CN108641961A - 一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法 - Google Patents

一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法，包括以下步骤：(1)将番石榴叶经烘干、造粉与灭菌处理得到预处理番石榴叶粉；(2)活化内生菌；(3)将经活化的内生菌接种到含步骤(1)中得到的预处理番石榴叶粉的固体培养基中培养获得共培养产物；(4)将步骤(3)中得到的共培养产物接种到液体培养基中培养得到内生菌种子液；(5)将步骤(4)中得到的内生菌种子液与含磷源的液体培养基加入到发酵罐中进行高密度培养得到高密度的番石榴叶内生菌。本发明通过在番石榴叶环境下高密度培养内生菌，通过代谢可大量产生具有生物活性的代谢产物，该方法具有产物性能稳定、成本低、环境友好等优点。

Description

一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种番石榴叶内生菌的培养方法。
背景技术
番石榴是我国华南地区最热销的优质水果之一，其发展前景好。番石榴生物果实清甜爽口，清甜多汁，芳香宜人，风味奇特，含有丰富的营养成分，颇受消费者的喜爱。另外，番石榴叶还有一定的药用价值，番石榴叶广泛应用于中外民间治疗糖尿病和腹泻等疾病，这是因为番石榴叶含有许多结构新颖的酚类成分，大量研究表明番石榴叶酚类成分具有降血糖、抗氧化、抗癌和抗病原微生物的作用。但因为现在的提取工艺还不成熟，不能有效的从番石榴叶中提取具有生物活性的物质，且生产成本较高。
植物内生菌泛指在健康植物寄主中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类微生物(主要为真菌和细菌)，它生活在植物的各种组织和器官内部，是植物内生态系统中的天然组成部分。在长期协同进化过程中，内生菌与植物形成了互惠互利的关系。研究表明，内生菌与植物的协同进化过程中，内生菌不仅能产生特殊的次生代谢产物，也能诱导宿主植物的次生代谢产物的合成。内生菌还能通过分泌植物激素或促使植物分泌激素，促进植物的生长，增加植物的总生物量，提高植物种子活力，促进幼苗存活和分蘖生长，从而提高药用植物的产量，增加次生代谢产物。
因此，利用内生菌生产具有生物活性的番石榴代谢产物具有一定的应用前景。虽然目前已经分离出不少能产生植物次生代谢产物的内生菌菌株，但将其应用于生产的几乎为零。这主要是因为内生菌体外培养合成次生代谢产物的含量较低，只有大规模高密度培养内生菌才有可能获得高产量的次生代谢产物。
因此如何使内生菌在体外大量、快速繁殖是一个关键问题，也是实现以内生菌代替药用植物进行次生代谢产物工业化生产的前提。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种可实现内生菌大量、快速繁殖的番石榴叶内生菌的培养方法，该方法成本低，产物性能稳定，可适用于大规模应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法，包括以下步骤：
(1)将番石榴叶经烘干、造粉与灭菌处理得到预处理番石榴叶粉；
(2)将从番石榴叶中分离筛选的内生菌(优选为广州番石榴叶中分离筛选出的能产生萜类物质的内生菌)接种于固体微生物培养基上进行内生菌培养活化；
(3)将经活化的内生菌接种到含步骤(1)中得到的预处理番石榴叶粉的固体培养基中培养获得共培养产物；
(4)将步骤(3)中得到的共培养产物接种到液体培养基中培养得到内生菌种子液；
(5)将步骤(4)中得到的内生菌种子液与含磷源的液体培养基加入到发酵罐中进行高密度培养得到高密度的番石榴叶内生菌。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(2)中，所述固体微生物培养基的组成成分包括：蛋白胨5-7.5g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖5-7g，复合维生素3.8-4.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，琼脂15g，无菌水1L；其中，所述复合维生素的组成成分按重量份计包括：1份维生素A、1份维生素B1、1份维生素B2、0.5份维生素PP、0.5份茶多酚；所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5gNaCl，无菌水100mL。上述培养基中加入微量盐溶液的作用如下：NaCl可以平衡渗透压，在培养基中起调节渗透压作用；Mg2+是EMP、TCA途径及赖氨酸产生重要的酶激活剂，组成细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基团；Fe2+是电子呼吸传递链的重要成员之一。另外，上述固体微生物培养基具有以下优点：1、碳/氮源含量合理，利于内生菌的生长；2、含有特定因子复合维生素，这些物质可以调节微生物的代谢活动，具有刺激细胞生长活性的细胞因子，从而可有效缩短活化时间。控制合理的碳/氮源含量与加入特定因子，可将内生菌的活化时间缩短了12-18h。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(2)中内生菌培养活化的工艺条件为：接种量与固体微生物培养基中碳源、氮源的比例关系为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝1.6:4-6:1-1.5，更优选的为1.6:5:1.3，并控制培养温度为27-30℃，时间为20-36h。碳源和氮源是微生物生长所必须生的营养物质，上述接种量与碳/氮源比例关系关乎到内生菌的生长繁殖过程。