CN114456939B - 一种高密度培养紫草根内生菌的方法 - Google Patents

一种高密度培养紫草根内生菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高密度培养紫草根内生菌的方法，包括以下步骤：先对紫草根预处理，获得紫根草粉，再将紫草根内生菌菌株接种于含有紫根草粉的接种培养基内，培养获得紫草根内生菌共培养液，接着将紫草根内生菌共培养液接种于含有紫根草粉的发酵培养基内，然后分两个阶段进行有氧发酵培养，并且在第二阶段发酵中以流加的方式添加补料培养基，发酵结束，获得高密度紫草根内生菌。本发明的培养方法简单方便，省时省力，绿色环保，在培养紫草根内生菌的同时中添加紫草根粉，使紫草根内生菌在短时间内大量繁殖，适合大规模生产应用。

Description

一种高密度培养紫草根内生菌的方法
技术领域
本发明涉及一种高密度培养紫草根内生菌的方法，属于生物技术领域。
背景技术
紫草根，是紫草科多年生草本植物新疆紫草新藏、假紫草或滇紫草的干燥根，其种类主要分为软紫草根和硬紫草根，软紫草根呈不规则的长圆柱形、多扭曲，主要有内蒙紫草；硬紫草根呈圆锥形或圆柱形、扭曲，主要有老条紫草、关紫草、常德紫草等。紫草根具有清热凉血、解读透疹、润肠通便、抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物、镇痛、镇静的功效。目前，紫草根的来源是植物紫草，但植物紫草种植周期较长，占用大量土地面积，受天气影响较大，费时费力。
植物内生菌泛指在健康植物寄主中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类微生物(主要为真菌和细菌)，它生活在植物的各种组织和器官内部，是植物内生态系统中的天然组成部分。研究表明，植物中所含的药用成分或次生代谢产物大多是由植物内生菌所产生，内生菌也能够分泌植物激素或促使植物分泌激素，提高植物的生长活力，因此内生菌和植物之间形成了互惠互利的关系。
但是，紫草根内生菌仅存在于植物紫草根，从天然种植紫草到工业生产应用紫草根内生菌这一环节仍然鲜为人知，只有大规模高密度培养紫草根内生菌，才能够省时省力的获得紫草根有效成分，更好的应用于工业生产。鉴于此，本发明提供了一种高密度培养紫草根内生菌的方法。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种高密度培养紫草根内生菌的方法，简单方便，省时省力，绿色环保；在培养紫草根内生菌的同时中添加紫草根粉，使紫草根内生菌在短时间内大量繁殖，适合大规模生产应用，为工业生产奠定很好的基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种高密度培养紫草根内生菌的方法，包括以下步骤：
S1、预处理：先将紫草根经溶液浸泡除菌，清洗、烘干，研磨打粉，过筛，得紫根草粉；
S2、活化培养：将紫草根内生菌菌株接种于含有紫草根粉的接种培养基，振荡培养，得到紫草根内生菌共培养液；
S3、发酵培养：将紫草根内生菌共培养液接种于含有紫草根粉的发酵培养基内，然后分两个阶段进行有氧发酵培养，并且在第二阶段发酵中以流加的方式添加补料培养基，直至发酵速率为零，获得高密度紫草根内生菌。
本发明的高密度紫草根内生菌具有培养的方法步骤如下：
S1、预处理：将紫草根依次经75％乙醇、无菌水、5％次氯酸钠溶液浸泡除菌，分别浸泡3min，后用无菌水清洗3～4次，再烘干24～48h，当干燥失重值为0～1％时，进行研磨、打粉，过100目筛，得到紫草根粉；
S2、活化培养：先将紫草根粉加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养12～24h，得到紫草根内生菌共培养液；
S3、发酵培养：先将紫草根粉加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，之后先在转速300～800rpm、无菌空气通气量2～8m3/h、pH值5.5～8.0的条件下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，再后在转速300～800rpm、无菌空气通气量2～8m3/h、pH值3.5～6.5的条件下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，得到高密度紫草根内生菌。
其中，所述紫根草粉在接种培养基中的重量占比为2～9.5％；更优地，紫根草粉在接种培养基中的重量占比为2～6％，在保持高密度培养的情况下，更能减少紫根草粉用量的，其中，紫根草粉在接种培养基中的重量占比为6％，会使高密度培养紫草根内生菌的效果更加优异。
其中，所述紫根草粉在发酵培养基中的重量占比为5～21％；更优地，所述紫根草粉在发酵培养基中的重量占比为5～15％，在保持高密度培养的情况下，更能减少紫根草粉用量的，其中，紫根草粉在接种培养基中的重量占比为15％，会使高密度培养紫草根内生菌的效果更加优异。
其中，接种培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖10g，酵母提取物11.5g，蛋白胨19.5g，(NH4)2SO4 4g，K2HPO4·3H2O 18g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.2g，微量元素液Ⅰ1mL；发酵培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖10g，酵母提取物11.5g，蛋白胨19.5g，(NH4)2SO4 4g，K2HPO4·3H2O 18g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.2g，微量元素液Ⅰ1mL。
其中，第一阶段的发酵温度为25～45℃；更优地，第一阶段的发酵温度为25～40℃，在保持高密度培养的情况下，能够降低能耗，其中，第一阶段的发酵温度为40℃的发酵培养的温度环境更加适宜。
