CN110305802A - 一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基及培养方法 - Google Patents

一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基，该培养基是葡萄糖含量为20g/L、马铃薯浸粉含量为4g/L的PDB培养基。本发明申请还公开了利用上述培养基进行高孢子产量紫红曲霉的培养方法，包括(1)含有紫红曲霉菌株BD‑M‑4种子液的制备；(2)所述PDB培养基的灭菌；(3)接种发酵培养。本申请技术方案的优点在于，能够使该菌株产孢子数最高可达7.1×106CFU/mL，较优化前提高了29.6倍，且紫红曲霉菌株BD‑M‑4的单位体积产孢子能力具有大幅度提升。

Description

一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于微生物繁殖技术领域，具体为一种紫红曲霉M-4液态发酵繁殖的培养基及其培养方法。
背景技术
红曲霉在中国有着相当悠久的历史，古籍中有关于红曲霉用来发酵与保藏食物的记载。近年来，国内外学者在研究中发现红曲霉的主要次级代谢产物：Monacolin K、红曲色素、γ-氨基丁酸等；这些次级代谢产物大多对人体有益，被人们广泛的运用于食品、医药、化妆品等领域中。
霉菌成熟干酪是通过直投、浸泡或喷洒等形式接种霉菌成熟剂后，在干酪内部和(或)表面的特征霉菌生长而促进其成熟的干酪，霉菌干酪中较著名的有青纹干酪、卡门贝尔干酪和布里干酪等。它们利用其独特的霉菌发酵制作而成。在干酪成熟的过程干酪中，霉菌一直被认为是干酪的辅助性培养物，因为它们具有发酵代谢乳糖，产生特定质地和风味的能力。随着我国对外贸易的发展，国人对干酪文化的认知也逐渐扩大；其中霉菌干酪作为一种品类特别的干酪逐步被消费者接受，其市场消费量逐年提升。利用红曲霉发酵制作红曲霉干酪，不仅具有中国特色，更是有着较高的营养和功能价值，其中红曲霉的发酵代谢产物还具有降低胆固醇、调节心血管、抗衰老等功能，所以红曲霉干酪的开发与研究具有很强的中国特色，且其更容易被中国消费者接受。因红曲霉干酪的制作需要较高浓度的红曲霉孢子液，但是由于工业生产发酵红曲霉的产量低、成本高等问题，阻碍了与之相关的产业发展；且工艺上选择直投式加入红曲霉发酵剂较适合工业化生产，所以提高红曲霉单位体积的产孢子数显得尤为重要，产孢子数量能够直接影响红曲霉干酪的质量。因此，如何提高红曲霉液态发酵时的产孢子数具有较高的实际意义。
发明内容
为了解决现有技术中工业生产发酵红曲霉所采用的培养基孢子产量低的缺陷，本发明提供了一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基及培养方法，其实现的目的为，利用液态发酵法提高紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数，由此拓展红曲霉相关产业的发展，例如为利用红曲霉制备功能性霉菌成熟干酪的顺利开发提供理论依据和技术支撑。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明提供的一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基，该培养基是葡萄糖含量为20g/L、马铃薯浸粉含量为4g/L的PDB培养基。
氮源是为微生物生长及代谢过程中提供氮元素的物质，是构成微生物中蛋白质和核酸的主要成分，是合成菌体蛋白质、核酸和合成抗生素骨架的结构物质，氮源也能促进细胞生长影响其代谢产物的合成。一般情况下，氮源分为有机氮源与无机氮源两种，而无机氮源仅仅能提供氮元素，硝酸盐和铵盐等都属于无机氮源；马铃薯浸粉、蛋白胨和酵母浸膏均属于有机氮源，有机氮源不仅含有丰富的蛋白质和游离氨基酸等物质，还含有少量的生长因子、脂肪和无机盐等，能被微生物很好的利用，不易产生氮分解代谢产物抑制现象，是微生物生长代谢的理想的营养物质。
碳源是大多数微生物代谢生长所必须的重要营养物质，因为它在大多数微生物的细胞中含量相当高，通常占细胞干重的50％左右。碳源不仅能为生物提供能量，还能参与代谢活动。常见的碳源有能快速被利用的单糖、双糖和缓慢被利用的淀粉等多糖。
