CN112359074A - 一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法。本发明将富集培养后的蛋白核小球藻离心浓缩接种于BG‑11培养液中，微藻光照培养3‑6天，黑暗组用锡纸包裹，向瓶中分别加入4‑30 g/L乙酸，于24‑26°C，pH7‑9条件下培养，测定藻液生物量，在藻细胞生长进入稳定期后对藻液进行收获，提取藻细胞内的油脂。本发明在异养条件下向培养基中加入乙酸，在刺激微藻油脂积累的同时保持生物量，采用本发明方法的蛋白核小球藻的油脂产量以及生物量显著增加。本发明培养方法简便且易于操作，能在短时间内显著提高生物量和脂质含量，降低微藻养殖成本，最大程度地实现微藻生物柴油经济性的潜在高效的生产途径。

Description

一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法。
背景技术
自18世纪开始工业化以来，化石燃料的消耗量一直在不断增加。石油基燃料在促进经济增长的同时也引起了严重的环境问题，例如大气中二氧化碳（CO2）含量增加。人们普遍认为化石燃料终将被在环境和经济上可持续的可再生碳中性燃料替代。目前的生物柴油主要来自富含油的种子，但是由于原料的限制，该工艺尚未被视为替代化石燃料的方法。与第一代和第二代生物燃料原料相比，微藻具有许多优势，例如更高的含油量，更高的光合作用率，废水以及油气提取产生的水的生长能力，比油料作物，无需为粮食，饲料和其他农作物产品的生产做出妥协，被称为化石燃料的优质替代品。但是由于微藻的培养成本高、生物量产率和油脂产率较低，限制了微藻的商业化发展。
近年来，异养培养被认为是高效培养藻类以获得丰富藻类生物量的一种有前途的方法。在异养栽培中，光需求被消除。此外，通过同化外源碳源，藻类细胞的生长得到极大的增强，生物量密度高，培养周期短，产物的积累也能得到显著增强（Kuei-Ling Yeh, Chun-Yen Chen, Jo-Shu Chang. pH-stat photoheterotrophic cultivation of indigenousChlorella vulgaris ESP-31 for biomass and lipid production using acetic acidas the carbon source. Biochemical Engineering Journal, 2012, 64, 1-7.）。同时，异养培养中获得的高细胞密度有效地降低了生物量收获成本。在该培养模式下，外源碳源是异养培养中必不可少的元素。迄今为止，大多数关于在微藻上生产脂质的研究都是以葡萄糖作为唯一碳源的，糖基碳源有利于提高微藻的生物量和油脂产量，但其成本约占培养基总成本的80%，并且在自养和混养条件下容易受到细菌污染。因此，目前选择合适的碳源代替葡萄糖用于藻类异养培养，从而获得最佳的脂质生产性能也是至关重要的。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法，本发明将藻液接种到含不同浓度乙酸的BG-11培养液中进行异养培养，并在藻细胞生长进入稳定期后对藻液进行收获，利用有机溶剂提取藻细胞内的油脂。本发明操作简单，在刺激微藻维持生物量的同时又提高油脂含量。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）藻种液的制备：在24-26°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照4-6天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取步骤（1）制备的藻种液接种于BG-11培养基，同时分别向培养基中加入乙酸溶液，培养条件为24-26°C，调节pH为7-9，黑暗诱导培养条件下培养3-6天；
（3）待步骤（2）中藻液培养完成后收获，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
优选地，步骤（1）所述的微藻为蛋白核小球藻Chlorella Pyrenoidosa（FACHB-1216），购买自中国科学院淡水藻种库。
优选地，步骤（2）所述黑暗诱导培养下每升藻液中乙酸加入量为4-30 g，研究发现，乙酸浓度在过低或过高条件下，对微藻的生长具有抑制作用。
优选地，步骤（3）所述，微藻油脂提取的有机溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，所述混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为2:1。
本发明异养条件下所述的稳定期微藻生物量范围为130-160 mg/L，油脂含量范围为25%-40%。
有益效果
（1）本发明提供了一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法，在显著刺激微藻油脂积累的同时提高了微藻生物量，向BG-11培养基中投加乙酸后，生物量是不添加乙酸培养基的8.26倍，油脂含量超过25%。
（2）本发明的乙酸，作为挥发性脂肪酸的一种，是厌氧消化处理后的重要中间产物，可来源于农业废弃物、食品废弃物和污水污泥等有机废物的厌氧发酵过程，来源广泛。如果厌氧发酵产氢工业中挥发酸无法有效利用反而还会对氢气的产生造成抑制，由于其对此类工业的不可利用性及产能的抑制性，使乙酸作为一种廉价的外加碳源出现在人们的视野中。
附图说明
图1为实施例1-5和对比实例1-5中微藻的生物量变化曲线；
图2为实施例1-5和对比实例1-5中微藻的油脂含量。图2中0、2、4、6、10、20、30、50代表BG-11培养液中乙酸投加浓度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。
本发明实施例中所用的蛋白核小球藻Chlorella Pyrenoidosa（FACHB-1216），购买自中国科学院淡水藻种库。
实施例1
（1）藻种液的制备：在26°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照4天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入4 g/L乙酸，培养条件为26°C、pH为8，黑暗诱导培养3天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为4 g/L时，蛋白核小球藻的最高生物量为132.77 mg/L，最终收获油脂含量为26.02%。
实施例2
（1）藻种液的制备：在26°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照4天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入6 g/L乙酸，培养条件为26°C、pH为8，黑暗诱导培养3天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为6 g/L时，蛋白核小球藻的最高生物量为142.36 mg/L，最终收获油脂含量为26.33%。
实施例3
（1）藻种液的制备：在24°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照4天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入10 g/L乙酸，培养条件为24°C、pH为9，黑暗诱导培养3天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。有机溶剂为体积比为2:1的氯仿和甲醇混合溶液。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为10 g/L时，蛋白核小球藻的最高生物量为157.92 mg/L，最终收获油脂含量为37.16%。
实施例4
