CN110687215A - 一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法 - Google Patents

一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法。该方法包括如下步骤：1)根据已知不同年份的茶叶的水提取物中化合物离子的LC‑MS数据，通过偏最小二乘法(PLS)建立茶叶年份判别模型；2)基于待测茶叶的水提取物中化合物离子的LC‑MS数据，通过所述茶叶年份判别模型预测所述待测茶叶的年份。本发明使用茶叶的水提取物和LC‑MS对于代谢组学样本检测具有高分辨、高通量和高检测灵敏度的特点，使用PLS方法建立的茶叶年份判别模型预测的准确率高，能实现茶叶年份的准确预测。

Description

一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，更具体地，涉及一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法。
背景技术
普洱茶产于云南，有一千多年的历史，以其独特的品质特征受到人们的喜爱，以其越陈越香的属性受到市场的追捧，被誉为“可以喝的古董”，以其营养价值和保健功能畅销海内外，被称为“健康的茶饮料”。冰岛古树生茶是一种上等普洱茶，产于云南省临沧市双江县，具有很高的市场价值。生茶在制作过程中采用晒干的方式干燥，茶叶中还保留有10％的水分，会在存储过程中在微生物的作用下缓慢发酵。茶叶的化学成分随着存储时间的增长表现出不同的品质特点，对应的市场价格也各不相同。品质好的普洱生茶每年能以10％-15％的增长率升值。目前普洱茶市场存在新茶充当陈茶的现象，极大损害了茶叶生产商和消费者的利益，有经验的品茶人可以通过茶的外观和滋味来判断茶叶的年份，但是人工判断误差大。
现有技术中公开了一种基于味觉信息快速鉴定不同储藏年份普洱茶的方法，该方法是通过在室温下利用传感器型电子舌，检测不同储藏年份的普洱茶的味觉信息，实现对普洱茶储藏年份的识别。该鉴定方法的样品前处理简单，整个实验过程无有机溶剂，安全性高，检测速度快，鉴别准确率高，且仪器可以连续作业，更适合连续、实时检测，便于大规模推广应用。然而利用味觉信息判断误差较大，且普洱生茶的陈化是一个缓慢的过程，因此需要一种客观全面的方法判断普洱生茶的年份。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法。该方法包括如下步骤：
1)根据已知不同年份的茶叶的水提取物中化合物离子的LC-MS数据，通过偏最小二乘法(PLS)建立茶叶年份判别模型；
2)基于待测茶叶的水提取物中化合物离子的LC-MS数据，通过所述茶叶年份判别模型预测所述待测茶叶的年份。
其中，LC-MS数据优选为峰面积。即LC-MS谱图每个化合物离子的峰面积。
在本发明一个优选实施方式中，使用可以饮用的第二泡茶汤来作为茶叶的水提取物。进一步优选地是，水提取物的提取方法具体为：
向1重量份的茶叶中加入50～60重量份的沸水，静置1～2min，弃去茶水，再向其中加入50～60重量份的沸水，静置1～2min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后即得。
其中，茶叶为干茶叶，通常是将生茶采集之后统一贮藏于恒温恒湿的条件中。
本发明提供的方法更适用于普洱生茶，尤其适用于冰岛古树生茶。
在本发明一个优选实施方式中，水提取物中化合物离子的LC-MS数据通过液质联用分析来得到。当其优选为峰面积时，即水提取物中化合物离子的LC-MS峰面积通过液质联用分析来得到。
其中，LC-MS数据需要通过液质联用来分析样本获得，液质联用分析样本时的参数优选为：
质谱在正离子模式下采集数据，参数设置如下：一级扫描分辨率为70,000，质量扫描范围为70～1,000m/z,采集速率为3spectra/s；二级扫描分辨率为35,000，碰撞能为35V，质量隔离窗口为0.6m/z。
在本发明一个优选实施方式中，LC-MS数据的获取时的参数优选为：
使用C18色谱柱，进样体积为5μL，流速为0.3mL/min，流动相A为含有甲酸的超纯水，流动相B为含有甲酸的乙腈；质谱在正离子模式下采集数据，参数设置如下：喷雾电压：3.5KV,毛细管温度：320℃,雾化气流速：30L/min,辅助气流速：10L/min,反吹气流速：5L/min,雾化气温度：350℃；一级扫描分辨率为70,000,质量扫描范围为70～1,000m/z,采集速率为3spectra/s；二级扫描分辨率为35,000,碰撞能为35V,质量隔离窗口为0.6m/z。
其中，色谱柱进一步优选为
Figure BDA0001719738630000031
C18 1.7μm,2.1×100mm色谱柱。流动相A和流动相B中甲酸的体积浓度为0.1％。
在本发明一个优选实施方式中，步骤1)具体为：
将已知不同年份的茶叶的水提取物的LC-MS数据先进行保留时间对齐、特征质谱峰提取、显著性分析及峰强度归一化后，再通过偏最小二乘法建立茶叶年份判别模型。
在本发明一个优选实施方式中，所述已知不同年份的茶叶优选包括2006～2015年份的茶叶，每个年份的茶叶选择4～6个样品。
在本发明一个优选实施方式中，所述“通过偏最小二乘法建立茶叶年份判别模型”具体为：
