CN105092750B - 一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及检测代谢组学烟草鲜叶质量的试剂盒。通过检测新鲜烟叶样品提取液中葡萄糖和绿原酸的含量，建立基于二元逻辑回归的判别模型，对烟草样本质量进行判别。对质量未知的烟草样本，通过检测提取液中葡萄糖和绿原酸的含量，根据已建立的二元逻辑回归模型计算其分类概率预测值，再基于确定的临界值，判断所述代谢组学烟草鲜叶样本质量是否合格，为代谢组学合格样本的选择提供依据。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的葡萄糖和绿原酸的含量，且具有检测成本低，重复性好的特点。

Description

一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及烟草化学和分析化学领域。涉及一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及检测代谢组学烟草鲜叶质量的试剂盒。

背景技术

植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究植物体系的一种技术。通过对植物体内小分子化合物代谢的轮廓分析可直接获得植物的生理生态变化。在植物代谢组学研究中，样品的质量决定着分析数据的真实可靠性；而样品的保存条件决定样品质量的好坏。对于不能在取样后立刻进行代谢组学分析的植物样品，通常建议超低温保存；即在-80℃以下的极低温度环境下保存生物样品。在超低温环境下植物样品的代谢过程会大大减缓，以此来保持样品的稳定性。

烟草作为模式生物和重要的经济作物，近几年来针对烟草的代谢组学研究越来越多。但由于烟草样品保存不当而导致的质量发生变化而导致代谢物含量失真的情况时有发生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟草样品质量进行判别。

本发明确定的葡萄糖和绿原酸是烟草中的重要代谢物，具有重要的生物学功能。葡萄糖是一种重要的单糖类物质，可以参与烟草体内物质代谢和能力代谢即为其他生物有机分子提供碳架或释放能量供应植物生长发育及繁殖等所需。绿原酸是一种烟叶中重要的多酚类化合物，具有调节植物自身生长、抗病毒、抗逆等生理功能，在烟草的生长、烟草病毒的防治、烟叶的调制、分级及卷烟香气等方面都起着重要作用。但到目前为止，未曾有人提出将新鲜烟叶中的葡萄糖和绿原酸的含量用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。

发明内容

本发明涉及一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法及检测代谢组学烟草鲜叶质量的试剂盒。该方法和试剂盒可对代谢组学研究中所需的新鲜烟叶样品质量进行判别。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.收集质量合格的新鲜烟草样本25个以上，取样后放入液氮中冷冻(取样时间不超过10min)，在-80℃超低温冰箱中保存至样本分析。收集质量不合格的新鲜烟草样本25个以上，由于取样过程中液氮缺乏或常温暴露等原因导致样本不合格。

2.新鲜烟叶样品提取液的制备：

1)将1-20mg的新鲜烟叶样品浸泡于1-20ml提取溶剂中2分钟以上，取上清液；所述提取溶剂为乙腈：异丙醇：水＝3：3：2v/v/v混合溶液，于提取溶剂中添加有0.00025-0.8mg内标香草酸；

2)上清液冻干后用衍生化试剂处理：

将0.1-2ml上清液的冻干物加入到20-500μl甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中30-60℃反应2分钟以上，甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中甲氧胺盐酸盐浓度为20mg/mL；再加入15-400μlN-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在30-60℃反应2分钟以上。

3.代谢物的检测方法：

气相色谱质谱联用包括安捷伦DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)和气相色谱串联质谱仪；

1)气相色谱检测条件：气相色谱质谱联用的分析在岛津QP2010气质联用系统完成；色谱柱为安捷伦DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氦气作为载气，流量1.2mL/min；进样口温度300℃，分流比10：1；程序升温：初始70℃，保持3分钟，5℃/min升至310℃，保持5分钟，进样量1μL。

2)质谱检测条件：EI电离模式(70eV)，传输线温度280℃，离子源240℃，质量扫描范围33-600m/z，溶剂延迟时间5.6分钟。

4.基于质谱检测数据的判断模型：

1)采用气相色谱质谱联用方法，对代谢组学研究中的合格新鲜烟叶样品和不合格的新鲜烟叶样品进行了代谢组指纹分析，发现并定性17种代谢物对合格样品和不合格样品的区分有重要贡献并且存在显著性差异；