其中，第二阶段的发酵温度为10～32℃；更优地，第一阶段的发酵温度为10～25℃，在保持高密度培养的情况下，能够降低能耗，其中第一阶段的发酵温度为40℃的发酵培养的温度环境更加适宜。
其中，补料培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖600g，酵母提取物115g，蛋白胨195g，MgSO4·7H2O 10g，微量元素液Ⅱ3mL。
其中，微量元素液Ⅰ的配方：每毫升微量元素，EDTA 8.4mg，CoCl2·6H2O 2.5mg，MnCl2·4H2O 15.0mg，CuCl2·2H2O 1.5mg，硼酸3.0mg，Na2MoO4·2H2O 2.5mg，Zn(CH3COO)2·2H2O 13.0mg，柠檬酸铁100.0mg，维生素B14.5mg。
其中，微量元素液Ⅱ的配方：每毫升微量元素，EDTA 13.0mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，MnCl2·4H2O 23.5mg，CuCl2·2H2O 2.5mg，硼酸5.0mg，Na2MoO4·2H2O 4.0mg，Zn(CH3COO)2·2H2O 16.0mg，柠檬酸铁40.0mg。
本发明的有益效果：本发明的培养方法，在活化培养、发酵培养过程中培养紫草根内生菌的培养基中同时添加紫草根粉，为紫草根内生菌繁殖提供了类似紫草根的原始生长环境，使紫草根内生菌在短时间内大量繁殖，得到高密度的紫草根内生菌，终点OD600值大于105，对紫草根内生菌呈高密度培养状态；在本发明的培养方法中，采用分阶段的方式进行有氧发酵培养，同时提供了更加适宜的温度环境，大大促进紫草根内生菌生产，提高紫草根内生菌的密度；而且本发明的培养方法中还提供了一个适宜的高密度培养紫草根内生菌的培养基质体系，进一步提高高密度紫草根内生菌培养效果；本发明的培养方法成本低，易于操作，耗时短，绿色环保，适合大规模生产应用，为工业生产奠定很好的基础。
附图说明
图1为本发明高密度培养紫草根内生菌图；
具体实施方式
为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
预备例1紫草根的预处理
本发明所用的各种培养基的配方如下：
(1)LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水；(2)接种培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖10g，酵母提取物11.5g，蛋白胨19.5g，(NH4)2SO4 4g，K2HPO4·3H2O 18g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.2g，微量元素液Ⅰ1mL；(3)发酵培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖10g，酵母提取物11.5g，蛋白胨19.5g，(NH4)2SO4 4g，K2HPO4·3H2O 18g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.2g，微量元素液Ⅰ1mL；(4)补料培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖600g，酵母提取物115g，蛋白胨195g，MgSO4·7H2O 10g，微量元素液Ⅱ3mL。
其中，微量元素液Ⅰ的配方：每毫升微量元素，EDTA 8.4mg，CoCl2·6H2O 2.5mg，MnCl2·4H2O 15.0mg，CuCl2·2H2O 1.5mg，硼酸3.0mg，Na2MoO4·2H2O 2.5mg，Zn(CH3COO)2·2H2O 13.0mg，柠檬酸铁100.0mg，维生素B14.5mg；微量元素液Ⅱ的配方：每毫升微量元素，EDTA 13.0mg，CoCl2·6H2O 4.0mg，MnCl2·4H2O 23.5mg，CuCl2·2H2O 2.5mg，硼酸5.0mg，Na2MoO4·2H2O 4.0mg，Zn(CH3COO)2·2H2O 16.0mg，柠檬酸铁40.0mg。
预备例2紫草根的预处理
具体预处理过程：
将紫草根依次经75％乙醇、无菌水、5％次氯酸钠溶液浸泡除菌，分别浸泡3min，后用无菌水清洗3～4次，再烘干24～48h，当干燥失重值为0～1％时，进行研磨、打粉，过100目筛，得到紫草根粉。
筛选例1发酵方式的选择
具体方法过程如下：
先将紫草根粉按重量占比为2％的添加量加入用于接种的培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的用于接种的培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；然后，将紫草根粉按重量占比为5％的添加量加入用于发酵的培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的用于发酵的培养基，然后进行发酵培养，选用以下几种发酵方式进行：
(1)无氧发酵：在转速500rpm、pH值6.5、温度25℃条件下进行无氧发酵，直至菌体的生长速率为零。
(2)有氧发酵：在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值5.5～8.0、温度25℃条件下进行发酵，直至菌体的生长速率为零。
(3)有氧发酵分两个阶段：先在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值6、温度25℃条件下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值5.2、温度20℃条件下进行第二阶段发酵，并以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，直至菌体的生长速率为零。