在传统发酵中多为固态发酵，固态发酵大都选用大米为碳源，而液态发酵选用的碳源种类较多，有大米粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖等。
本发明发现选用氮源选用马铃薯浸粉、碳源选用葡萄糖时，能使紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数量最多和稳定。
进一步的，所述PDB培养基中还包括碳酸钙，碳酸钙在PDB培养基中的添加量为2g/L。众所周知，金属离子不仅能对微生物的某些生长代谢过程起到促进或催化作用，还可以维持细胞渗透压。在紫红曲霉的生长过程中，能影响菌丝体生长的主要金属离子有锌、镁、钙等。锌是一种催化剂也是细胞中许多酶的辅酶，它可以促进葡萄糖被更彻底的消耗，从而能更有效的为细胞生长提供能量和碳源；镁离子不仅是许多酶类的激活剂，而且还是能影响酶活性的重要因子；钙离子不仅对酶的产生有明显的促进作用，还可以通过改变细胞膜的通透性达到促进微生物的营养吸收；钠离子能维持细胞渗透压及某些酶的稳定性；钾离子也能维持细胞渗透压。本发明发现，添加碳酸钙能够与所述基础液体培养基配合，增加协同作用，对紫红曲霉菌株BD-M-4的产孢子数有显著的提高。
本发明还提供了采用所述培养基的培养方法，包括如下步骤：
(1)含有紫红曲霉菌株BD-M-4种子液的制备：在所述PDB培养基上接种紫红曲霉菌株BD-M-4，接种发酵后，将得到的发酵液与质量浓度为80％的甘油溶液按照1:1的体积比混合，得到含有紫红曲霉菌株BD-M-4的种子液保存备用；上述紫红曲霉菌株BD-M-4的保藏编号为CGMCC 9712，分类命名：紫红曲霉Monascus purpureus，保藏时间为2014年10月8日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该菌株已经作为专利申请201510427598.7于2015年7月20日提出专利申报。
(2)在500mL锥形瓶中装入所述PDB培养基120mL，锥形瓶内放入玻璃珠10颗，在121℃，高温高压灭菌锅下灭菌20min；
(3)待所述PDB培养基温度降至常温时，使用步骤(1)得到的种子液进行接种，接种量为3％，接种完成后在自然PH条件下，于30℃、90r/min的水平摇床上培养。
本发明选择的液态发酵不容易受到污染、发酵情况好控制、生产效率高，与固态发酵相比之下较适合大规模工业化生产。
进一步的，该方法还包括(4)在无菌操作台进行梯度稀释和涂布平板：将步骤(3)得到的培养液进行梯度稀释，稀释后用PDA培养基涂布平板，涂布完成后放入30℃恒温恒湿培养箱中培养后进行平板计数即可。
进一步的，所述步骤(1)的具体操作方法为：在500mL的锥形瓶中装入所述PDB培养基100mL，然后进行接种，在30℃、90r/min的水平摇床上培养3天后，从中取20mL装入另一瓶装有300mL所述PDB培养基的锥形瓶中，在30℃、90r/min的水平摇床中培养发酵1天后，用无菌4层纱布进行过滤，过滤后在离心管中按照1:1的体积比装入所述甘油溶液和过滤后的发酵液，即得到含有紫红曲霉菌株BD-M-4种子液，并将该种子液放入-30℃低温保存箱中冷冻保存。
进一步的，所述步骤(3)培养时间为72h。
进一步的，所述步骤(3)中培养传代数为2代。
本发明发现，影响紫红曲霉菌株BD-M-4液态发酵繁殖的因素不仅是培养基的成分，对于培养过程的pH条件，培养的时间、培养传代的代数都会对其产孢子数量造成影响，优选上述培养条件的具体操作参数条件，与培养基共同配伍，能够使该菌株产孢子数最高可达7.1×106CFU/mL，较优化前提高了29.6倍，紫红曲霉菌株BD-M-4的单位体积产孢子能力得到大幅度提升。
本发明采用上述技术方案，有益效果包括：本发明选择的液态发酵不容易受到污染、发酵情况好控制、生产效率高，与固态发酵相比之下较适合大规模工业化生产，与本发明的培养基配合，能够显著提高紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数，由此拓展红曲霉相关产业的发展，为利用红曲霉开发出相关产品提供理论依据和技术支撑。
附图说明
图1是本发明氮源含量对菌株产孢子数的影响曲线图。
图2是本发明碳源含量对产孢数的影响曲线图。
图3是本发明pH对菌株产孢子数的影响曲线图。
图4是本发明装液量对菌株产孢子数的影响曲线图。
图5是本发明金属离子对菌株产孢子数的影响曲线图。
图6是本发明传代次数对菌株产孢子数的影响曲线图。
