CN108205042B - 一种安化黑茶识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种安化黑茶识别方法,包括以下步骤:(1)以安化黑茶及其他产地的黑茶为样品,分别用80℃以上的热水提取各种样品,并得到提取液,用液相色谱‑离子阱飞行时间串联质谱仪对每种提取液进行成分分析,并对各成分进行定量分析,得到各种样品中的成分及其含量;(2)利用随机森林分析法分析步骤(1)各种样品中的成分及其含量,建立不同产地黑茶的随机森林法判别模型,得到不同产地黑茶样品的多维尺度变换图,利用多维尺度变换图进行黑茶的识别。该方法利用了液相色谱‑离子阱飞行时间串联质谱技术和随机森林分析法,实现了90%以上的正确识别率。
Description
技术领域
本发明涉及一种安化黑茶识别方法,属茶叶的分析检测技术领域。
背景技术
安化黑茶作为非物质文化遗产,还被评为国家地理标志产品,近年来成为国内外茶叶市场的新贵,深受广大消费者青睐。建立安化黑茶原产地鉴别方法,科学客观地评价安化黑茶的品质状况,将为安化黑茶的生产加工、质量控制和功能研究提供技术及理论依据,促进安化黑茶的原产地保护和产业持续健康发展。由于茶叶种植的产地、气候、环境等因素的不同造成它们的常规化学成分和特殊化学成分的种类和含量存在差异,可通过测定不同产地茶叶的化学成分种类及含量的差异对其产地进行判别分析。但是茶叶中有些成分具有相似的结构,对化合物鉴别分析提出了更高的要求,因而采用定性能力强的高分辨率质谱仪对这些复杂的混合物进行鉴别十分必要。目前有关茶叶中提取物的代谢组学研究,大部分采用低分辨的离子阱或四级杆质谱,存在着代谢物信息缺失或不全的可能性。
发明内容
本发明的目的是提供基于一种高分辨质谱技术的安化黑茶识别方法,通过液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱检测技术获得相关水溶性成份色谱峰面积的相对百分含量数值,经过化学计量学软件自动处理,可实现对安化黑茶与其它产地黑茶的快速、有效识别。
本发明的技术方案是,提供一种安化黑茶识别方法,包括以下步骤:
(1)以安化黑茶及其他产地的黑茶为样品,分别用80℃以上的热水提取各种样品,并得到提取液,用液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱仪对每种提取液进行成分分析,并对各成分进行定量分析,得到各种样品中的成分及其含量;
(2)利用随机森林分析法分析步骤(1)各种样品中的成分及其含量,建立不同产地黑茶的随机森林法判别模型,得到不同产地黑茶样品的多维尺度变换图,利用多维尺度变换图进行黑茶的识别。
本发明利用高分辨质谱技术的收集一系列黑茶的,特别是安化黑茶的成分及其含量的数据,将这些数据进行一些常规的处理后,建立判别模型,判别模型是依据产地不同将各种黑茶(主要是安化黑茶)进行区域化的分类,可以根据待测样品的成分及含量在该判别模型中的位置(是否落入了安化黑茶的区域)进行可视化的识别。
进一步地,步骤(1)中,用85-95℃的热水恒温浸泡样品15-25min,得到提取液。
进一步地,步骤(1)中,流动相A为乙腈,流动相B为4-6mM乙酸铵的水溶液,所述乙酸铵的水溶液中还添加体积分数为0.1%的甲酸。
进一步地,步骤(1)中,实验条件如下:
质谱离子源:电喷雾离子源;负离子扫描,扫描范围:m/z 100~1000;加热模块温度200℃;CDL温度200℃;雾化气流速1.5L/min;干燥气流速10L/min;离子源电压:检测器电压1.7kV;质量数校准方法:自动调谐优化电压,外标法校准质量数。
进一步地,步骤(2)中,利用安化黑茶中含量最多的20种以上的成分及其含量,作为建立随机森林法判别模型中安化黑茶的数据。
进一步地,步骤(2)中,利用安化黑茶中茶氨酸、木糖、没食子酸、没食子儿茶素、4-没食子酸奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香苷、牡荆苷这7种成分及其含量,作为建立随机森林法判别模型中安化黑茶的数据。
