CN104777256B - 同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，先将烤烟烟叶粉碎后用甲醇溶液萃取，过滤后滤液用超高效液相色谱法进行分析，采用HSST3色谱柱和二极管阵列检测器，其检测波长为342nm，其参比波长为480nm，检测波长的带宽为4nm，参比波长的带宽为100nm；流动相的流速为0.4mL/min；流动相A为冰乙酸的水溶液，流动相B为冰乙酸的甲醇溶液，以梯度淋洗的方式同时测定了烤烟中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基‑3‑芸香糖苷这6种多酚的含量。本发明所述方法的加标回收率在95.6～109.3％之间，检出限为3.7～9.9μg/g，相对标准偏差为0.5～3.9％(n＝4)，标准溶液的相关系数均大于0.9995，而且方法的前处理简单，分析时间短。
Description
技术领域
本发明的实施方式涉及烟叶化学成分分析技术领域，更具体地，本发明的实施方式涉及一种同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法。
背景技术
烟草中含有数量众多、变化复杂的酚类化合物，其种类在烟叶和烟气中已鉴定出的有280多种。按照酚类化合物中羟基数目的不同，可分为简单酚和多酚两类。简单酚在烟草中的种类较多，但含量极微。多酚的种类相对来说较少，但含量高，也较为重要。这是因为烟草中的多酚一般具有令人愉快的香气，在燃吸时由于干馏、氧化和裂解等作用，可产生多种具有芳香气味的成分。多酚类物质在卷烟燃吸时还能产生酸性反应，中和烟气的部分碱性，使卷烟的吃味醇和。研究显示，烟草中多酚类物质的含量高低与烟叶的等级相一致，与卷烟制品的等级也呈正相关，多酚类物质含量高的卷烟，其等级也越高，反之亦然。因此，曾有学者提出将烟草中酚类物质含量与蛋白质氮含量的比值定义为“芳香值”，作为判断烟草香、吃味的化学指标。目前，多酚类物质也是烟草科研工作者和卷烟企业的配方人员比较关心的一类化学成分，对它的研究越来越多，也越来越具体。
烟草中的多酚主要有咖啡单宁类(新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸等)、黄酮类(芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷等)和香豆素类(莨菪亭和莨菪灵等)等。绿原酸和芸香苷是烟草中含量最高的两种多酚，新绿原酸和隐绿原酸是绿原酸的异构体。一些研究显示，绿原酸、芸香苷、新绿原酸和隐绿原酸是烤烟中含量最高的4种多酚，而且对卷烟的感官质量有重要影响。莰菲醇基-3-芸香糖苷和芸香苷的结构非常相似，都是黄酮类芸香糖苷，在烟草中的含量也比较高。莨菪亭是典型的香豆素类多酚，对烟叶和卷烟的品质也有重要影响。因此，研究能准确、快速地测定烟草中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷的分析方法具有重要意义。超高效液相色谱法(Ultra Performance LiquidChromatography,UPLC)是Waters公司在2004年时推出的，其技术核心是在非常高的压力下(其柱压最高可达到18,000PSI)，通过降低固定相的粒度(可采用1.7μm的色谱柱填料)，提高流动相线速度的方法，对复杂样品进行高效、快速的分离和分析。目前，采用超高效液相色谱法同时测定烤烟中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷6种多酚的分析方法尚未见报道。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种利用超高效液相色谱法同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，解决新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷6种多酚含量分析方法复杂和结果不准确的问题。
为解决上述的技术问题，本发明的一种实施方式采用以下技术方案：
一种同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，它包括以下步骤：
(1)将烤烟烟叶干燥后粉碎，获得烟叶粉碎料；
(2)称取少量上述烟叶粉碎料，用甲醇溶液萃取后过滤，得到滤液；
(3)将所述滤液采用超高效液相色谱法进行分析获得烤烟烟叶的超高效液相色谱图，其分析条件为：采用HSS T3色谱柱，其柱温为30℃，进样量为1μL；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相的流速为0.4mL/min；所述流动相A为冰乙酸的水溶液，其冰乙酸与水的体积比为2:100；所述流动相B为冰乙酸的甲醇溶液，其冰乙酸与甲醇的体积比为2:100；梯度洗脱程序如下：
| 时间 | 流动相A | 流动相B |
| 0.00min | 80.0％ | 20.0％ |
| 3.5min | 75.0％ | 25.0％ |
| 7.5min | 10.0％ | 90.0％ |
| 9.8min | 10.0％ | 90.0％ |
| 10.0min | 80.0％ | 20.0％ |
| 15.0min | 80.0％ | 20.0％ |