2)使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法(文献1：Bewick V,CheekL,Ball J,Critical care2005,9(1):112-118)，结合代谢物生理功能在17个差异代谢物中随机组合，回归出代谢物组合的概率预测值。用ROC(receiver operatingcharacteristic)曲线来评价组合物的灵敏性和特异性。特异性和灵敏度均较高，同时兼顾简便性(即参与组合的代谢物个数比较少)的代谢物筛选出来用于建立二元逻辑回归判别模型，最后筛选出葡萄糖和绿原酸。在合格的新鲜烟叶样品中绿原酸的浓度增加，而葡萄糖的浓度降低。通过二元逻辑回归分析方法，将葡萄糖和绿原酸的含量回归为分类概率预测值P,构建的二元逻辑回归判别模型如下：

方程1：

P＝1/(1+e^-(K*a-L*b))

其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸的含量，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖的含量；K、L分别代表二元逻辑回归方程计算过程中获得的绿原酸及葡萄糖的浓度系数；

当绿原酸和葡萄糖的含量以相对峰面积(相对内标，内标为香草酸，内标含量为0.25μg/mg烟叶干重)计算时，二元逻辑回归判别模型为方程2：

P＝1/(1+e^{-(2.345*a-0.834*b)})

其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸对内标的相对峰面积比值，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖对内标的相对峰面积比值；

所得分类概率预测值P在不合格样品中降低，该概率预测值可用于判 别代谢组学研究中的新鲜烟叶样品的质量。在此，基于试验涉及的样本，根据诊断灵敏度和特异性最佳的原则，即ROC曲线下面积(AUC)最大的原则，该组合物概率预测值的临界值(cut-off值)设为0.5，低于该临界值则有可能为不合格样品。也可以根据实验样品的实际结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该组合物概率预测值的最佳临界值。

4.采用新鲜烟叶样本测试本发明的应用效果。分别采用2批次的合格样品和不合格代谢组学研究中的新鲜烟叶叶片样本。使用上述组合物对合格样本和不合格样本可以得到很好的区分，灵敏度和特异性及曲线下的面积(AUC)见下表1.

表1

5.确定试剂盒最佳组成：

a.标准品：葡萄糖，绿原酸和香草酸(均购自sigma公司，纯度大于95％)。葡萄糖和绿原酸标准品用于对应的新鲜烟叶代谢物的定性和定量标准曲线绘制和代谢物的定性，香草酸为内标。

b.用于新鲜烟叶样品预处理的提取液：包含香草酸的乙腈：异丙醇：水＝3：3：2v/v/v混合溶液，用于新鲜烟叶样本预处理。香草酸为内标，用于校正绿原酸和葡萄糖；

c.衍生化试剂：衍生化试剂包含：20mg/mL甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶剂；

具体来说，本发明提供下述各项：

一种判别烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量的方法，

1)采用气相色谱质谱联用分析方法，对新鲜烟叶样品提取液中葡萄糖和绿原酸的含量进行分析；然后利用二元逻辑回归建立烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量判别模型；2)在相同的样本预处理和分析条件下，分析质量未知的烟草样本中葡萄糖和绿原酸的含量，将含量带入已建立的二元逻辑回归判别模型得到未知样本的分类概率预测值，该概率预测值可用于判别烟草代谢组学研究中未知新鲜烟叶样本的质量。

A.二元逻辑回归模型的获得：

(1)葡萄糖及绿原酸含量测定：采用气相色谱质谱联用的检测方式，葡萄糖及绿原酸的含量可为绝对或相对含量；绝对含量通过定量标准曲线法测定，利用葡萄糖和绿原酸作为标准品，加入或不加入内标，分别绘制 相对应的新鲜烟叶代谢物葡萄糖和绿原酸的定量标准曲线；标准曲线的横纵坐标分别为采用气相色谱质谱联用时所测的峰面积和物质浓度；浓度为质量浓度、体积浓度、摩尔浓度或质量体积浓度；相对含量为相对于内标的含量，可用相对于内标的浓度或相对于内标的气相色谱质谱峰面积；