若碳源量过多，容易形成较低的pH值环境，不利于菌体的生长，若碳源量不足，容易引起菌体衰老和自溶；若氮源量过多，会使菌体生长过于旺盛，会出现较高的pH值环境，不利于代谢产物的积累，若氮源量不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量；另外，碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。大量实验表明，只有将接种与碳/氮源控制为上述比例关系，才能提供利于菌体快速繁殖、活化的环境。上述活化条件为菌体的最适生长条件，在此条件下，菌体活性较好，在生长稳定器期菌浓度最高。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(3)中，所述固体培养基的组成成分包括：蛋白胨4-6g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖4-6g，预处理番石榴叶粉5-7.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，琼脂15g，无菌水1L；其中，所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL。内生菌是从番石榴叶中筛选出来的，步骤(3)的固体培养基加入预处理番石榴叶粉一方面在于提供番石榴叶环境，以利于该内生菌的生长代谢；另一方面是基于本发明的目的考虑的，本发明目的是利用内生菌与番石榴叶共培养制备生物活物质，故培养基中需加入预处理番石榴叶。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(3)中培养获得共培养产物的工艺条件为：接种量与固体培养基中碳源、氮源的比例关系控制为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝2:4-6:1.4-2.0，更优选的为2:6:1.6，并控制培养温度为27-30℃，时间为4-7d。大量实验表明，上述条件为菌体的最适生长条件，在此条件下，菌体活性较好，在生长稳定期菌浓度最高。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(4)中，所述液体培养基的组成成分包括：蛋白胨4-6g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖4-6g，预处理番石榴叶粉5-7.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，无菌水1L；其中，所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5gFeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(4)中培养得到内生菌种子液的工艺条件为：控制液体培养基中内生菌的初始浓度不小于1.6×107cells/L，并控制培养温度为27-30℃，时间为2-5d，转速为150-200rpm，更优选的为170rpm。上述条件为菌体的最适生长条件，在此条件下，菌体活性较好，在生长稳定器期菌浓度最高。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(5)中，所述含磷源的液体培养基的组成成分包括：蛋白胨4-6g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖4-6g，预处理番石榴叶粉5-7.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，K2HPO40.2-0.3g(更优选为0.25g)，柠檬酸二胺0.10-0.20g(更优选为0.15g)，无菌水1L；其中，所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL。K2HPO4的加入在于提供内生菌生长繁殖所需要的磷源。柠檬酸二胺可作为缓冲溶液(与补加的氨水一起)，避免pH值波动过大，对菌体生长造成不利影响。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，所述步骤(5)中高密度培养的工艺条件为：控制内生菌种子液的体积与含磷源的液体培养基的体积比为(0.06-0.1)：1，发酵罐内的初始pH值为7.0-7.3(更优选为7.2)，溶解氧含量(氧在发酵培养液中的质量浓度)为55％-65％，培养温度为27-30℃，转速为80-100rpm(更优选为90rpm)；且所述含磷源的液体培养基采用分批加料的方式加入发酵罐中，以控制发酵罐内前期磷源为0.02-0.05g/L，后期磷源小于0.0083g/L，所述前期是指加入内生菌种子液培养5-10h，所述后期是指加入内生菌种子液培养4-5d后。在高密度培养时，由于菌体生长繁殖需要磷元素，前期内生菌大量生长，故需磷源量较多，后期内生菌生长缓慢，且磷浓度过高易导致菌体自溶(前期磷源量高对菌体自溶影响不大，这是因为菌体前期的生长速度远大于菌体自溶的速度，自溶量可以忽略)，所以需磷源量少。磷源量的控制可通控制加入的K2HPO4的量来实现，可将液体培养基采用分批加料的方式加入发酵罐中，实现补料分批培养来控制发酵罐内磷源量。通过上述磷源的控制、发酵培养条件的控制，可显著提高最终得到的内生菌的量。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，优选的，在高密度培养时，当发酵罐内pH值降至5.93时，向发酵罐中补加氨水控制发酵罐内的pH为6.5-7.2，当葡萄糖浓度后降至3.5g/L时，开始向发酵罐内补加不含磷源的液体培养基控制发酵罐内葡萄糖浓度保持在3.5-6g/L。pH值7.2为菌体最适生长pH值，随着培养时间的延长，发酵液的pH值会逐渐降低，pH值过低会导致糖代谢缓慢，发酵时间会延长，发酵液pH值降至5.93时，可以向发酵罐内流加氨水以控制pH值为6.5-7.2(pH值过高会导致菌体自溶，更优的，控制pH值为6.5)。另外，随着培养时间的延长，发酵液的糖浓度会逐渐降低，糖浓度过低，不利于菌体的生长繁殖，可通过流加不含磷源(避免产生磷源波动，影响菌体的生长发育)的液体培养基补充糖。