；紫外检测器采用二极管阵列检测器，其检测波长为342nm，其参比波长为480nm，检测波长的带宽为4nm，参比波长的带宽为100nm；
(4)根据上述超高效液相色谱图，以保留时间定性，用外标法定量，获得烤烟烟叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷共6种多酚的含量。
本发明所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法中，步骤(1)所述干燥是将烤烟烟叶在40℃下干燥8h，干燥后采用YC/T 31－1996标准中规定的方法测定烤烟烟叶的含水量，在步骤(4)计算烤烟烟叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷共6种多酚的含量时排除水分对6种多酚含量的影响。
本发明所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法中，步骤(1)所述烟叶粉碎料全部能够通过40目筛。
本发明所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法中，步骤(2)所述萃取的方法是：将称取的烟叶粉碎料放入样品瓶，按照烟叶粉碎料的重量与甲醇溶液的体积之比为0.095～0.105g:50mL向上述样品瓶中加入甲醇溶液，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为1:4，然后将样品瓶放入超声波清洗器中萃取30～35min。优选的，所述烟叶粉碎料的重量与甲醇溶液的体积之比为0.1g:50mL。超声波萃取30～35min时能将6种多酚提取完全。
本发明所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法中，所述HSS T31.8μm色谱柱的尺寸为2.1mm×100mm。
本发明所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法中，所述以保留时间定性和用外标法定量前，分别称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷适量，用甲醇溶液溶解和稀释，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为1:4，配置成6种多酚的下述浓度的标准溶液，下述浓度均以μg/mL为计量单位：
；将上述所有标准溶液分别采用步骤(3)所述的超高效液相色谱法进行分析，根据标准溶液的浓度及色谱图的响应峰面积，建立标准溶液的线性工作曲线，该线性工作曲线用于外标法定量。
本发明所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法中，步骤(2)所述过滤是采用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤。
与传统的高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)相比，UPLC的分析速度可达到普通HPLC的9倍，同时对流动相和试样的消耗也比传统HPLC少的多。本发明采用Waters公司生产的HSS T3色谱柱进行分离，这是因为烟草中的化合物种类多，成分复杂，色谱分离时容易受其他成分的干扰，而且多酚类化合物的极性相对来说较强，绿原酸和新绿原酸等成分在普通C18色谱柱上的保留较弱。HSS T3色谱柱采用高强度硅胶(HSS:High Strength Silica)作为填料基质，是一款3键键合的全封端反相C18色谱柱(T3:Trifunctional C18)，兼容100％的水相流动相，比较适合极性化合物的分离，而且硅胶基质的色谱柱的柱效较高。
采用甲醇-水作流动相时，多酚类化合物难以获得较好的分离，而且色谱峰拖尾严重，这是因为仅用甲醇-水作流动相时，多酚类化合物的酚羟基易产生电离，在固定相的表面有双重的保留机制，导致色谱峰的分离度和峰形变差。在流动相中加入适当的乙酸可抑制酚羟基的电离，使多酚成为中性分子，从而改善待测物质的分离度和峰形，使待测的这6种化合物分离度和峰形均较好。
采用二极管阵列检测器(Diode Array Detector,DAD)对6种多酚的标准溶液在342nm进行扫描，6种化合物在342nm波长处的紫外吸收均较强。
与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：采用超高效液相色谱法可以同时测定烤烟中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷。本发明所述方法的加标回收率在95.6～109.3％之间，检出限为3.7～9.9μg/g，相对标准偏差为0.5～3.9％(n＝4)，标准溶液的相关系数均大于0.9995，而且方法的前处理简单，分析时间短，完全能够满足烤烟中这6种多酚的检测要求。
附图说明
图1为标准品的UPLC色谱图。
图2为本发明烤烟样品的UPLC色谱图，其中各峰分别代表：1—新绿原酸，2—绿原酸，3—隐绿原酸，4—莨菪亭，5—芸香苷，6—莰菲醇基-3-芸香糖苷。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