离子阱飞行时间串联质谱(IT-TOF MS),其质量准确度可达ppm级,采用全扫描模式,检测化合物数量不受限制,根据母离子精确质量数及多级碎片离子,可推测其可能的元素组成及分子式,在化合物快速鉴定中得到越来越广泛的应用。随机森林分析(randomforestanalysis,RF)是一种强有力的化学计量学方法,它由很多决策树分类模型组合而成,其参数集是独立同分布的随机向量,在给定自变量下,每个决策树分类模型都由一票投票权来选择最优的分类结果。随机森林法可用于复杂多变量数据的降维、排除噪音和冗余等数据处理,继而找到各样品类别之间最主要的影响因素,已用于复杂样品体系的分析检测中。本专利提出利用液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱对安化黑茶中水溶性成分进行定性定量分析,结合随机森林计量学方法对安化黑茶和其他产地黑茶进行了产地识别研究。
(1)黑茶中水溶性成份萃取茶样粉碎后过40目筛,称取1.0g茶样置于50mL具塞试管中,加入90℃热水25mL,并在90℃恒温水浴中浸泡提取20min,期间每隔10min振摇1次。提取后,冷却至室温,定容至50mL,取上层清1mL,10000r/min离心10min,过0.22μm滤膜,作为试样液供液相色谱-离子阱串联飞行时间质谱测定。
(2)所述运用液相色谱-离子阱串联飞行时间质谱(LC-IT-TOF MS)仪对茶叶的水溶性组成进行测定,结合精确质量数、多级质谱图及质谱数据库等对其中的26种化合物数据进行数据处理和定性鉴定分析。
仪器条件色谱柱:phenomenon C18柱(3.5μm,4.6mm×150mm);流动相A为乙腈,流动相B为5mM乙酸铵(0.1%甲酸)水溶液;梯度洗脱条件:0~4min,10%A~20%A;4~14min,20%A~100%A;14~17min,100%A,17.1~22min,100%A~10%A。流速为0.3mL/min,进样量10uL,柱温为40℃;检测波长:254nm。质谱离子源:电喷雾离子源(ESI),负离子扫描;扫描范围:m/z 100~1000;加热模块温度200℃;CDL温度200℃;雾化气流速1.5L/min;干燥气流速10L/min;离子源电压:检测器电压1.7kV;质量数校准方法:自动调谐优化电压,外标法校准质量数。
数据处理分析:利用Profiling Solution软件对所有样品数据进行处理,数据处理参数设定为:保留时间范围为1~20min,质量范围为100~1000m/z,质量允许偏差为5mDa,强度阈值为50000,保留时间允许误差0.5min,数据处理结果进行峰值提取,峰对齐及峰面积归一化处理,列出每个峰的m/z值、保留时间和信号强度来创建峰列表得到高分辨质谱数据,然后把数据输出到Matlab软件,作为多变量分析数据,运用随机森林法对数据进行数据处理。
定性鉴定分析:通过Met ID solution定性分析软件中特征提取技术将样品中大于一定丰度的化合物提取出来,在自建的数据库中搜索精确分子质量数、同位素比相匹配的化合物,进行快速筛查,并根据多级质谱碎片离子进行确证。同时部分化合物结合人工图谱分析,按各色谱峰的质谱裂片图,查对质谱资料,对基峰、质荷比和相对峰度等方面进行直观比较,并参照已发表的相关文献进行确证。
本发明运用随机森林法对进行变量重要性评分,以变量重要性得分大于0.25为标准,找到对安化黑茶产地识别有着较大贡献度的7个重要特征化合物:茶氨酸、木糖、没食子酸、没食子儿茶素、4-没食子酸奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香苷、牡荆苷等对不同黑茶区分有较大的贡献度,可作为安化黑茶的重要特征指标,仅利用这些指标建立的安化黑茶的随机森林法判别模型可以实现90%的正确识别率;而选取含量最多的前20种的特征化合物可以达到95%以上的正确识别率。
本发明的有益效果是:
(1)本发明基于高分辨质谱-离子阱飞行时间串联质谱(IT-TOF MS)检测技术,该检测技术其质量准确度可达ppm级,采用全扫描模式,检测化合物数量不受限制,根据精确分子质量数及多级碎片离子,可快速鉴定成份组成及分子式。
(2)随机森林法分析:由很多决策树分类模型组合而成,其参数集是独立同分布的随机向量,在给定自变量下,每个决策树分类模型都由一票投票权来选择最优的分类结果。离子阱飞行时间串联质谱(IT-TOF MS)在负离子模式下测定得的不同产地黑茶中26个共有特征峰的峰面积作为变量,运用随机森林法对这些类别样本进行变量重要性评分,找到了对安化黑茶产地识别有着较大贡献度的87个重要特征化合物(Feature importance),可作为安化黑茶的重要特征指标。