图7本发明时间对菌株产孢子数的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作出进一步的说明。本发明中没有特殊说明的操作方法都是现有技术，没有特殊说明的操作条件也都是常温常压下，试剂均为市售自购。
实施例一：本发明提供的液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基，该培养基是葡萄糖含量为20g/L、马铃薯浸粉含量为4g/L的PDB培养。
进一步的，所述PDB培养基中还包括碳酸钙，碳酸钙在PDB培养基中的添加量为2g/L。
本发明还提供了采用所述培养基的进行高孢子产量紫红曲霉的培养方法，包括如下步骤：
(1)含有紫红曲霉菌株BD-M-4种子液的制备：在所述PDB培养基上接种紫红曲霉菌株BD-M-4，接种发酵后，将得到的发酵液与质量浓度为80％的甘油溶液按照1:1的体积比混合，得到含有紫红曲霉菌株BD-M-4的种子液保存备用；
(2)在500mL锥形瓶中装入所述PDB培养基120mL，锥形瓶内放入玻璃珠10颗，在121℃，高温高压灭菌锅下灭菌20min；
(3)待所述PDB培养基温度降至常温时，使用步骤(1)得到的种子液进行接种，接种量为3％，接种完成后在自然PH条件下，于30℃、90r/min的水平摇床上培养。
进一步的，该方法还包括(4)在无菌操作台进行梯度稀释和涂布平板：将步骤(3)得到的培养液进行梯度稀释，稀释后用PDA培养基涂布平板，涂布完成后放入30℃恒温恒湿培养箱中培养后进行平板计数即可。这里的梯度稀释可以采用现有技术的任意一种，例如，稀释梯度10-1为浓度为0.9％的生理盐水90mL加上接种培养后的液体培养基10mL；10-2为抽取1mL梯度10-1溶液放入一支装有9mL生理盐水的试管中，以此类推。
进一步的，所述步骤(1)的具体操作方法为：在500mL的锥形瓶中装入所述PDB培养基100mL，然后进行接种，在30℃、90r/min的水平摇床上培养3天后，从中取20mL装入另一瓶装有300mL所述PDB培养基的锥形瓶中，在30℃、90r/min的水平摇床中培养发酵1天后，用无菌4层纱布进行过滤，过滤后在离心管中按照1:1的体积比装入所述甘油溶液和过滤后的发酵液，即得到含有紫红曲霉菌株BD-M-4种子液，并将该种子液放入-30℃低温保存箱中冷冻保存。
进一步的，所述步骤(3)培养时间为72h。
进一步的，所述步骤(3)中培养传代数为2代。第二代为从第一代结束时培养基中抽取发酵液按照3％的接种量接种到新配制的PDB培养基中，培养三天即可。
以下通过试验说明，本发明具体选择出的培养基的成分、用量、以及培养方法中具体用到的时间、传代数等具体操作条件，具有显著提高紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数量的作用，需要说明的是，本发明在做出技术方案的过程中是进行了大量试验验证的，以下仅是列举了部分试验例而已。
1.实验方法
1.1培养基的制备
基础液体培养基：马铃薯葡萄糖(PDB)培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯浸粉4g/L)，pH自然。
固体培养基：马铃薯葡萄糖(PDA)培养基，pH自然。
种子保存液：基础液体培养基50％，浓度为80％的甘油50％，pH自然。
以上培养基均在121℃条件下，灭菌20min。
种子培养液制备：在500mL的锥形瓶中装液量100mL的PDB中进行接种，在30℃、90r/min的水平摇床上培养3天后，从中取20mL进入另一瓶装液量为300mL的PDB中，在30℃、90r/min的水平摇床中培养1天后，用无菌4层纱布对300mL PDB发酵液进行过滤。一个1mL离心管中装入0.5mL(浓度为80％)甘油和0.5mL过滤后的PDB发酵液作为种子液，并将种子液离心管放入-30℃低温保存箱中冷冻保存。
液体发酵培养制备：将培养好的种子液按3％的接种量放入装液量为100mL PDB的500mL锥形瓶中，八层纱布封好，在30℃、90r/min的水平摇床上培养3天。
1.2培养方法和菌落计数
采用梯度稀释和涂布平板法进行孢子数的测定。根据GB 4789.15-2016《食品国家安全标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》的标准进行测定。