选取来自云南、河南、四川、广东、福建和重庆地区的18个烤烟片烟进行实验。首先将烟叶样品在40℃下干燥8小时，然后粉碎过40目筛，采用YC/T 31－1996标准中规定的方法测定烤烟样品的水分。准确称取粉碎、过40目筛后的烟叶样品0.1g，放入100mL样品瓶中，加入50mL甲醇溶液(甲醇与水的体积比为1：4，下同)，然后放入超声波清洗器中萃取30min，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤后进行UPLC分析，UPLC的色谱条件为：
检测器：二极管阵列检测器，检测波长342nm(带宽4nm)，参比波长480nm(带宽100nm)；色谱柱：Waters ACQUITYHSS T31.8μm色谱柱(2.1mm×100mm)，柱温30℃；进样量为1μL；流动相包括流动相A和流动相B，流动相的流速为0.4mL/min，流动相A为冰乙酸的水溶液(冰乙酸与水的体积比为2:100)，流动相B为冰乙酸的甲醇溶液(冰乙酸与甲醇的体积比为2:100)；梯度洗脱程序见表1，0～3.5min洗脱使新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸逐渐分离，3.5～7.5min洗脱使莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷逐渐分离，7.5～9.8min时将色谱柱中残留的烟草中其他成分洗脱下来，9.8～10.0min回到梯度洗脱时的起始状态，10.0～15.0min使色谱柱进行平衡，然后即可进行下一次分析。
表1梯度洗脱程序
| 时间 | 流动相A | 流动相B |
| 0.00min | 80.0％ | 20.0％ |
| 3.5min | 75.0％ | 25.0％ |
| 7.5min | 10.0％ | 90.0％ |
| 9.8min | 10.0％ | 90.0％ |
| 10.0min | 80.0％ | 20.0％ |
| 15.0min | 80.0％ | 20.0％ |
上述UPLC分析获得18个烤烟样品的色谱图，其中一种样品的色谱图如图2所示，其他烤烟样品的色谱图与图2类似。
准确称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷适量，用甲醇溶液溶解，配制成浓度分别为0.2mg/mL、1.0mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准贮备溶液，然后分别转移一定体积的贮备溶液，用甲醇溶液稀释，配制成标准品的系列工作溶液(表2)。所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比均为1:4，表2中6种化合物的浓度均以μg/mL为计量单位。
表2 6种化合物标准溶液的浓度
将所配制的系列工作溶液分别进行UPLC分析，获得如图1所示的标准品色谱图。
根据所配制标准品工作溶液的浓度及其响应峰面积，建立标准溶液的线性工作曲线(表3，“y”为色谱峰面积；“x”为化合物的浓度，单位为μg/mL)，采用3倍的信噪比法计算检出限(Limit of detection,LOD)。
表3 6种化合物的标准曲线、相关系数及检出限
根据保留时间定性，用外标法进行定量，测定18个烤烟样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷的含量，并计算干品含量，计量单位为mg/g，结果如表4。
表4 18个烤烟样品的多酚含量
从表4可以看出：烤烟中这6种多酚的含量从高到低依次为绿原酸＞芸香苷＞隐绿酸＞新绿原酸＞莰菲醇基-3-芸香糖苷＞莨菪亭；莨菪亭在不同烤烟中的含量差别较大，其变异系数(Coefficient of Variation,CV)为41.5％，在6种多酚中最高，其次是芸香苷，其变异系数为30.6％，绿原酸的变异系数在6种多酚中最小。
从表3可以看出，这6种多酚的相关系数均大于0.9995，显示出极好的线性。采用3倍的信噪比法计算检出限(Limit of detection,LOD)，6种多酚的检出限在3.7～9.9μg/g之间，完全能够满足烤烟中多酚含量的测定要求。
下面对本发明方法的回收率与精密度进行验证：
首先，准确称取粉碎、过筛而且混合均匀的某牌号烟叶0.1g，放入100mL样品瓶中，按照本发明的分析方法进行测试，检测出烟叶中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷含量，然后，另外称取这个牌号的烟叶样品3份，均放入同样的100mL样品瓶中，分别加入低、中、高3个浓度的多酚标准溶液1.0mL，按照同样的方法进行回收率实验(表5)。每次实验均做4个平行样，取其平均值作为检测结果，并计算平行分析时的相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)，结果见表5。
表5 6种多酚的加标回收率与相对标准偏差
从表5可以看出，实验方法低、中、高3个浓度的加标回收率在95.6～109.3％之间，准确度很好。正常烟叶测试时的相对标准偏差为1.4～2.5％，回收率实验时的相对标准偏差为0.5～3.9％，显示方法的精密度很好，完全能够满足烟叶中多酚含量的测定要求。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
Claims (8)
1.一种同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)将烤烟烟叶干燥后粉碎，获得烟叶粉碎料；