(3)建立安化黑茶、其它产地黑茶的随机森林法判别模型:得到了不同产地黑茶样品的多维尺度变换图(multi-dimensional scaling,MDS),各样品在多维尺度变换图上有良好的分离效果,可明显的区分安化黑茶和其他产地黑茶。选取78个样品作为校正集建立安化黑茶、其它产地黑茶的随机森林法识别模型,对18个未知样品预测,正确识别率为97.5%,能够有效鉴别安化黑茶。
附图说明
图1是RF所得变量重要性得分图。
图2是安化黑茶与其它产地黑茶的MDS分布图;图2中PC1、PC2和PC3分别表示主成分1、主成分2和主成分3,其坐标的含义是各预测样品在3个主成分的得分值。
图3是不同产地黑茶预测识别的MDS分布图;图3中PC1、PC2和PC3分别表示主成分1、主成分2和主成分3,其坐标的含义是各个预测样品在3个主成分的得分值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。下面实施例用于对本发明的进一步说明,但不用来限制本发明的范围。
实施例
采用热水恒温萃取对茶叶中水溶性成份进行萃取,经发明人大量实验后,优化条件和参数如下:
萃取条件:茶样粉碎后过40目筛,称取1.0g茶样置于50mL具塞试管中,加入90℃热水25mL,并在90℃恒温水浴中浸泡提取20min,期间每隔10min振摇1次。提取后,冷却至室温,定容至50mL,取上层清1mL,10 000r/min离心10min,过0.22μm滤膜,作为试样液供液相色谱-离子阱串联飞行时间质谱测定。
(本发明考察了水-甲醇、0.1%乙酸-甲醇,0.1%甲酸-乙腈、5mmol/L乙酸胺-乙腈和0.1%乙酸-乙腈等一系列体系对色谱峰形以及质谱强度的影响,优选出5mmol/L左右的乙酸胺水溶液-乙腈作流动相)。本发明通过比较发现采用5mmol/L乙酸胺水溶液-乙腈作流动相时,发现部分色谱峰峰型不理想,拖尾严重,分离效果较差。往流动相中添加适量的乙酸或甲酸将有助于分析化合物的分离,色谱峰型有所改善。所以,选择5mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)-乙腈为流动相。)黑茶大部分水溶性化合物在正负离子模式均能电离,且但负离子模式响应大于正离子模式,所以测试在负离子采集模式下进行。此外,对质谱同时优化质谱的离子源温度、干燥气流和检测器电压等条件进行优化,使大部分目标化合物都有良好的信号响应,保证测试所需的灵敏度、精密度和准确度。
仪器条件:色谱柱:phenomenon C18柱(3.5μm,4.6mm×150mm);流动相A为乙腈,流动相B为5mM乙酸铵(0.1%甲酸)水溶液;梯度洗脱条件:0~4min,10%A~20%A;4~14min,20%A~100%A;14~17min,100%A,17.1~22min,100%A~10%A。流速为0.3mL/min,进样量10uL,柱温为40℃;检测波长:254nm。质谱离子源:电喷雾离子源(ESI),负离子扫描;扫描范围:m/z 100~1000;加热模块温度200℃;CDL温度200℃;雾化气流速1.5L/min;干燥气流速10L/min;离子源电压:检测器电压1.7kV;质量数校准方法:自动调谐优化电压,外标法校准质量数。
数据处理分析:利用Profiling Solution软件对所有样品数据进行处理,数据处理参数设定为:保留时间范围为1~20min,质量范围为100~1000m/z,质量允许偏差为5mDa,强度阈值为50000,保留时间允许误差0.5min,数据处理结果进行峰值提取,峰对齐及峰面积归一化处理,列出每个峰的m/z值、保留时间和信号强度来创建峰列表得到高分辨质谱数据,然后把数据输出到Matlab软件,作为多变量分析数据,运用随机森林法对数据进行数据处理。
定性鉴定分析:通过Met ID solution定性分析软件中特征提取技术将样品中大于一定丰度的化合物提取出来,在自建的数据库中搜索精确分子质量数、同位素比相匹配的化合物,进行快速筛查,并根据多级质谱碎片离子进行确证。同时部分化合物结合人工图谱分析,按各色谱峰的质谱裂片图,查对质谱资料,对基峰、质荷比和相对峰度等方面进行直观比较,并参照已发表的相关文献进行确证。
采用液相色谱-离子阱串联飞行时间质谱仪在负离子模式下测定得的不同产地黑茶中主要的水溶性成分,以26个共有特征峰的峰面积作为变量,进行随机森林法分析,包括:根据实际采样的已知茶叶类别,将样本分为安化黑茶、其它产地黑茶两类,以各茶样中的主要水溶性成分为变量,运用随机森林法对这些类别样本进行变量重要性评分,以变量重要性得分大于0.25为标准,找到对安化黑茶产地识别有着较大贡献度的7个重要特征化合物(Feature importance):茶氨酸、木糖、没食子酸、没食子儿茶素、4-没食子酸奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香苷、牡荆苷,对不同黑茶区分有着较大的贡献度,可作为安化黑茶的重要特征指标,结果见图1和表1。
