CN104422742B - 基于代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量判别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别的方法。利用新鲜烟叶中芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶质量进行判别，该法操作简单快速、结果准确可靠，可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。

Description

基于代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量判别的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，是一种基于新鲜烟叶中的酚类物质含量对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别的方法。

背景技术

植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究植物体系的一种技术。代谢物是基因调控的最终产物，是联系基因型和生物表型的纽带，通过小分子代谢物的定性和定量分析可直接反映植物体当前的生理状态。在植物代谢组学研究中，要想得到真实客观的定性定量分析数据，其样品质量极为重要，这与样品保存条件密切相关。对于不能在取样后立刻提取代谢产物的植物样品，通常建议超低温保存。超低温保存是指在-80℃以下的极低温度环境下保存生物样品，此法可大大减慢甚至终止植物样品的代谢和衰老过程，保持植物材料的稳定性。

作为最早开展植物次生代谢研究的模式植物之一，烟草的分子代谢特征及重要代谢物的变化规律研究正逐渐受到关注。各种烟草靶向代谢组学及非靶向代谢组学研究技术也正被逐渐开发及应用。但由于烟草样品保存不当而导致的质量发生变化、代谢物水平不能反映烟草样品真实状态的情况时有发生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟草样品质量进行判别。

酚类化合物是植物中分布最广泛的次生代谢产物之一，主要由单宁类、黄酮类、香豆素类物质组成。酚类化合物具有调节自身生长、抗病毒、抗逆等生理功能，烟草中的酚类化合物在烟草的生长、烟草病毒的防治、烟叶的调制、分级及卷烟香气等方面都起着重要作用。近年来有关烟草中酚类化合物的提取、检测等方法的报道也是层出不穷，但未曾有人提出将新鲜烟叶中的酚类物质含量或含量比值用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。

发明内容

本发明目的在于提供一种对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别的方法。利用新鲜烟叶中芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，该法操作简单快速、结果准确可靠。

为了实现本发明目的，本发明技术方案为：

基于代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量判别的方法：通过检测新鲜烟叶中芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）含量，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。

其具体方法为：1）称取一定量的新鲜烟叶样本，加入含内标的提取溶剂，超声10-20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于HPLC分析。

2）HPLC分析方法的具体参数：色谱柱SymmetryC18（5μm4.6mm×250mm）；柱温30℃；检测波长340nm；进样量5μL；柱流量1.0mL/min；流动相A为含体积浓度10%甲醇的水溶液（含体积浓度2%乙酸），流动相B为含体积浓度10%水的甲醇溶液（含体积浓度2%乙酸）；洗脱梯度：0min时90/10（A/B，V/V），15min时70/30(A/B，V/V)，26min时10/90(A/B，V/V)并保持2min，28.1min时90/10（A/B，V/V），随后保持起始梯度90/10（A/B，V/V）至35min；其中0-15min为第一段线性梯度洗脱、15-26min为第二段线性梯度洗脱。

所述内标为牡荆黄素，其含量为0.012g/L，所述提取溶剂为含甲醇60-90%的水溶液，所述烟草鲜叶与含内标的提取溶剂按质量（mg）/体积（mL）比加入量为=25:1-3。

采用高效液相色谱法（HPLC）对新鲜烟叶样品中的芸香苷及山奈酚苷进行绝对定量分析，分析步骤如下：

HPLC分析数据可定性新鲜烟叶中的芸香苷及山奈酚苷，通过绘制标准曲线可对所测定的芸香苷、山奈酚苷进行绝对定量；将芸香苷与山奈酚苷含量的比值作为区分代谢组学合格样品、变质的不合格样品及部分变质的不合格样品的标准，即待测品种中芸香苷与山奈酚苷含量的比值在6.4及以上的为合格样品，可用于代谢组学分析，芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0以下的为变质的不合格样品，芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0-6.4之间的为部分变质的不合格样品。

本发明研究人员经过大量新鲜烟叶样品的分析研究，发现新鲜烟叶如果保存不当，其酚类物质的含量会发生较大变化，芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）含量的比值也会明显降低，此类样品将不能用于代谢组学分析。因此可以以芸香苷与山奈酚苷含量的比值作为一个标准对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。本发明的优点