在编好序号的500mL锥形瓶中装入配制好的100mL液体培养基，每个锥形瓶放入玻璃珠10颗，在121℃，高温高压灭菌锅下灭菌20min。待液体培养基温度降至常温时使用种子液进行接种，每瓶接种量为3％。不同条件下的液体培养基在接种完成后于30℃、90r/min的水平摇床上培养3天，培养3天后在无菌操作台进行梯度稀释和涂布平板。
稀释梯度10-1为浓度为0.9％的生理盐水90mL加上接种培养后的液体培养基10mL；10-2为抽取1mL梯度10-1溶液放入一支装有9mL生理盐水的试管中，以此类推，本实验具体稀释梯度根据实验需要而定。稀释后用固体培养基涂布平板，每个稀释梯度取100μL进行涂布，并做平行样。涂布完成放入30℃恒温恒湿培养箱培养3天后进行平板计数。
1.3氮源种类及含量对菌株产孢子数的影响
(1)氮源种类的选择
固定碳源，改变氮源进行单因素实验。选用葡萄糖为固定碳源(2.0g/100mL)，选择马铃薯浸粉、蛋白胨和酵母浸膏为氮源，测定氮源含量均为0.4g/100mL时对产孢子数量的影响。培养方法同1.2。
(2)氮源含量的确定
根据氮源种类选择的结果可知，马铃薯浸粉较优于其它所选氮源种类，因此选用马铃薯浸粉做氮源含量的优化实验。碳源种类及含量固定为2.0g葡萄糖每100mL，氮源固定为马铃薯浸粉，含量分别取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6(g/100mL)这5个水平。培养方法同1.2。
1.4碳源种类及含量对菌株产孢子数的影响
(1)碳源种类的选择
由上一个实验确定氮源及其含量，固定氮源改变碳源种类，选择大米粉、甘油、蔗糖和葡萄糖为碳源进行优化实验。培养方法与1.2相同。
(2)碳源含量的确定
根据碳源种类选择的结果可知，葡萄糖较优于其它所选碳源种类，因此选用葡萄糖做碳源含量的优化实验。固定氮源为每100mL中有0.2g马铃薯浸粉，碳源含量分别取1.6、1.8、2.0、2.2、2.4(g/100mL)这5个水平。培养方法与1.2相同。
1.5pH对菌株产孢子数影响
本实验在基础液体培养基的基础上，测定不同pH条件下对菌株产孢子数的影响。首先对自然状态下的pH进行测定，自然状态下测得的pH值为6.72。
在编好序号的500mL锥形瓶中各加入100mL基础液体培养基，用pH计测量后用乳酸和氢氧化钠调节pH值，将pH值分别调至5.42、5.72、6.02、6.32、6.72、7.02、7.32、7.62。培养方法同1.2。
1.6装液量对菌株产孢子数的影响
本实验在基础液体培养基的基础上，测定装液量对产孢子数的影响。在编好序号的500mL锥形瓶中分别加入80、100、120、140、160mL的基础液体培养基。培养方法同1.2。
1.7金属离子对菌株产孢子数的影响
本实验在基础液体培养基的基础上，测定不同金属离子对菌株产孢子数的影响。
在编好序号的500mL锥形瓶中各加入100mL基础液体培养基，然后根据编号分别加入2g/L的CaCl2、CaCO3、NaCl、MgCl2、ZnSO4和KCl等金属离子化合物。培养方法同1.2。
1.8传代次数对菌株产孢子数的影响
根据上述各条件最高值作为最优的培养基进行实验。第一代为菌株接种培养基发酵三天，进行梯度稀释和涂布平板。第二代为从第一代结束时培养基中抽取发酵液按照3％的接种量接种到新配制的培养基中，培养三天即可，进行梯度稀释和涂布平板。以此类推为第三代、第四代和第五代。培养方法同1.2。
1.9培养时间对菌株产孢子数的影响
根据上述各条件最高值，培养方法见1.2，培养完成后发酵液分别在培养第3、4、5、6、7、8、9和10天后进行梯度稀释，菌落计数方法同1.2。
1.10数据处理与分析
实验数据采用Excel统计，作图采用origin 9.0软件，并用SPSS22.0对数据进行显著性分析。
2结果与讨论
2.1氮源种类及水平对菌株产孢子数的影响
2.1.1氮源种类的确定
实验以葡萄糖为固定碳源，选择氮源分别为蛋白胨、马铃薯浸粉和酵母浸膏配制液体培养基。根据平行样品的平板计数结果计算出平均数值，见表1。
表1氮源种类对菌株产孢子数的影响
注：“-”表示没有菌落形成。
