照组添加水平相同）、56.7mg/kg（相当于对照组的2/3）和42.5mg/kg（相当于对照组的1/2）。采用3层阶梯笼养，自由采食，自由饮水，定期清粪、消毒，试验期30天。

每天记录各重复产蛋数量，每10 d对数据进行统计一次，包括产蛋率、料蛋比和死淘率。

采用SPSS13.0中的单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进行统计分析，均值的多重比较采用Duncan’s法进行，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准差(X士SD)表示。

其中，基础饲粮组成以及营养水平见表1，其中预混料为每千克饲粮提供：VA 7500IU，VD₃ 2500 IU，VE 35mg，VK₃ 1mg，VB₁ 1.5mg，VB₂ 4mg，VB₆ 2mg，VB₁₂ 0.02mg，烟酸30mg，叶酸0.55mg，泛酸10mg，生物素0.16mg，氯化胆碱420mg，Fe 64mg，Zn 72mg，Cu 15mg，I 0.4mg。

（2）试验结果

表2为发酵态锰对蛋鸡生产性能的影响。从表2中可以看出，当发酵态锰添加量与对照组相同时，发酵态锰组产蛋率较对照组提高了2.17%，料蛋比和死淘率分别降低了1.59%和27.19%；当其添加量为对照组的2/3时，产蛋率提高了0.04%，料蛋比和死淘率分别降低了0.4%和23.88%；但，当发酵态锰添加水平相当于五水硫酸锰的1/2时，产蛋率降低了4.03%，料蛋比也增加了1.59%。

（3）小结

以上结果表明，本发明提供的发酵态锰在与无机硫酸锰添加水平相同或无机硫酸锰的2/3，均可不同程度提高蛋鸡生产性能。尤其是，发酵态锰的使用可以降低其添加水平，从而减少锰随粪便排出对环境的污染。本试验结果表明，发酵态锰在蛋鸡饲料中最多可降低28.3mg/kg的添加量。

Claims (1)

1.一种利用啤酒废液生产酵母发酵态锰饲料添加剂的方法，所用的发酵菌种为啤酒酵母和产朊假丝酵母，所用的锰为可溶解在稀酸溶液中的无机锰化合物，其特征在于：包括如下步骤：

（1）培养基制备以及微生物培养

取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，用蒸馏水溶解、定容至1000mL，用高压锅在121℃灭菌20min-30min，调整pH至5.0~5.5，制得培养基，然后将啤酒酵母和产朊假丝酵母从冰箱中取出复苏，在该培养基上培养24h，以获得复活的啤酒酵母和产朊假丝酵母；

（2）基础液体培养基与锰梯度培养基制备

基础液体培养基的制法为：依次向1000ml蒸馏水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g以及酵母浸膏10g，并搅拌混匀，调整pH至5.0~5.2，备用；

锰梯度培养基的制法为：在上述基础液体培养基中加入可溶解在稀酸溶液中的无机锰化合物，得到锰含量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/L的培养基，并与锰含量为0mg/L的基础液体培养基构成锰梯度培养基，备用；

（3）微生物梯度培养

将经步骤（1）处理所获得的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别依次培养于步骤（2）所制得的锰梯度培养基中，培养时间为24h，培养温度为30.5℃；

（4）种子培养基的制备

获取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比添加3.5%的蔗糖、0.3%的尿素、0.25%的食盐、0.02%的硫化钠，混匀后121℃灭菌15~20min，并调整pH至5.0~5.5，即制成种子培养基，然后将其平均分做两份，备用；

（5）发酵种子的制备

将经过步骤（3）处理的啤酒酵母和产朊假丝酵母按照10%的接种比例分别接种于步骤（4）所制备的两份种子培养基中，一份种子培养基接种一种酵母菌，然后将接种后的培养基放置于30.5℃的恒温培养箱内培养24h，即获得啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子；

（6）发酵液的制备

发酵液是利用啤酒生产过程中的糖化废液或发酵废液制成的，具体制备方法如下：

a、利用糖化废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的糖化废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，然后按照重量比依次加入1.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.3%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并于121℃灭菌15~20min，调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

b、利用发酵废液制作发酵液：取啤酒生产过程中新鲜的发酵废液，在3500~4000r/min转速下离心5~10min，再在60~65℃水浴锅内水浴加热30~40min，加热期间不断用灭菌的玻璃棒搅拌，使发酵废液中残留的乙醇挥发，同时达到灭菌效果，然后按照重量比，向灭菌后的发酵废液中加入 2.0%的蔗糖、20%的玉米面、0.5%的尿素、0.25%的食盐以及0.02%的硫化钠，并调整pH至5.0~5.5，即可制成发酵液；

（7）微生物发酵

将待发酵的无机锰化合物按照重量取其中的20%混合在步骤（6）所制得发酵液中，置于发酵容器内，并按照10%的接种比例向发酵容器内的发酵液中接种步骤（5）所制得的啤酒酵母发酵种子和产朊假丝酵母发酵种子，然后调节温度至30.5℃进行发酵，2h后，向发酵容器内再次加入20%的待发酵的无机锰化合物，并搅拌均匀，再继续发酵至6h后，再次加入20%的待发酵的无机锰化合物，搅拌均匀，使发酵培养基中锰含量达到1200mg/L，继续发酵至12h后，加入剩余的40%的待发酵的无机锰化合物，搅拌均匀，继续发酵24h后，即合计发酵时间36h后，完成发酵过程；

（8）酵母发酵态锰饲料添加剂的制作

将步骤（7）所得的发酵产物进行过滤，收取固体物，所得滤液在3500~4000r/min条件下离心10min，获得固体沉淀物，然后将过滤所得的固体物和离心所得的固体沉淀物混合均匀，置于65℃电热恒温干燥箱内进行干燥处理，干燥后用粉碎机将其粉碎并过60目筛，从而获得酵母发酵态锰饲料添加剂；

（9）包装

以1000g为单位，将步骤（8）所获得的酵母发酵态锰饲料添加剂用复合薄膜进行真空包装，真空度为0.085~0.095Mpa。