上述高密度培养番石榴叶内生菌的方法中，通过控制培养基成分与配比，通过发酵罐中磷源、pH值与糖浓度的控制，可缩短内生菌的培养时间，还可使内生菌大量生长，最终得到的内生菌的量较普通手段可提高6.5倍以上。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明通过在番石榴叶环境下高密度培养内生菌，通过代谢可大量产生具有生物活性的代谢产物，该方法具有产物性能稳定、成本低、环境友好等优点。
2、本发明在高密度培养内生菌时，通过控制培养基的成分与配比，可大大缩短内生菌培养的时间和显著增加内生菌的菌浓度。
3、本发明培养方法简单，易于操作，适合大规模生产应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的工艺流程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
如图1所示，一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法，包括以下步骤：
(1)番石榴叶预处理：采摘番石榴树新鲜的番石榴叶，并将番石榴叶在45℃下烘干12h，然后经研磨成细粉状，加入无菌水，经220μm滤膜过滤除去特定内生菌之外的其他杂菌；
(2)内生菌的活化与培养：将从番石榴叶中分离筛选出能产生萜类物质的内生菌接种于固体微生物培养基上进行内生菌培养活化，控制接种量与固体微生物培养基中碳源、氮源的比例关系为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝1.6:5:1.3，并控制培养温度为28℃，时间为30h；其中，固体微生物培养基的组成成分包括：蛋白胨6g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖6g/L，复合维生素4.17mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，琼脂15g/L，无菌水；其中，复合维生素溶液的组成成分按重量份计包括：1份维生素A，1份维生素B1，1份维生素B2，0.5份维生素PP，0.5份茶多酚；微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；
(3)将番石榴叶与内生菌在培养基中共培养：将经活化的内生菌接种到含步骤(1)中得到的预处理番石榴叶粉的固体培养基中培养获得共培养产物，控制接种量与固体培养基中碳源、氮源的比例关系控制为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝2:6:1.6，并控制培养温度为28℃，时间为5d；其中，固体培养基的组成成分包括：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖5g/L，预处理番石榴叶粉6.5mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，琼脂15g/L，无菌水；其中，微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；
(4)将步骤(3)中得到的共培养产物接种到液体培养基中培养得到内生菌种子液，控制液体培养基中内生菌的初始浓度为1.6×107cells/L，并控制培养温度为28℃，170rpm下摇瓶培养3d；其中，液体培养基的组成成分包括：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖5g/L，预处理番石榴叶粉6.5mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，无菌水；其中，微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；
(5)将步骤(4)中得到的内生菌种子液与含磷源的液体培养基加入到发酵罐中进行高密度培养得到高密度的番石榴叶内生菌，其中，含磷源的液体培养基的组成成分包括：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖5g/L，预处理番石榴叶粉6.5mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，K2HPO40.25g/L，柠檬酸二胺0.15g/L，无菌水；其中，微量盐溶液的组成成分包括：0.5gFeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；含磷源的液体培养基采用分批加料的方式加入发酵罐中，以控制发酵罐内前期磷源为0.0351g/L，后期磷源小于0.0083g/L，并控制加入到发酵罐内的内生菌种子液的体积与液体培养基的体积比为0.06，控制发酵罐内的初始pH值为7.2，溶解氧含量为55％，培养温度为28℃，转速为90rpm；且在培养过程中，当发酵罐中pH值降至5.93时(一般为培养2-3天后)，向发酵罐中加氨水控制发酵罐内的pH为6.5，当葡萄糖浓度后降至3.5g/L时(一般为培养36h后)，开始向发酵罐内补加不含磷源的液体培养基控制发酵罐内葡萄糖浓度保持在4.0g/L，溶解氧含量为50％左右。