选取显著性p值小于0.05的化合物离子，随机选取每个年份的多个重复样本的所述化合物离子的峰面积作为训练集，建立训练集的分类变量，通过偏最小二乘法建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型，即所述分类变量与LC-MS数据的茶叶年份判别模型。
其中，通过显著性分析选取p小于0.05的化合物离子，随机选取每个年份的多个重复样本的所述化合物离子的峰面积数据。
其中，重复样本优选为4个。
在本发明一个优选实施方式中，采用SIMCA-P软件，选取峰面积满足p<0.05的化合物离子，随机抽取每个年份茶叶的4个重复作为训练集，进行PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型，即所述分类变量与LC-MS数据的茶叶年份判别模型。
在本发明中，模型检测是选取训练集建立模型的交叉验证和未参与建模的样本数据作为检测集未知样本，计算分类变量预测值，分别分析年份识别的准确率。
在本发明一个优选实施方式中，在所述茶叶年份判别模型中将不同年份的茶叶分别赋予不同的预设值，使用茶叶年份判别模型对未知年份的茶叶进行预测，当预测值为在预设值的±50％内，即可认为未知年份的茶叶属于该预设值所对应的年份。
在本发明一个优选实施方式中，步骤1)中所述茶叶年份判别模型中1代表2006～2008年的茶叶，2代表2009～2013年的茶叶，3代表2014～2015年的茶叶，则步骤2)中预测值大于等于0.5且小于1.5时即可认为所述待测茶叶为2006～2008年的茶叶，预测值为大于等于1.5且小于2.5时即可认为所述待测茶叶为2008～2013年的茶叶，预测值为大于等于2.5且小于3.5时即可认为所述待测茶叶为2014～2015年的茶叶。
在本发明中，可以随机选取2/3样本的代谢组数据作为训练集，建立训练集的分类变量，1代表2006-2008年的茶叶，2代表2009-2013年的茶叶，3代表2014-2015年的茶叶；建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型，即所述分类变量与LC-MS数据的茶叶年份判别模型。该模型验证采用交叉验证；其余1/3的样本作为预测集，用于预测判别模型的准确性。预测值大于等于0.5且小于1.5即可认为是2006-2008年的茶叶，预测值大于等于1.5且小于2.5即可认为是2008-2013年的茶叶，预测值大于等于2.5且小于3.5即可认为是2014-2015年的茶叶。
本发明利用超高效液相色谱与高分辨质谱联用可以快速检测茶叶中的代谢物，基于液质联用的代谢组学技术可以在组学水平上收集茶叶尤其是普洱生茶的化合物信息，使用PLS法建立茶叶年份判别模型，并进一步结合多维统计分析方法，准确实现对茶叶的年份预测，准确率高达100％。本发明模拟了茶叶饮用方法，选用沸水浸泡茶叶，选择第二泡茶汤进行液质联用检测和代谢组学分析，操作简单，没有使用有机溶剂对茶叶进行浸提，安全性高。
附图说明
图1为实施例1中不同年份普洱生茶的PLS得分图；
图2为实施例1中普洱生茶的茶叶年份判别模型。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明提供了一种应用代谢组学技术预测冰岛古树生茶年份的方法，该方法包括如下步骤：
一、冰岛古树生茶样本代谢组的提取
收取产自2006年-2015年的冰岛古树生茶样本，称取2g干茶叶于锥形瓶中，加入100mL沸水，静置浸泡1min。弃去茶水(醒茶)。再加入100mL的沸水，静置提取1min。取上清液，经快速分析型定量滤纸过滤后冷却至室温，在经0.22μm滤膜过滤后转移至进样小瓶中进行液质联用分析。每个茶叶样本做6个技术重复。
二、LC-MS检测
选用C18 1.7μm,2.1×100mm色谱柱,进样体积为5μL,流速为0.3mL/min。流动相A为超纯水(含有0.1％甲酸)。流动相B为乙腈(含有0.1％甲酸),梯度洗脱。质谱在正离子模式下采集数据，参数设置如下：喷雾电压：3.5kv,毛细管温度：320℃,雾化气流速：30L/min,辅助气流速：10L/min,反吹气流速：5L/min,雾化气温度：350℃。一级扫描分辨率为70,000,质量扫描范围为70～1,000m/z,采集速率为3spectra/s。二级扫描分辨率为35,000,碰撞能为35V,扫描窗口为0.6m/z。梯度洗脱的程序为：
Figure BDA0001719738630000052
Figure BDA0001719738630000061
三、茶叶年份判别模型的建立
定性定量数据的提取、判别模型的建立和检测方法：
定性定量数据提取方法为将LC-MS分析得到的原始数据导入Progenesis QI软件进行保留时间对齐、特征质谱峰提取、显著性分析(ANOVA)及峰强度归一化。
判别分析模型的建立和检测方法为：采用SIMCA-P，选取峰面积满足p<0.05的化合物离子，随机抽取每个年份茶叶的4个重复作为训练集，进行PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型。模型检测选取训练集建立模型的交叉验证和未参与建模的样本数据作为检测集未知样本，计算分类变量预测值，分别分析年份识别的准确率。
模型建立的方法为：