表1安化黑茶样品中26种主要化合物的保留时间及质谱特征
通过Matalab软件进行随机森林分析,建立安化黑茶、其它产地黑茶的随机森林法判别模型,得到了不同产地黑茶样品的多维尺度变换图(multi-dimensional scaling,MDS),可视化地表明样本之间的相似度和差异情况,从图2可见安化黑茶和其他产地黑茶有着明显的区分。
随机森林是由很多决策树分类模型组成的组合分类模型,且参数集是独立同分布的随机向量,在给定自变量X下,每个决策树分类模型都由一票投票权来选择最优的分类结果。(1)建立已知类别信息的独立训练集:根据采集的茶叶样品的类别信息,以78个样品作为训集样本;(2)进行变量选择得到合适的样本分类变量:根据设定参数进行数据的峰值提取,峰对齐及峰面积归一化等处理,列出每个峰的m/z值、保留时间和信号强度来创建峰列表得到高分辨质谱数据,然后把数据输出到Matlab软件,作为多变量分析数据;(3)构建分类回归树和所有树分类器:对分类变量和高分辨质谱数据数据进行随机森林法分析进行模型训练和分类,根据训练集分类所得的模型进行袋外数据(out-of-bag,OOB)错分率的大小评估,构建分类回归树和所有树分类器运用模式识别算法进行模型训练和分类;(3)未知样本进行分类:根据训练分类所得的模型根据袋外数据(out-of-bag,OOB)错分率的大小,输出的类别标签由所构建的所有树分类器预测结果进行投票表决,再通过多维尺度变换图(multi-dimensional scaling,MDS)将安化黑茶与其它产地黑茶进行的分类情况进行直观可视化表现出来区分,根据未知样品在多维尺度变换图的分布情况进行类别判定,如果样品落在安化黑茶品种所在分布区域则判为安化黑茶,如果落入非安化黑茶品种区域则判为非安化黑茶。见图2;选取78个样品作为校正训练集建立安化黑茶、其它产地黑茶的随机森林法识别模型,对18个未知样品预测,正确识别率为97.5%,能够有效鉴别安化黑茶,见图3。其中图2和图3中的主成分是指主成分分析法中的术语。
Claims (2)
1.一种安化黑茶识别方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以安化黑茶及其他产地的黑茶为样品,分别用80℃以上的热水提取各种样品,并得到提取液,用液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱仪对每种提取液进行成分分析,并对各成分进行定量分析,得到各种样品中的成分及其含量;
(2)利用随机森林分析法分析步骤(1)各种样品中的成分及其含量,建立不同产地黑茶的随机森林法判别模型,得到不同产地黑茶样品的多维尺度变换图,利用多维尺度变换图进行黑茶的识别;
步骤(1)中,流动相A为乙腈,流动相B为4-6mM乙酸铵的水溶液,所述乙酸铵的水溶液中还添加体积分数为0.1%的甲酸;
色谱柱:phenomenon C18柱,3.5μm, 4.6 mm×150 mm;梯度洗脱条件:0~4min,10%A~20%A;4~14 min,20% A~100% A;14~17min,100% A,17.1~22min,100%A~10%A;
步骤(1)中,实验条件如下:
质谱离子源:电喷雾离子源;负离子扫描,扫描范围:m/z 100~1000;加热模块温度200℃;CDL温度200℃;雾化气流速1.5 L /min;干燥气流速10 L /min;离子源电压:检测器电压1.7 kV;质量数校准方法:自动调谐优化电压,外标法校准质量数;
步骤(2)中,利用安化黑茶中茶氨酸、木糖、没食子酸、没食子儿茶素、4-没食子酸奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香苷、牡荆苷这7种成分及其含量,作为建立随机森林法判别模型中安化黑茶的数据。
2.如权利要求1所述的识别方法,其特征在于,步骤(1)中,用85-95℃的热水恒温浸泡样品15-25 min,得到提取液。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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