按照本实施例，3-4d为菌体的对数生长期，在对数生长稳定期放罐，此时发酵液菌体OD值达到2.7，总培养时间为4-6d。本实施例相比于对比例1与对比例2的OD值分别提高7倍与19倍左右；总培养时间相比于对比例1与对比例2分别缩短了1.5倍与2倍左右。
实施例2：
如图1所示，一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法，包括以下步骤：
(1)番石榴叶预处理：采摘番石榴树新鲜的番石榴叶，并将番石榴叶在45℃下烘干18h，然后经研磨成细粉状，加入无菌水，经220μm滤膜过滤除去特定内生菌之外的其他杂菌；
(2)内生菌的活化与培养：将从番石榴叶中分离筛选出能产生萜类物质的内生菌接种于固体微生物培养基上进行内生菌培养活化，控制接种量与固体微生物培养基中碳源、氮源的比例关系为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝1.6:5:1.3，并控制培养温度为28℃，时间为24h；其中，固体微生物培养基的组成成分包括：蛋白胨6g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖6g/L，复合维生素4.17mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，琼脂15g/L，无菌水；其中，复合维生素溶液的组成成分按重量份计包括：1份维生素A，1份维生素B1，1份维生素B2，0.5份维生素PP，0.5份茶多酚；微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；
(3)将番石榴叶与内生菌在培养基中共培养：将经活化的内生菌接种到含步骤(1)中得到的预处理番石榴叶粉的固体培养基中培养获得共培养产物，控制接种量与固体培养基中碳源、氮源的比例关系控制为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝2:6:1.6，并控制培养温度为28℃，时间为7d；其中，固体培养基的组成成分包括：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖5g/L，预处理番石榴叶粉6.5mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，无菌水；其中，微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；
(4)将步骤(3)中得到的共培养产物接种到液体培养基中培养得到内生菌种子液，控制液体培养基中内生菌的初始浓度为1.6×107cells/L，并控制培养温度为28℃，170rpm下摇瓶培养3d；其中，液体培养基的组成成分包括：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖5g/L，预处理番石榴叶粉6.5mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，无菌水；其中，微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；
(5)将步骤(4)中得到的内生菌种子液与含磷源的液体培养基加入到发酵罐中进行高密度培养得到高密度的番石榴叶内生菌，其中，含磷源的液体培养基的组成成分包括：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖5g/L，预处理番石榴叶粉6.5mg/L，微量盐溶液1.5mL/L，K2HPO40.25g/L，柠檬酸二胺0.15g/L，无菌水；其中，微量盐溶液的组成成分包括：0.5gFeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL；含磷源的液体培养基采用分批加料的方式加入发酵罐中，以控制发酵罐内前期磷源为0.0351g/L，后期磷源小于0.0083g/L，并控制加入到发酵罐内的内生菌种子液的体积与液体培养基的体积比为0.06，控制发酵罐内的初始pH值为7.2，溶解氧含量为63％，培养温度为28℃，转速为90rpm；且在培养过程中，当发酵液pH值降至5.93时(一般为培养3天后)，向发酵罐中加氨水控制发酵罐内的pH为6.5，当葡萄糖浓度后降至3.5g/L时(一般为培养48h后)，开始向发酵罐内补加不含磷源的液体培养基控制发酵罐内葡萄糖浓度保持在5.5g/L，溶解氧含量为50％左右。
按照本实施例，3-4d为菌体的对数生长期，在对数生长稳定期放罐，此时发酵液菌体OD值达到3，总培养时间为4-5d。
对比例1：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(2)内生菌的活化与培养时，固体微生物培养基中未加入复合维生素。
按照本对比例，5-8d为菌体的对数生长期，在对数生长稳定期放罐，此时发酵液OD值达到0.386，总培养时间为7-12d。
对比例2：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(5)高密度培养内生菌时，液体培养基中未加入磷源K2HPO4。
按照本对比例，6-8d为菌体的对数生长期，在对数生长稳定期放罐，此时发酵液OD值达到0.142，总培养时间为8-13d。
对比例3：
本对比例与实施例1相比，不同之处在于步骤(2)内生菌的活化与培养时，控制接种量与固体微生物培养基中碳源、氮源的比例关系为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝1.6:7:0.8。
按照本对比例，5-8d为菌体的对数生长期，在对数生长稳定期放罐，此时发酵液OD值达到1.1，总培养时间为6-9d。