本发明研究人员利用新鲜烟叶样品中芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）含量的比值和样品质量的相关性，对代谢组学新鲜烟叶样品质量进行判别。本发明具有以下特点：1）操作简单快速；2）结果准确可靠；3）样品用量少；4）适用于不同生育期的新鲜烟叶。本方法可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。

附图说明

图1实施例2中烟叶样品的芸香苷与山奈酚苷含量比值。

具体实施方式

下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

芸香苷（俗称芦丁）和山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）是植物中广泛存在的两种酚类物质，分子量分别为610.15和594.15。为得到酚类物质的绝对含量，本实验采用高效液相色谱法（HPLC）及内标法对新鲜烟叶样品中的芸香苷和山奈酚苷进行绝对定量分析。分析步骤如下：

1）称取一定量的新鲜烟叶样本，加入含内标牡荆黄素（0.012g/L）的提取溶剂（含甲醇60-90%的水溶液），超声10-20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于HPLC分析。

2）HPLC分析方法的具体参数：色谱柱SymmetryC18（5μm4.6mm×250mm）；柱温30℃；检测波长340nm；进样量5μL；柱流量1.0mL/min；流动相A为含体积浓度10%甲醇的水溶液（含体积浓度2%乙酸），流动相B为含体积浓度10%水的甲醇溶液（含体积浓度2%乙酸）；洗脱梯度：0min时90/10（A/B，V/V），15min时70/30(A/B，V/V)，26min时10/90(A/B，V/V)并保持2min，28.1min时90/10（A/B，V/V），随后保持起始梯度90/10（A/B，V/V）至35min；其中0-15min为第一段线性梯度洗脱、15-26min为第二段线性梯度洗脱。

采用标准曲线法可对所测定的酚类物质进行绝对定量。

实施例1

采用HPLC方法测定新鲜烟叶样品中的酚类物质含量，发现褐化样品的大部分酚类物质含量显著降低，芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）含量的比值也明显降低。

待测样品包括福建、贵州、湖南等省份的7个品种、21个产地的不同生育期新鲜烟叶样品243份（每个点有5-7个生物学重复）。其中包括208份合格样品（样本在采集、运送及预处理过程中均严格控制在-80℃），24份褐变样品（由于储运过程中液氮不足等原因已完全褐变），11份样品已知保存不当，但外观无明显变化。

样品分析步骤如下所述：

1）称取25mg新鲜烟叶样本，加入2mL含内标牡荆黄素0.012g/L的提取溶剂（含甲醇80%的水溶液），超声20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于HPLC分析。

2）HPLC分析方法的具体参数：色谱柱SymmetryC18（5μm4.6mm×250mm）；柱温30℃；检测波长340nm；进样量5μL；柱流量1.0mL/min；流动相A为含体积浓度10%甲醇的水溶液（含体积浓度2%乙酸），流动相B为含体积浓度10%水的甲醇溶液（含体积浓度2%乙酸）；洗脱梯度：0min时90/10（A/B，V/V），15min时70/30(A/B，V/V)，26min时10/90(A/B，V/V)并保持2min，28.1min时90/10（A/B，V/V），随后保持起始梯度90/10（A/B，V/V）至35min；其中0-15min为第一段线性梯度洗脱、15-26min为第二段线性梯度洗脱。

绘制了芸香苷（1-400μg/mL）与山奈酚苷（1-100μg/mL）的标准曲线。以目标物峰面积与内标物（牡荆黄素）峰面积的比值为纵坐标Y，质量浓度X（μg/mL）为横坐标，计算其标准曲线及相关系数，测定结果如下：Y_芸=0.0387X-0.0045，Y_山=0.0321X-0.0082，相关系数分别为0.9998和0.9999。

在上述条件下获得了243份新鲜烟叶中芸香苷与山奈酚苷等（说明书中是可以说等的）8种酚类物质的绝对含量，发现芸香苷与山奈酚苷含量的比值变化显著，详细数据见表1。

表1实施例1中烟叶样品信息及芸香苷与山奈酚苷含量的比值

^*含褐化样本

经过以上实验，发明人发现褐化样品中的芸香苷与山奈酚苷含量的比值显著降低。本发明将芸香苷与山奈酚苷含量的比值作为区分代谢组学正常样品、变质样品及部分变质样品的标准。即待测品种中芸香苷与山奈酚苷含量的比值在6.4及以上的为正常样品，可用于代谢组学分析，芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0以下的为变质样品，芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0-6.4之间的为部分变质样品。