(2)气相色谱质谱联用分离并检测来自所述已知25个以上合格和25个以上不合格新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖和绿原酸并记录各自的峰强度；

(3)基于所绘制定量标准曲线和所记录的峰强度计算所述已知25个以上合格和25个以上不合格新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖及绿原酸的绝对含量或相对于内标的相对含量；

(4)将已知25个以上合格和25个以上不合格新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖及绿原酸的浓度进行二元逻辑回归分析得到二元逻辑回归判别模型；

P＝1/(1+e^-(K*a-L*b))

其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸的含量，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖的含量；K、L分别代表二元逻辑回归方程计算过程中获得的绿原酸及葡萄糖的浓度系数；

B.采用相同的预处理方法和分析方法，将质量未知的新鲜烟叶样品提取液进行气相色谱质谱联用的检测，通过测定新鲜烟叶样品提取液中葡萄糖和绿原酸的含量，代入二元逻辑回归判别模型中，获得分类概率预测值P。

二元逻辑回归方程为：

P＝1/(1+e^{-(2.345*a-0.834*b)})

其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸的相对含量，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖的相对含量；

P为分类概率预测值，其在不合格样品中降低，该概率预测值可用于判别代谢组学研究中的新鲜烟叶样品的质量；当P大于等于0.5时为合格样品，小于0.5时为不合格样品；

所述绿原酸的相对含量是指：采用气相色谱质谱联用时测定的绿原酸的相对内标的质谱峰面积；

所述葡萄糖的相对含量是指：采用气相色谱质谱联用时测定的葡萄糖的相对内标的质谱峰面积；

气相色谱质谱联用时测定相对浓度或相对质谱峰面积时采用的内标为香草酸，内标含量为0.25μg/mg烟叶干重。

新鲜烟叶样品提取液的制备：

1)将1-20mg的新鲜烟叶样品浸泡于1-20ml提取溶剂中2分钟以上，取上清液；所述提取溶剂为乙腈：异丙醇：水＝3：3：2v/v/v混合溶液，于提取溶剂中添加有0.00025-0.8mg内标香草酸；

2)上清液冻干后用衍生化试剂处理：

将0.1-2ml上清液的冻干物加入到20-500μl甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中 30-60℃反应2分钟以上，甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中甲氧胺盐酸盐浓度为20mg/mL；再加入15-400μlN-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在30-60℃反应2分钟以上。

气相色谱质谱联用包括安捷伦DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)和气相色谱串联质谱仪；

气相色谱检测条件：气相色谱质谱联用的分析在岛津QP2010气质联用系统完成；色谱柱为安捷伦DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氦气作为载气，流量1.2mL/min；进样口温度300℃，分流比10：1；程序升温：初始70℃，保持3分钟，5℃/min升至310℃，保持5分钟；进样量1μL；

质谱检测条件：EI电离模式(70eV)，传输线温度280℃，离子源240℃，质量扫描范围33-600m/z，溶剂延迟时间5.6分钟。

所述试剂盒包括：

(1)标准品：包括葡萄糖、绿原酸和内标香草酸(纯度大于95％)，所述标准品分别用于绘制对应于新鲜烟叶代谢物检测条件下的、葡萄糖和绿原酸的定量标准曲线；

(2)用于预处理新鲜烟叶样品的提取液：包含内标香草酸的乙腈：异丙醇：水＝3：3：2v/v/v混合溶液；

(3)用于衍生代谢物的衍生化试剂：包含甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液(20mg/mL)和N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液。

本发明具有的效果是：新鲜烟叶样品中小分子代谢物葡萄糖和绿原酸可以联合用于代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量的判别。通过本发明涉及的上述两种小分子代谢物的检测试剂盒，可以实现高灵敏、高效检测，且具有检测成本低，重复性好的特点。上述几种小分子代谢物的联合使用可用于判别代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量是否合格。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示葡萄糖和绿原酸组合物对发现集中合格样品和不合格样品的判别概率(A)。组合物在预测集中合格和不合格新鲜烟叶样品中的判别概率(B)。(C)组合物用于发现集合格新鲜烟叶和不合格新鲜烟叶样品中的ROC曲线，AUC＝1。(D)组合物用于验证集合格新鲜烟叶和不合格新鲜烟叶样品中的ROC曲线，AUC＝1。