Claims (10)

1.一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将番石榴叶经烘干、造粉与灭菌处理得到预处理番石榴叶粉；
(2)将从番石榴叶中分离筛选的内生菌接种于固体微生物培养基上进行内生菌培养活化；
(3)将经活化的内生菌接种到含步骤(1)中得到的预处理番石榴叶粉的固体培养基中培养获得共培养产物；
(4)将步骤(3)中得到的共培养产物接种到液体培养基中培养得到内生菌种子液；
(5)将步骤(4)中得到的内生菌种子液与含磷源的液体培养基加入到发酵罐中进行高密度培养得到高密度的番石榴叶内生菌。
2.根据权利要求1所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述固体微生物培养基的组成成分包括：蛋白胨5-7.5g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖5-7g，复合维生素3.8-4.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，琼脂15g，无菌水1L；其中，所述复合维生素的组成成分按重量份计包括：1份维生素A、1份维生素B1、1份维生素B2、0.5份维生素PP、0.5份茶多酚；所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5gMgSO4·7H2O，0.5gNaCl，无菌水100mL。
3.根据权利要求1或2所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(2)中内生菌培养活化的工艺条件为：接种量与固体微生物培养基中碳源、氮源的比例关系为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝1.6:4-6:1-1.5，并控制培养温度为27-30℃，时间为20-36h。
4.根据权利要求1所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述固体培养基的组成成分包括：蛋白胨4-6g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖4-6g，预处理番石榴叶粉5-7.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，琼脂15g，无菌水1L；其中，所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL。
5.根据权利要求1或4所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养获得共培养产物的工艺条件为：接种量与固体培养基中碳源、氮源的比例关系控制为：接种量(107cells)：碳源(g)：氮源(g)＝2:4-6:1.4-2.0，并控制培养温度为27-30℃，时间为4-7d。
6.根据权利要求1所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述液体培养基的组成成分包括：蛋白胨4-6g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖4-6g，预处理番石榴叶粉5-7.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，无菌水1L；其中，所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5g NaCl，无菌水100mL。
7.根据权利要求1或6所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(4)中培养得到内生菌种子液的工艺条件为：控制液体培养基中内生菌的初始浓度不小于1.6×107cells/L，并控制培养温度为27-30℃，时间为2-5d，转速为150-200rpm。
8.根据权利要求1所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述含磷源的液体培养基的组成成分包括：蛋白胨4-6g，酵母粉1.5-3g，葡萄糖4-6g，预处理番石榴叶粉5-7.5mg，微量盐溶液1-2.3mL，K2HPO40.2-0.3g，柠檬酸二胺0.1-0.2g，无菌水1L；其中，所述微量盐溶液的组成成分包括：0.5g FeSO4·7H2O，0.25g MnCl2·4H2O，0.5g MgSO4·7H2O，0.5gNaCl，无菌水100mL。
9.根据权利要求1或8所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)中高密度培养的工艺条件为：控制内生菌种子液的体积与含磷源的液体培养基的体积比为(0.06-0.1)：1，发酵罐内的初始pH值为7.0-7.3，溶解氧含量为55％-65％，培养温度为27-30℃，转速为80-100rpm；所述含磷源的液体培养基采用分批加料的方式加入发酵罐中，控制发酵罐内前期磷源为0.02-0.05g/L，后期磷源小于0.0083g/L，所述前期是指加入内生菌种子液培养5-10h，所述后期是指加入内生菌种子液培养4-5d后。
10.根据权利要求9所述的高密度培养番石榴叶内生菌的方法，其特征在于，在高密度培养时，当发酵罐内pH值降至5.93时，向发酵罐中补加氨水控制发酵罐内的pH为6.5-7.2，当葡萄糖浓度后降至3.5g/L时，开始向发酵罐内补加不含磷源的液体培养基控制发酵罐内葡萄糖浓度保持在3.5-6g/L。
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