(4)有氧发酵分三个阶段：在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值6.5、温度25℃条件下进行发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，接着在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值5、温度20℃条件下进行第二阶段发酵，添加补料培养基，补料培养基的重量为发酵培养基的10％，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，再在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值3.5～6.5、温度20℃条件下进行第三阶段发酵，并以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，直至菌体的生长速率为零。
上述几种发酵方式分别发酵结束后，记录的发酵终点OD600值，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003522760460000061
从上表1中发现，相比于无氧发酵培养，有氧发酵培养的终点OD值大于50，紫草根内生菌的密度高，有氧发酵培养更能促进紫草根内生菌的繁殖，另外将有氧发酵进行分阶段的有氧发酵培养，终点OD600值大于100，紫草根内生菌的密度得到很大提高，其中，相比于分三个阶段的有氧发酵培养，分两个阶段的有氧发酵培养的终点OD600值更高，紫草根内生菌呈现更好的高密度培养效果，大大提高了紫草根内生菌的繁殖量；因此，本发明选择两个阶段的有氧发酵培养，为紫草根内生菌在短时间内大量繁殖提供优异的发酵体系，实现紫草根内生菌呈高密度培养。
筛选例2培养基的选择
具体方法过程如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为2％的添加量加入用于接种的培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的用于接种的培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为5％的添加量加入用于发酵的培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的用于发酵的培养基，然后分段发酵，先在转速300～800rpm、无菌空气通气量2～8m3/h、pH值5.5～8.0、温度25℃条件下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速300～800rpm、无菌空气通气量2～8m3/h、pH值3.5～6.5、温度20℃条件下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加用于补料的培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录发酵终点OD600数值，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003522760460000071
从上表2中发现，LB液体培养基用于高密度培养紫草根内生菌的效果较差，接种培养基、发酵培养、补料培养基用于高密度培养紫草根内生菌的效果较好，并且，同时以接种培养基作为用于接种的培养基、发酵培养基作为用于发酵的培养基、补料培养基作为用于补料的培养基作为培养基质体系，培养繁殖的紫草根内生菌效果更好，终点OD600值为116.7，使紫草根内生菌呈高密度培养；因此，本发明同时以接种培养基作为用于接种的培养基、发酵培养基作为用于发酵的培养基、补料培养基作为用于补料的培养基作为培养基质体系，为高密度培养紫草根内生菌提供了更加优异的在培养基质体系。
筛选例3紫草根粉添加量的选择
具体方法过程如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按照一定的在接种培养基中的重量占比加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按照一定的在发酵培养基中的重量占比加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值5.5～8.0、温度25℃条件下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值3.5～6.5、温度20℃条件下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003522760460000081
从上表3中发现，相比于接种培养基和发酵培养基中都不添加剂紫草根粉，紫草根粉在接种培养基中的重量占比小于2％或大于9.5％以及紫草根粉在发酵培养基中的重量占比小于5％或大于21％的环境下，紫草根内生菌繁殖能够得到较多的繁殖，但是紫草根内生菌的密度还是较低，且发酵培养终点OD600值小于100；相比之下，在紫草根粉在接种培养基中的重量占比为2～9.5％和同时发酵培养基中的重量占比为5～21％的条件下的终点OD600值大于105，培养获得的紫草根内生菌的密度更高，培养效果更好；其中，紫草根粉在接种培养基中的重量占比为6％或紫草根粉在发酵培养基中的重量占比为15％时培养效果最优；因此本发明以紫草根粉在接种培养基中的重量占比为2～9.5％且同时发酵培养基中的重量占比为5～21％作为类似紫草根的原始生长环境，为紫草根内生菌提供更加合适的类似紫草根的原始生长环境，在短时间内实现紫草根内生菌大量繁殖。
筛选例4发酵温度的选择
发酵培养过程：先将紫草根粉按重量占比为15％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值5.5～8.0、一定温度下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值3.5～6.5一定温度下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表4所示。