由表1可知，紫红曲霉菌株BD-M-4在碳源种类和含量相同的条件下，氮源种类不同，且固定含量不变时，马铃薯浸粉作为氮源时，菌株产孢子数最多，其产孢子数明显多于蛋白胨作氮源时产孢子数(p＜0.05)。而酵母浸膏作为氮源时，计数平板上并没有菌落生长，可能酵母浸膏无法被紫红曲霉M-4消化利用，导致菌株无法生长繁殖。蛋白胨中虽然有许多蛋白质及游离多肽，但是马铃薯浸粉中也含有大量蛋白质，甚至还有一些生长因子，作为可以用来培养霉菌的PDA培养基中都是以马铃薯浸粉作为氮源，因此紫红曲霉菌株BD-M-4的最佳氮源种类是马铃薯浸粉。
2.1.2氮源含量的确定
氮源和碳源一样，是大多数微生物生长及细胞构建过程中必不可少的重要因素。在确定氮源种类为马铃薯浸粉后，对氮源含量进行一定的优化，选择含量分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6(g/100mL)配制液体培养基，接种发酵并菌落计数。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见图1。
由图1可以看出，氮源是紫红曲霉生长代谢过程中必不可少的，氮源过多或过少都对菌株产孢子数有一定的影响。在氮源含量较低时，逐渐增加马铃薯浸粉的含量，菌株产孢子数也会逐渐增加，当马铃薯浸粉含量为0.4g/mL时，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数最多。当继续提高氮源含量时，反而会抑制紫红曲霉的产孢子情况，表明菌株在营养充足的情况下，菌体会大量繁殖，而产孢子等途径被抑制。所以马铃薯浸粉的最佳添加量为0.4g/mL。
2.2碳源种类及水平对菌株产孢子数的影响
2.2.1碳源种类的确定
选用大米粉、甘油、蔗糖、葡萄糖作为碳源的来源。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见表2。
表2碳源种类对菌株产孢子数的影响
在微生物生长期间，紫红曲霉菌株BD-M-4能快速消耗碳源，消耗过程中产生的一些代谢产物累积在培养基中，会对紫红曲霉的生长代谢起到一定的抑制作用。在培养期间，肉眼可观察到用葡萄糖作为碳源的培养基中菌丝体较蔗糖与大米粉多，但是蔗糖和葡萄糖菌丝体数量大致相同。
从表2可知，当氮源确定为马铃薯浸粉且含量为4g/L时，用葡萄糖作为碳源时，同等培养条件下紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数量显著多于用大米粉、甘油和蔗糖作为碳源时的产孢子数量(p＜0.05)。因此，选用葡萄糖作为紫红曲霉菌株BD-M-4的最佳碳源种类。
2.2.2碳源含量的确定
确定以葡萄糖作为碳源，选择葡萄糖含量分别为1.6、1.8、2.0、2.2、2.4(g/100mL)配制液体培养基，通过对不同含量葡萄糖进行发酵培养来选择最优的碳源含量。葡萄糖作为能被快速利用的单糖，经常被用来作为霉菌、酵母菌和真菌等微生物的碳源。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见图2。
由图2可知，葡萄糖添加量在16g/L～20g/L范围时，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数量逐渐增多，当葡萄糖含量在20g/L时，产孢子数达到最大值，之后继续增加葡萄糖的含量，菌株产孢子数反而降低。葡萄糖虽然是本实验中紫红曲霉菌株BD-M-4的最优碳源，但是从图可知，葡萄糖含量过多或是过少都对菌株产孢子不利，在含量较少时由于营养不充足，导致紫红曲霉无法大量繁殖，产孢子数量也较少；但当含量过多时，紫红曲霉在生长过程中所产生的一些代谢物不断累积，可能会对紫红曲霉的生长起到抑制作用，也不利于产生过多的孢子数。所以葡萄糖添加量为20g/L时最有利于紫红曲霉菌株BD-M-4产生孢子。
2.3pH对菌株产孢子数的影响
pH值对微生物的生长和代谢产物的合成很重要，pH值对酶活力有很大的影响，影响对基质的利用效率和细胞的结构，从而影响菌体的生长。此外，pH还对细胞膜所带的电荷有所影响，会改变细胞膜的通透性，影响细胞膜对外界营养物质的吸收与代谢物的排放；pH甚至还可能影响营养物质的利用率。
所有微生物都有适合自己生长的最适pH范围，因此选择最适的pH更有利于紫红曲霉的生长繁殖，从而提高其产孢子数。在基础液体培养基的基础上改变pH，所选用pH范围在5.42～7.62之间。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，结果见图3。