具体实施方式

下面通过实例进一步阐释本发明，实例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。

实施例1

采用气相色谱-单四级杆串联质谱(GC-Q-MS)方法测定中部叶成熟期烟草鲜叶样本中的初级代谢产物的含量，建模组的待测样本包括福建、贵 州、湖南等7个省份、7个品种、21个产地，中部叶成熟期123份烟草鲜叶样本。其中中部叶成熟时期的福建龙岩云烟87，贵州毕节云烟97，湖南张家界的K326，河南许昌中烟100及贵州黔南的毕纳1号共29份样本因液氮不足等原因已完全褐化，不适合用于烟叶代谢组学的分析，其他样本保存完好。验证集包括来自中国3个省份，3个种植地，5个不同生育期，3个品种共222份烟草鲜叶样本，表2列出了本实施例中实验样品的信息。

表2实验样品的信息

样本分析步骤如下所述：

1.烟草鲜叶样本采集：

烟草鲜叶样本在不同产地大田种植，到达一定生育期后采样，-196℃液氮保存，运输，液氮条件下研磨，低温冻干，-80℃冰箱储存。

2.分析方法：

2.1烟草新鲜烟叶预处理

烟草鲜叶样本从-80℃冰箱中取出，4℃冰箱过夜放置后，室温下放置1小时。准确称取10mg烟草鲜叶样本，加入1.5mL乙腈/异丙醇/水(含内标香草酸1mg/L，25μL，折合为0.25μg/mg烟叶干重),涡旋振荡提取4分钟后，14000rpm离心10分钟，取0.5mL上清，低温减压干燥。衍生采用肟化反应和硅烷化反应两步法，第一步加入100μL甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液(20mg/mL),37℃水浴衍生90分钟；第二步加入80mL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺进行硅烷化反应，反应时间60分钟。取上清1μL用于进样。

2.2气相色谱串联单四级杆质谱分析

(1)气相条件：气相色谱质谱联用的分析在岛津QP2010气质联用系 统完成；色谱柱为安捷伦DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氦气作为载气，流量1.2mL/min；进样口温度300℃，分流比10：1；程序升温：初始70℃，保持3分钟，5℃/min升至310℃，保持5分钟。进样量1μL。

(2)质谱条件：EI电离模式(70eV)，传输线温度280℃，离子源240℃，质量扫描范围33-600m/z，溶剂延迟时间5.6分钟。

2.3新鲜烟叶测试结果及判别方法

定量分析葡萄糖和绿原酸。运用二元逻辑回归(即，方程1(见“发明内容”部分)，参见文献1：Bewick V,Cheek L,Ball J,Critical care2005,9(1):112-118)，组合物对合格新鲜烟叶和不合格的新鲜烟叶的判别概率如图1A所示。当组合物使用0.5的临界值时，使用结果如下表3。组合物用于区分合格样品和不合格的样品，具有较高的灵敏度和特异性。同时判别率高于单个代谢物葡萄糖或者绿原酸。

表3

2.4验证结果

葡萄糖和绿原酸的含量在验证集样品中的不合格新鲜烟叶样品组和合格对照组中有明显不同。使用二元逻辑回归方程，当组合物使用0.5的临界值时，使用结果如下表4。

表4

验证集结果与建模集的结果基本吻合。葡萄糖及绿原酸作为组合物用于判别代谢组学烟草鲜叶样本质量，其灵敏度和特异性均较高，具有较好的应用前景。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (6)

1.一种用于判别烟草代谢组学研究的新鲜烟叶样品质量的方法，其特征在于：

1)采用气相色谱质谱联用分析方法，对新鲜烟叶样品提取液中葡萄糖和绿原酸的含量进行分析；然后利用二元逻辑回归建立烟草代谢组学新鲜烟叶样品质量判别模型；

2)在相同的样本预处理和分析条件下，分析质量未知的烟草样本中葡萄糖和绿原酸的含量，将含量带入已建立的二元逻辑回归判别模型得到未知样本的分类概率预测值，该概率预测值用于判别烟草代谢组学研究中未知新鲜烟叶样本的质量。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