该筛选例中获得的紫草根内生菌共培养液的活化培养过程与筛选3的活化培养过程相同，不同在于本筛选例中的是紫草根粉在接种培养基的重量占比为6％。
表4
Figure BDA0003522760460000091
Figure BDA0003522760460000101
从上表4中发现，第一阶段的发酵温度小于25℃或大于45℃以及第一阶段的发酵温度小于10℃或大于32℃，虽然培养后也能够使紫草根内生菌繁殖量增大，但是终点OD600值小于100，紫草根内生菌密度较低，相比之下，以第一阶段发酵在25～45℃且同时第二阶段发酵在10～32℃为发酵温度环境，该发酵培养终点OD600值大于108，培养获得的紫草根内生菌的密度更高，培养效果更好；其中，第一阶段的发酵温度为40℃或第二阶段的发酵温度为25℃时培养效果最优；因此，本发明以第一阶段发酵温度25～45℃且同时第二阶段发酵温度10～32℃为发酵培养环境体系，为高密度培养紫草根内生菌提供了更加适宜的发酵环境，进一步促进短时间内紫草根内生菌的大量繁殖。
实施例1高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(2)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为2％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(3)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为5％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速300rpm、无菌空气通气量2m3/h、pH值5.5、温度25℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速300rpm、无菌空气通气量2m3/h、pH值3.5、温度10℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例2高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例2的培养过程与实施例1完全相同，不同在于：在实施例2中，紫草根粉按重量占比为6％的添加量加入接种培养基内；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例3高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例3的培养过程与实施例1完全相同，不同在于：在实施例3中，紫草根粉按重量占比为7％的添加量加入接种培养基内；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例4高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(2)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为4％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(3)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为12％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速400rpm、无菌空气通气量4m3/h、pH值6.5、温25℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速400rpm、无菌空气通气量5m3/h、pH值4.5、温度20℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例5高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例5的培养过程与实施例4完全相同，不同在于：在实施例5中，紫草根粉按重量占比为15％的添加量加入发酵培养基内；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例6高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例6的培养过程与实施例4完全相同，不同在于：在实施例6中，紫草根粉按重量占比为18％的添加量加入发酵培养基内；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例7高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为6％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为15％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速500rpm、无菌空气通气量6m3/h、pH值6.5、温度35℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速500rpm、无菌空气通气量5m3/h、pH值4.5、温度15℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例8高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例8的培养过程与实施例7完全相同，不同在于：在实施例8中，第一阶段发酵温度为40℃；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例9高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例9的培养过程与实施例7完全相同，不同在于：在实施例9中，第一阶段发酵温度为45℃；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例10高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例10的培养过程与实施例4完全相同，不同在于：在实施例10中，第二阶段发酵温度为25℃；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例11高密度紫草根内生菌的培养方法