(2)称取少量上述烟叶粉碎料，用甲醇溶液萃取后过滤，得到滤液；
(3)将所述滤液采用超高效液相色谱法进行分析获得烤烟烟叶的超高效液相色谱图，其分析条件为：采用HSS T3色谱柱，其柱温为30℃，进样量为1μL；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相的流速为0.4mL/min；所述流动相A为冰乙酸的水溶液，其冰乙酸与水的体积比为2:100；所述流动相B为冰乙酸的甲醇溶液，其冰乙酸与甲醇的体积比为2:100；梯度洗脱程序如下：0.00min时，流动相A：流动相B＝80：20；3.5min时，流动相A：流动相B＝75：25；7.5min时，流动相A：流动相B＝10：90；9.8min时，流动相A：流动相B＝10：90；10.0min时，流动相A：流动相B＝80：20；15.0min时，流动相A：流动相B＝80：20；紫外检测器采用二极管阵列检测器，其检测波长为342nm，其参比波长为480nm，检测波长的带宽为4nm，参比波长的带宽为100nm；
(4)根据上述超高效液相色谱图，以保留时间定性，用外标法定量，获得烤烟烟叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷共6种多酚的含量。
2.根据权利要求1所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于步骤(1)所述干燥是将烤烟烟叶在40℃下干燥8h，干燥后采用YC/T31－1996标准中规定的方法测定烤烟烟叶的含水量，在步骤(4)计算烤烟烟叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷共6种多酚的含量时排除水分对6种多酚含量的影响。
3.根据权利要求1所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于步骤(1)所述烟叶粉碎料全部能够通过40目筛。
4.根据权利要求1所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于步骤(2)所述萃取的方法是：将称取的烟叶粉碎料放入样品瓶，按照烟叶粉碎料的重量与甲醇溶液的体积之比为0.095～0.105g:50mL向上述样品瓶中加入甲醇溶液，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为1:4，然后将样品瓶放入超声波清洗器中萃取30～35min。
5.根据权利要求4所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于所述烟叶粉碎料的重量与甲醇溶液的体积之比为0.1g:50mL。
6.根据权利要求1所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于所述HSS T3 1.8μm色谱柱的尺寸为2.1mm×100mm。
7.根据权利要求1所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于所述以保留时间定性和用外标法定量前，分别称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、莨菪亭、芸香苷和莰菲醇基-3-芸香糖苷适量，用甲醇溶液溶解和稀释，所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为1:4，配置成6种多酚的下述浓度的标准溶液，标准溶液的序号分别为st1～st6：st1标准溶液含新绿原酸0.5μg/mL、绿原酸2.5μg/mL、隐绿原酸0.5μg/mL、莨菪亭0.1μg/mL、芸香苷2.5μg/mL和莰菲醇基-3-芸香糖苷0.2μg/mL；st2标准溶液含新绿原酸1.0μg/mL、绿原酸5.0μg/mL、隐绿原酸1.0μg/mL、莨菪亭0.2μg/mL、芸香苷5.0μg/mL和莰菲醇基-3-芸香糖苷0.4μg/mL；st3标准溶液含新绿原酸2.0μg/mL、绿原酸10.0μg/mL、隐绿原酸2.0μg/mL、莨菪亭0.4μg/mL、芸香苷10.0μg/mL和莰菲醇基-3-芸香糖苷0.8μg/mL；st4标准溶液含新绿原酸4.0μg/mL、绿原酸20.0μg/mL、隐绿原酸4.0μg/mL、莨菪亭0.8μg/mL、芸香苷20.0μg/mL和莰菲醇基-3-芸香糖苷1.6μg/mL；st5标准溶液含新绿原酸10.0μg/mL、绿原酸50.0μg/mL、隐绿原酸10.0μg/mL、莨菪亭2.0μg/mL、芸香苷50.0μg/mL和莰菲醇基-3-芸香糖苷4.0μg/mL；st6标准溶液含新绿原酸20.0μg/mL、绿原酸100.0μg/mL、隐绿原酸20.0μg/mL、莨菪亭4.0μg/mL、芸香苷100.0μg/mL和莰菲醇基-3-芸香糖苷8.0μg/mL；将上述所有标准溶液分别采用步骤(3)所述的超高效液相色谱法进行分析，根据标准溶液的浓度及色谱图的响应峰面积，建立标准溶液的线性工作曲线，该线性工作曲线用于外标法定量。
8.根据权利要求1所述的同时测定烤烟中6种多酚含量的分析方法，其特征在于步骤(2)所述过滤是采用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤。
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