（1）藻种液的制备：在24°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照6天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入20 g/L乙酸，培养条件为24°C、pH为7，黑暗诱导培养4天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为20 g/L时，微藻的最高生物量为146.34 mg/L，最终收获油脂含量为28.09%。
实施例5
（1）藻种液的制备：在26°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照4天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入30 g/L乙酸，培养条件为26°C、pH为8，黑暗诱导培养4天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为30 g/L时，微藻的最高生物量为145.50 mg/L，最终收获油脂含量为27.87%。
对比例1
（1）藻种液的制备：在25°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，置于人工气候室中，连续光照6天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，培养条件为25°C、pH为9，黑暗诱导培养6天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下未加碳源的BG-11培养基中微藻的最高生物量为19.11 mg/L，最终收获油脂含量为14.02%。
对比例2:
（1）藻种液的制备：在25°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，置于人工气候室中，连续光照6天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入2 g/L乙酸，培养条件为25°C、pH为8，黑暗诱导培养5天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为2 g/L时，微藻的最高生物量为87.10 mg/L，最终收获油脂含量为18.52%。
对比例3:
（1）藻种液的制备：在26°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，置于人工气候室中，连续光照5天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入50 g/L乙酸，培养条件为26°C、pH为7，黑暗诱导培养3天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，黑暗条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为50 g/L时，微藻的最高生物量为98.60 mg/L，最终收获油脂含量为19.87%。
对比例4：
（1）藻种液的制备：在25°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，置于人工气候室中，连续光照4天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，培养条件为25°C、pH为7，光照诱导培养6天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，光照条件下未加碳源的BG-11培养基中微藻的最高生物量为92.50 mg/L，最终收获油脂含量为16.47%。
对比例5:
（1）藻种液的制备：在25°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，置于人工气候室中，连续光照4天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
（2）藻液的培养：吸取制备完成的700 mL藻种液接种于含BG-11培养基的灭菌三角瓶中，并加入6 g/L乙酸，培养条件为25°C、pH为8，光照诱导培养5天后收获，每日定时测定微藻生物量；
（3）待步骤（2）中收获的藻液，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
结果表明，光照条件下当BG-11培养基中添加乙酸的浓度为6 g/L时，微藻的最高生物量为109.93 mg/L，最终收获微藻的油脂含量为20.44%。
结果分析：
表1汇总了不同培养模式下乙酸投加量对蛋白核小球藻生物量和油脂含量的影响，对比例1中未加乙酸的BG-11培养基中培养的小球藻在黑暗条件下培养6天，微藻生长受到抑制，通过图1也证实生物量呈缓慢下降趋势，最终收获生物量仅为19.11 mg/L。根据对比例2、3可以得知过低和多高浓度的乙酸对蛋白核小球藻的生长和脂质积累均有抑制作用。然而在实施例1-5中小球藻有明显生长，说明特定浓度的乙酸作为外加碳源可以促进微藻生长。其中在黑暗诱导下添加10 g/L乙酸的实施例3中，与其他组相比微藻生物量在3天内得到显著提高，即乙酸投加浓度为10 g/L时，生物量浓度高达157.92 mg/L，是对照组的8.26倍。通过表1和图2中不同浓度乙酸对蛋白核小球藻油脂积累情况得知，在添加乙酸浓度范围为4-30 g/L的BG-11培养基中，蛋白核小球藻的油脂含量显著增加。尽管对比例5获得较高的生物量，但是油脂含量较低，因此异养条件下油脂含量优于自养和混养条件，这说明乙酸在黑暗条件下有利于刺激藻细胞内油脂的积累。优选黑暗诱导下乙酸投加范围在4-30g/L中，获得的生物量范围为130-160 mg/L，获得的油脂含量范围为25%-40%。
通过对比表1中小球藻的生物量及油脂含量，这些结果为蛋白核小球藻利用外加碳源乙酸生产油脂提供了有用的培养数据。可以看出，乙酸作为一种廉价碳源，在异养条件下可以作为生物转化成微生物油的外加碳源，也符合降低培养成本和提高产量的目的。异养条件下乙酸投加范围为4-30 g/L之间，获得最高的生物量浓度和油脂含量。由此可见，利用乙酸刺激微藻异养产油的方法，可以同时满足微藻制备生物柴油对高生物量和高油脂含量的需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
表1 不同培养模式下乙酸投加量对蛋白核小球藻生物量和油脂含量的影响
Figure 897442DEST_PATH_IMAGE002
注：括号中数字代表到达该生物量的天数。

Claims (5)

1.一种利用乙酸刺激微藻异养产油的方法，其特征在于，采用以下步骤：
藻种液的制备：在24-26°C下，将BG-11培养基和藻液等量的加入反应器中，连续光照4-6天并通气培养，离心浓缩后作为种子液；
藻液的培养：吸取步骤（1）制备的藻种液接种于BG-11培养基，同时分别向培养基中加入乙酸溶液，培养条件为24-26°C，调节pH为7-9，黑暗诱导培养条件下培养3-6天；
待步骤（2）中藻液培养完成后收获，利用有机溶剂提取藻细胞中的油脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的微藻为蛋白核小球藻Chlorella Pyrenoidosa（FACHB-1216）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述黑暗诱导培养下每升藻种液中乙酸加入量为4-30 g。
4.根据权利1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述，微藻油脂提取的有机溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，所述混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为2:1。
5.根据权利1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述的稳定期微藻生物量范围为130-160 mg/L，油脂含量范围为25%-40%。
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