由图3所示，初始pH对紫红曲霉菌株BD-M-4的生长也有着一定的影响，紫红曲霉菌株BD-M-4虽然是嗜酸性菌，但是在过酸环境下，还是会影响它的生长代谢及产孢子情况。在培养基碱性pH条件下也会不利于菌株的产孢子情况。当培养基pH在5.42～6.32范围时，pH值逐渐提高时，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数逐渐增多；培养基自然条件下pH值(6.72)时，菌株M-4产孢子数达到最大值；之后继续提高培养基pH值，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数迅速降低。这可能是过高的pH钝化了紫红曲霉菌株BD-M-4产生孢子代谢过程中的酶类，使得菌体产生孢子数迅速降低。所以培养基自然pH为6.72条件下是最有利于紫红曲霉菌株BD-M-4代谢产生孢子。
2.4装液量对菌株产孢子数的影响
氧元素是不仅是大多数微生物存在的必要条件，同时还是生物体重要代谢过程中不可缺少的元素，在好氧微生物的生长代谢中极其重要。紫红曲霉就是好氧微生物，在培养过程中，溶氧量也成为影响菌株产孢子数的因素。在上述各因素高值的条件下，在500mL的三角瓶中，分别将装液量设为80mL、100mL、120mL、140mL、160mL。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见图4。
由图4可知，随着装液量的增加，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数先上升，然后缓慢下降。当装液量为80mL/500mL时菌株产孢子数最少；当装液量在80～120mL/500mL之间时，菌株产孢子数逐渐上升；当装液量为120mL/500mL时，菌株产孢子数高于其它装液量下的产孢子数，达到最大值；当装液量大于120mL/500mL后，菌株产孢子数开始缓慢下降。由此可以推测装液量太多可能不利于培养基中氧气的扩散，会导致菌株发酵供氧量不足，对紫红曲霉的生长和代谢产孢子状况不利；但装液量太少的话，氧含量会过多，导致菌株大量产生菌丝体，而产生孢子的数量就会偏少。考虑到时间和效率综合因素，最有利于紫红曲霉菌株BD-M-4代谢产孢子数的装液量为120mL培养液(500mL锥形瓶)。
2.5金属离子对菌株产孢子数的影响
在基础液体培养基的条件下，加入2g/L的金属离子来源分别为CaCl2、CaCO3、NaCl、MgCl2、ZnSO4、KCl。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见图5。
由图5可知，加入不同的金属离子对紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数量影响较大；锌离子虽然作为多种酶的辅酶，但是在培养基中添加ZnSO4后，反而完全抑制紫红曲霉菌株BD-M-4产生孢子，产孢子数为0；而加入CaCO3的培养基中菌株产孢子数量最大；其次是加入KCl的培养基；再之后时CaCl2和NaCl，但两者的产孢子数较为相近；加入金属离子与不添加金属离子的培养基相对比，加入合适的金属离子能显著提高紫红曲霉的代谢产孢子数(p＜0.05)。因此，对紫红曲霉菌株BD-M-4的产孢子数有显著提高的金属离子来源是CaCO3。
2.6传代次数对菌株产孢子数的影响
检测紫红曲霉在传代后的活性是否优于不经传代的紫红曲霉，同时也能够观察紫红曲霉传代后是否具有稳定性。第一代在30℃、90r/min的水平摇床上培养3天后，进行传代培养，传代后在同样的环境下培养3天，进行涂布平板计数，以此类推。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见图6。
由图6可知，菌株传代从第一代到第二代时，相同情况下培养计数，紫红曲霉菌株BD-M-4的产孢子数大幅度提高，较为显著(p＜0.05)。从第二代到第五代，菌株产孢子数几乎持平，未见明显增加或减少情况。说明紫红曲霉菌株BD-M-4从第一代培养后，培养基中已有较多的孢子数目，再接种到新的培养基时，在充足营养的条件下，菌株开始迅速生长繁殖和代谢产生孢子，之后再接种到新的培养基时，相较于第二代来说无明显变化。菌株传代一次培养与没传代进行比较，发现得出传代后菌株产孢子数明显优于没有传代的产孢子数。所以，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数较好的传代次数为2代。