A.二元逻辑回归模型的获得：(1)葡萄糖及绿原酸含量测定：采用气相色谱质谱联用的检测方式，葡萄糖及绿原酸的含量为绝对或相对含量；绝对含量通过定量标准曲线法测定，利用葡萄糖和绿原酸作为标准品，加入或不加入内标，分别绘制相对应的新鲜烟叶代谢物葡萄糖和绿原酸的定量标准曲线；当不加入内标时，标准曲线的横纵坐标分别为采用气相色谱质谱联用时所测的峰面积和物质浓度；当加入内标时，标准曲线的横坐标为采用气相色谱质谱联用时所测的峰面积与内标的比值，纵坐标为物质浓度；浓度为质量浓度、体积浓度、摩尔浓度或质量体积浓度；相对含量为相对于内标的含量，采用相对于内标的浓度或相对于内标的气相色谱质谱峰面积；

(2)气相色谱质谱联用分离并检测已知25个以上合格和25个以上不合格新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖和绿原酸并记录各自的峰强度；

(3)基于所绘制定量标准曲线和所记录的峰强度计算所述已知25个以上合格和25个以上不合格新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖及绿原酸的绝对含量，或相对于内标的相对含量；

(4)将已知25个以上合格和25个以上不合格新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖及绿原酸的浓度进行二元逻辑回归分析得到二元逻辑回归判别模型；

P＝1/(1+e^-(K*a-L*b))

其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸的含量，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖的含量；K、L分别代表二元逻辑回归方程计算过程中获得的绿原酸及葡萄糖的浓度系数；

B.采用相同的预处理方法和分析方法，将质量未知的新鲜烟叶样品提取液进行气相色谱质谱联用的检测，通过测定新鲜烟叶样品提取液中葡萄糖和绿原酸的含量，代入二元逻辑回归判别模型中，获得分类概率预测值P。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

二元逻辑回归方程为：

P＝1/(1+e^{-(2.345*a-0.834*b)})

其中，a为新鲜烟叶样品提取液中绿原酸的相对含量，b为新鲜烟叶样品提取液中的葡萄糖的相对含量；P为分类概率预测值，其在不合格样品中降低，该概率预测值用于判别代谢组学研究中的新鲜烟叶样品的质量；当P大于等于0.5时为合格样品，小于0.5时为不合格样品；所述绿原酸的相对含量是指：采用气相色谱质谱联用时测定的绿原酸的相对内标的气相色谱质谱峰面积；所述葡萄糖的相对含量是指：采用气相色谱质谱联用时测定的葡萄糖的相对内标的气相色谱质谱峰面积。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：

气相色谱质谱联用时测定相对质谱峰面积时采用的内标为香草酸，其浓度为0.25μg/mg烟叶干重。

5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

新鲜烟叶样品提取液的制备：

1)将1-20mg的新鲜烟叶样品浸泡于1-20ml提取溶剂中2分钟以上，取上清液；所述提取溶剂为乙腈：异丙醇：水＝3：3：2v/v/v混合溶液，于提取溶剂中添加有0.00025-0.8mg内标香草酸；

2)上清液冻干后用衍生化试剂处理：

将0.1-2ml上清液的冻干物加入到20-500μl甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中30-60℃反应2分钟以上，甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液中甲氧胺盐酸盐浓度为20mg/mL；再加入15-400μl N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在30-60℃反应2分钟以上。

6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

气相色谱质谱联用包括安捷伦DB-5MS毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm和气相色谱串联质谱仪；

气相色谱检测条件：气相色谱质谱联用的分析在岛津QP2010气质联用系统完成；色谱柱为安捷伦DB-5MS毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm；氦气作为载气，流量1.2mL/min；进样口温度300℃，分流比10：1；程序升温：初始70℃，保持3分钟，5℃/min升至310℃，保持5分钟；进样量1μL；

质谱检测条件：EI电离模式，电离电压70eV，传输线温度280℃，离子源240℃，质量扫描范围33-600m/z，溶剂延迟时间5.6分钟。