实施例11的培养过程与实施例4完全相同，不同在于：在实施例11中，第二阶段发酵温度为28℃；记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例12高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为5％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为8％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速700rpm、无菌空气通气量8m3/h、pH值7.2、温度40℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速800rpm、无菌空气通气量7m3/h、pH值5.5、温度25℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例13高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为2％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为8％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速300rpm、无菌空气通气量2m3/h、pH值5.5、温度40℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速300rpm、无菌空气通气量2m3/h、pH值3.5、温度25℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例14高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为8％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为10％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速800rpm、无菌空气通气量8m3/h、pH值7.2、温度35℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速800rpm、无菌空气通气量8m3/h、pH值5.5、温度15℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例15高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为6％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为21％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速700rpm、无菌空气通气量8m3/h、pH值7.2、温度35℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速800rpm、无菌空气通气量7m3/h、pH值5.5、温度20℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例16高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为9.5％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为21％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速700rpm、无菌空气通气量8m3/h、pH值7.2、温度45℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速800rpm、无菌空气通气量7m3/h、pH值5.5、温度32℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
实施例18高密度紫草根内生菌的培养方法
具体培养方法如下：
(1)活化培养：先将紫草根粉按重量占比为6％的添加量加入接种培养基内，接着将接种量为1％的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养24h，得到紫草根内生菌共培养液；
(2)发酵培养：先将紫草根粉按重量占比为21％的添加量加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，然后分段发酵，先在转速700rpm、无菌空气通气量8m3/h、pH值7.2、温度40℃下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0～1g/L，后在转速800rpm、无菌空气通气量7m3/h、pH值5.5、温度25℃下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，记录的发酵终点OD600值结果如表5所示。
表5
Figure BDA0003522760460000161