2.7培养时间对菌株产孢子数的影响
微生物发酵终点对于提高产物的生产效益十分关键。在生长发酵过程中，有的代谢产物会随着菌体的增加而增加，有的代谢产物则与菌体的生长无显著关系。一般情况下，微生物在进入新环境中会先进行适应，此时生物量几乎不变；而在1天过后，微生物进入调整期，此时生物量增长缓慢，不明显；在3天后，随着时间的推移，生物量会呈现出快速增长，在此阶段只要培养基内营养充足，紫红曲霉会开始大量繁殖，几乎达到最大值，所以选择这个阶段会在一定程度上对提高产孢子数量有益处。在上述各研究条件最大数值情况下，分别培养3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d。根据平行样品的计数结果计算出平均数值，见图7。
从图7可知，紫红曲霉菌株BD-M-4在3～6d中随着时间的增长，产孢子数也逐渐增多，其中4～6d的增长量最大，在第6天时菌落计数最多；但培养6天后菌落数量不但没有上升，还开始缓慢下降，从第9天开始大量减少。由此可见，发酵前期处于紫红曲霉菌株BD-M-4的生长繁殖产生孢子阶段，在第6天达到最大值，之后开始减少。这可能是因为在发酵后期，营养底物减少、pH值上升、生长空间减少等原因造成菌株产孢子下降，而孢子与孢子之间也竞争营养物质和生存空间，引起产生的部分孢子失活，从而菌落计数减少。
与现有技术采用的基础培养基条件下，培养3d得到的菌株产孢子数为2.4×105CFU/mL。在本发明培养基和配方方法培养条件下，紫红曲霉菌株BD-M-4产孢子数最高可达7.1×106CFU/mL，较优化前提高了29.6倍，效果比较显著，菌株单位体积的产孢子能力得到大幅度提升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基，其特征在于，该培养基是葡萄糖含量为20g/L、马铃薯浸粉含量为4g/L的PDB培养基。
2.根据权利要求1所述的液态发酵繁殖高孢子产量紫红曲霉的培养基，其特征在于，所述PDB培养基中还包括碳酸钙，碳酸钙在PDB培养基中的添加量为2g/L。
3.一种采用权利要求1-2任意一项所述培养基的进行高孢子产量紫红曲霉的培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)含有紫红曲霉菌株BD-M-4种子液的制备：在所述PDB培养基上接种紫红曲霉菌株BD-M-4，该菌株保藏编号为：CGMCC 9712，接种发酵后，将得到的发酵液与质量浓度为80％的甘油溶液按照1:1的体积比混合，得到含有紫红曲霉菌株BD-M-4的种子液保存备用；
(2)在500mL锥形瓶中装入所述PDB培养基120mL，锥形瓶内放入玻璃珠10颗，在121℃，高温高压灭菌锅下灭菌20min；
(3)待所述PDB培养基温度降至常温时，使用步骤(1)得到的种子液进行接种，接种量为3％，接种完成后在自然PH条件下，于30℃、90r/min的水平摇床上培养即得到高孢子产量的紫红曲霉。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，该方法还包括(4)在无菌操作台进行梯度稀释和涂布平板：将步骤(3)得到的培养液进行梯度稀释，稀释后用PDA培养基涂布平板，涂布完成后放入30℃恒温恒湿培养箱中培养后进行平板计数即可。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作方法为：在500mL的锥形瓶中装入所述PDB培养基100mL，然后进行紫红曲霉菌株BD-M-4接种，在30℃、90r/min的水平摇床上培养3天后，从中取20mL装入另一瓶装有300mL所述PDB培养基的锥形瓶中，在30℃、90r/min的水平摇床中培养发酵1天后，用无菌4层纱布进行过滤，过滤后在离心管中按照1:1的体积比装入所述甘油溶液和过滤后的发酵液，即得到含有紫红曲霉菌株BD-M-4种子液，并将该种子液放入-30℃低温保存箱中冷冻保存。
6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)培养时间为72h。
7.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养传代数为2代。
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