实施例2

随机挑选来自不同产地、不同品种的不同生育期新鲜烟叶样品92份（每个点有5-6个生物学重复），对其中的酚类物质进行测定。样品分析步骤如下所述：

1）称取25mg新鲜烟叶样本，加入2mL含内标牡荆黄素0.012g/L的提取溶剂（含甲醇80%的水溶液），超声20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于HPLC分析。2）HPLC分析方法的具体参数：色谱柱SymmetryC18（5μm4.6mm×250mm）；柱温30℃；检测波长340nm；进样量5μL；柱流量1.0mL/min；流动相A10%甲醇的水溶液（2%乙酸），流动相B88%甲醇（2%乙酸）；梯度洗脱：0.01min10%B，15min30%B，26-28min90%B，28.1min10%B，35min结束。

该分析条件下获得了上述92份新鲜烟叶中芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷（简称山奈酚苷）的含量比值。按照附例1所述标准对所测样品进行质量判别。待测品种中芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0以下的为变质样品，包括贵州红大的5个盛花期样品；芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0-6.4之间的为部分变质样品，包括河南红大及河南K-326的11个中部叶成熟期样品，其他的76个样品为合格样品。此结果与部分样品在保存过程中的液氮不足行为完全吻合。

表2列出了本实施例中实验样品的信息，其中芸香苷与山奈酚苷含量的比值见图1。

表2实施例2中烟叶样品信息

此结果说明本发明提出的代谢组学新鲜烟叶样品质量判别方法在不同的新鲜烟叶样品中能得到同样的区分效果，也表明本发明方法的可行性和可靠性。

尽管对本发明已作了详细的说明并印证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。

Claims (3)

1.基于代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量判别的方法，其特征在于：通过检测新鲜烟叶中芸香苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量，山奈酚-3-O-芸香糖苷简称山奈酚苷，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，判别标准为；

将芸香苷与山奈酚苷质量含量的比值作为区分代谢组学合格样品、变质的不合格样品及部分变质的不合格样品的标准，即待测品种中芸香苷与山奈酚苷含量的比值在大于6.4的为合格样品，可用于代谢组学分析，芸香苷与山奈酚苷含量的比值在小于2.0的为变质的不合格样品，芸香苷与山奈酚苷含量的比值在2.0-6.4之间的为部分变质的不合格样品；

其具体方法为：1)称取新鲜烟叶样本，加入含内标的提取溶剂，超声10-20分钟后离心，将上清液移至进样瓶中用于HPLC分析；

2)HPLC分析方法的具体参数：色谱柱SymmetryC18，5μm4.6mm×250mm；柱温30℃；检测波长340nm；进样量5μL；柱流量1.0mL/min；流动相A为含体积浓度10％甲醇的水溶液，流动相B为含体积浓度10％水的甲醇溶液，流动相A和B均含体积浓度2％乙酸；洗脱梯度：0min时90/10(A/B，V/V)，15min时70/30(A/B，V/V)，26min时10/90(A/B，V/V)并保持2min至28min，28.1min时90/10(A/B，V/V)，随后保持起始梯度90/10(A/B，V/V)至35min；其中0-15min为第一段线性梯度洗脱、15-26min为第二段线性梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述内标为牡荆黄素，其含量为0.012g/L提取溶剂，所述提取溶剂为含体积浓度甲醇60-90％的水溶液，所述新鲜烟叶与含内标的提取溶剂按质量(mg)/体积(mL)比加入量为＝25:1-3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用高效液相色谱法(HPLC)对新鲜烟叶样品中的芸香苷及山奈酚苷进行绝对定量分析，分析步骤如下：

HPLC分析数据可定性新鲜烟叶中的芸香苷及山奈酚苷，通过测定一系列已知质量浓度的目标物峰面积，用其峰面积与内标物牡荆黄素的峰面积比值作为纵坐标，质量浓度作为横坐标，绘制相应的标准曲线，通过标准曲线可对待测样品中的芸香苷、山奈酚苷进行绝对定量。