随机选每个年份的4个重复作为训练集，建立训练集的分类变量，1代表2006-2008年的茶叶，2代表2009-2013年的茶叶,3代表2014-2015年的茶叶；其余2个重复的样本作为预测集，用于预测判别模型的准确性。预测值大于等于0.5且小于1.5即可认为是2006-2008年的茶叶，预测值大于等于1.5且小于2.5即可认为是2008-2013年的茶叶，预测值大于等于2.5且小于3.5即可认为是2014-2015年的茶叶。
(1)模型的建立与验证
利用PLS法建立训练集的冰岛古树生茶年份识别的PLS模型，即茶叶年份判别模型。如图1所示，模型可以将三组茶叶明显区分开来，PC1＝41.5％，代表了样本之间41.5％的差异，PC2＝13.8，代表了样本之间13.8％的差异，交叉验证的结果表明，校正标准差(RMSEE)＝0.54567，交叉验证标准差(RMSEcv)＝0.79918,表明该模型预测茶叶年份的效果很好，可用于冰岛古树生茶年份的预测。
(2)模型的预测
利用建立好的茶叶年份判别模型对其余2个重复的样本进行预测，如图2所示，横坐标为样本的实际预测值，纵坐标为样本的赋值。预测误差均方根RMSEP为0.167318，2006-2008年样本的预测值均接近1，2009-2013年样本的预测值均接近2，2014-2015年样本的预测值均接近3，预测成功率为100％(如表1，图1),该模型可以预测冰岛古树生茶的生产年份。
表1样本的预测值和理论值
Figure BDA0001719738630000071
Figure BDA0001719738630000081
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种应用代谢组学技术预测茶叶年份的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)根据已知不同年份的茶叶的水提取物中化合物离子的LC-MS数据，通过偏最小二乘法(PLS)建立茶叶年份判别模型；
2)基于待测茶叶的水提取物中化合物离子的LC-MS数据，通过所述茶叶年份判别模型预测所述待测茶叶的年份。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水提取物的提取方法具体为：
向1重量份的茶叶中加入50～60重量份的沸水，静置1～2min，弃去茶水，再向其中加入50～60重量份的沸水，静置1～2min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后即得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述茶叶为普洱生茶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：
将已知不同年份的茶叶的水提取物中化合物离子的LC-MS数据先进行保留时间对齐、特征质谱峰提取、显著性分析及峰强度归一化后，再通过偏最小二乘法建立茶叶年份判别模型。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述已知不同年份的茶叶包括2006～2015年份的茶叶，每个年份的茶叶选择4～6个样品。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述LC-MS数据为峰面积。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述“通过偏最小二乘法建立茶叶年份判别模型”具体为：
选取显著性p值小于0.05的化合物离子，随机选取每个年份的多个重复样本的所述化合物离子的峰面积作为训练集，建立训练集的分类变量，通过偏最小二乘法建立所述分类变量与LC-MS数据的茶叶年份判别模型。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在所述茶叶年份判别模型中将已知不同年份的茶叶分别赋予不同的预设值，使用所述茶叶年份判别模型对所述待测茶叶进行预测，当预测值为在预设值的±50％内，即可认为所述待测茶叶属于所述预设值所对应的年份。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述茶叶年份判别模型中1代表2006～2008年的茶叶，2代表2009～2013年的茶叶，3代表2014～2015年的茶叶，则步骤2)中预测值大于等于0.5且小于1.5时即可认为所述待测茶叶为2006～2008年的茶叶，预测值大于等于1.5且小于2.5时即可认为所述待测茶叶为2008～2013年的茶叶，预测值大于等于2.5且小于3.5时即可认为所述待测茶叶为2014～2015年的茶叶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述LC-MS数据通过液质联用分析获取，液质联用分析的参数为：
质谱在正离子模式下采集数据，参数设置如下：一级扫描分辨率为70,000，质量扫描范围为70～1,000m/z,采集速率为3spectra/s；二级扫描分辨率为35,000，碰撞能为35V，质量隔离窗口为0.6m/z。
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