综上所述，通过本发明的培养方法，发酵培养的终点OD600值大于105，紫草根内生菌的密度更高，培养效果更好，紫草根内生菌呈高密度培养；本发明的培养方法中已添加紫草根粉的方式提供了优异的类似紫草根的原始生长环境，使紫草根内生菌在短时间内大量繁殖；本发明的培养方法简单、易于操作，耗时短，成本低，环境友好，适合大规模生产应用，为工业生产提供坚实的基础。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.一种高密度培养紫草根内生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、预处理：将紫草根依次经75%乙醇、无菌水、5%次氯酸钠溶液浸泡除菌，分别浸泡3min，后用无菌水清洗3~4次，再烘干24~48h，当干燥失重值为0~1%时，进行研磨、打粉，过100目筛，得到紫草根粉；
S2、活化培养：先将紫草根粉加入接种培养基内，接着将接种量为1%的紫草根内生菌菌株接种于100mL含有紫草根粉的接种培养基，置于摇床内震荡培养，温度37℃，转速225rpm，培养12~24h，得到紫草根内生菌共培养液；
S3、发酵培养：先将紫草根粉加入发酵培养基内，接着将上述的紫草根内生菌共培养液接种于5L含有紫草根粉的发酵培养基，之后先在转速300~800rpm、无菌空气通气量2~8m3/h、pH值5.5~8.0的条件下进行第一阶段发酵，持续发酵至发酵液内的残糖含量为0~1g/L，再在转速300~800rpm、无菌空气通气量2~8m3/h、pH值3.5~6.5的条件下进行第二阶段发酵，同时以速度为0.5g/L/min的流加方式添加补料培养基进行补料，持续发酵至菌体的生长速率为零时，发酵结束，得到高密度紫草根内生菌；
补料培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖 600g，酵母提取物 115g，蛋白胨 195g，MgSO4·7H2O10g，微量元素液Ⅱ 3mL；
微量元素液Ⅱ的配方：每毫升微量元素，EDTA 13.0mg，CoCl2·6H2O4.0mg，MnCl2·4H2O23.5mg，CuCl2·2H2O2.5mg，硼酸5.0mg，Na2MoO4·2H2O4.0mg，Zn(CH3COO) 2·2H2O16.0mg，柠檬酸铁40.0mg。
2.根据权利要求1所述的一种高密度培养紫草根内生菌的方法，其特征在于，所述紫草根粉在接种培养基中的重量占比为2~9.5%。
3.根据权利要求1所述的一种高密度培养紫草根内生菌的方法，其特征在于，所述紫草根粉在发酵培养基中的重量占比为5~21%。
4.根据权利要求1所述的一种高密度培养紫草根内生菌的方法，其特征在于，所述接种培养基和发酵培养基的配方完全一致；
接种培养基的配方：每升培养基中，葡萄糖10g，酵母提取物11.5g，蛋白胨19.5g，(NH4)2SO44g，K2HPO4·3H2O18g，KH2PO43g，MgSO4 1.2g，微量元素液Ⅰ 1mL；
微量元素液Ⅰ的配方：每毫升微量元素，EDTA 8.4mg，CoCl2·6H2O2.5mg，MnCl2·4H2O15.0mg，CuCl2·2H2O1.5mg，硼酸3.0mg，Na2MoO4·2H2O2.5mg，Zn(CH3COO)2·2H2O13.0mg，柠檬酸铁100.0mg，维生素B 14.5mg。
5.根据权利要求1所述的一种高密度培养紫草根内生菌的方法，其特征在于，第一阶段的发酵温度为25~45℃。
6.根据权利要求1所述的一种高密度培养紫草根内生菌的方法，其特征在于，第二阶段的发酵温度为10~32℃。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104745482A (zh) * 2014-09-12 2015-07-01 中国人民解放军第二军医大学 一种新疆紫草内生真菌及其应用
CN106916853A (zh) * 2017-02-23 2017-07-04 南京博方生物科技有限公司 利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法
CN108641961A (zh) * 2018-04-12 2018-10-12 中南大学 一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104745482A (zh) * 2014-09-12 2015-07-01 中国人民解放军第二军医大学 一种新疆紫草内生真菌及其应用
CN106916853A (zh) * 2017-02-23 2017-07-04 南京博方生物科技有限公司 利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法
CN108641961A (zh) * 2018-04-12 2018-10-12 中南大学 一种高密度培养番石榴叶内生菌的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arnebia euchroma, a Plant Species of Cold Desert in the Himalayas, Harbors Beneficial Cultivable Endophytes in Roots and Leaves;Rahul Jain等;《Frontiers Microbiology》;20210716;第4页右栏第4段 *
Molecular identification and phytochemical screening of endophytic fungi isolated from Lithospermum officinale L. roots: A new source of shikonin;Saeed Mollaei等;《Phytochemistry》;20190909;第168卷;摘要，第4页右栏第3段 *
基于高通量测序技术的濒危植物黄瑞香Daphne giraldii Nitsche根部内生真菌多样性研究;贺元等;《药学学报》;20211231;第56卷(第3期);第876页左栏第1段 *

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