CN113533576B - 一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法，通过采取适当酸度的甲醇溶液对雪茄烟中多酚化合物进行提取，再使用高效液相色谱仪进行检测的方法。雪茄烟中多酚含量远低于烤烟，采用本发明方法能准确测定雪茄烟中多酚化合物含量，平均相对标准偏差小于2.8％，各指标的平均回收率在92.9％～99.4％之间，具有操作简便，快速准确、灵敏度高、重复性好、检测成本低的优点，可应用于雪茄烟质量特性和感官风格特征研究。

Description

一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法

技术领域

本发明涉及烟叶理化检验技术领域，尤其涉及一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法。

背景技术

烟草中化学成分种类和含量决定其内在质量和感官品质，烟草中多酚类化合物对烟叶色泽、香味和烟气生理强度具有重要影响，是评价和衡量烟草品质的重要指标。绿原酸即咖啡单宁，是咖啡酸与奎尼酸的二缩酯，本身具有弱的清香，在多酚氧化酶的作用下形成多醌，与氨基酸发生非酶促棕色化反应，生成毗嗪、吡啶、吡咯类物质等，对烟叶的色泽和香味有重要影响。烟草绿原酸占多酚总量的75％～95％，不同来源烟草多酚类物质的含量变化范围较宽。多酚类含量随着烟草遗传类型和栽培条件的变化而大不相同。与烤烟和香料烟不同，雪茄烟是一种晾晒烟,多酚类物质含量在调制期间有明显减少，雪茄烟中多酚类物质含量水平远低于烤烟。一些研究表明，烤烟中绿原酸、咖啡酸和芸香苷的平均含量要远远高于晒烟和白肋烟。而晒烟中莨菪亭具有较高的含量，与烤烟相当。白肋烟中各个多酚(莨菪亭除外)的含量均远远低于其他品种的烟样。这有可能表明不同种类烟草，由于其各自在栽培、管理、制作加工工序以及烟草本身基因的不同，从而导致了多酚含量差异较大。有研究表明，雪茄中多酚与感官质量的关系密切,基于雪茄烟中多酚类物质较低水平含量的情况，准确测定雪茄烟中多酚含量具有重要意义。

目前烟草中多酚含量测定已有标准方法YC/T 202-2006《烟草及烟草制品多酚类化合物绿原酸、莨菪亭和芸香苷的测定》，但该方法仍存在以下问题：(1)测定多酚指标较少，新绿原酸和隐绿原酸是绿原酸的异构体，一些研究显示，绿原酸、芸香苷、新绿原酸和隐绿原酸是是烤烟中含量最多的4种多酚，对卷烟感官质量有重要影响。因此测定烟草中新绿原酸和隐绿原酸含量十分重要。(2)该标准方法适用于测定烤烟中较高含量水平多酚，在测定雪茄等晾晒烟时，由于其多酚含量低，该方法灵敏度不能满足准确测定的需要。现有文献针对烟草中多酚的检测技术报道较多，主要有HPLC、HPLC-MS/MS法等测定烟草多酚含量。但现有方法均以烤烟烟叶(包括新鲜烟叶)为研究对象，该类烟草样品多酚含量远高于雪茄烟(烤烟新鲜烟叶含量水平达到百分之一级别)，检测方法灵敏度难以满足准确测定雪茄烟中多酚的需要，如中国专利CN104777256A、CN109696514B以及文献报道；另外，CN108918711A公开了一种采用HPLC-MS/MS测定烟叶中多酚含量方法，该方法灵敏度较高，但仅对一个高含量新鲜烟叶样品做了测定，无调制后烟叶(含量远低于新鲜烟叶)和低含量烟草类型样品测定数据，低含量样品萃取条件和效率有待考察，且样品制备较麻烦，需液氮冷冻，对实验室要求较高，加上HPLC-MS/MS价格昂贵，在应用普适性上受到限制。近年来，国内雪茄烟市场快速增长，剖析国产雪茄化学成分，明晰国产雪茄风格特征物质基础迫在眉睫。多酚对烟叶色泽、香味和烟气生理强度具有重要影响，是评价和衡量烟草品质的重要指标，亟需建立准确测定雪茄烟等低含量多酚样品的检测方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法，本发明改进当前方法的前处理条件，使之适用于雪茄烟等晾晒烟中较低含量多酚检测，由于雪茄烟多酚含量低，绿原酸(包括隐绿原酸、新绿原酸2个异构体)、莨菪亭、芸香苷是主要多酚物质，对感官风格质量起主要作用，因而本发明建立了测定雪茄烟5个多酚化合物的HPLC 方法，同时，应用建立的方法检测了国内外雪茄烟叶和成品烟支110个样品5种多酚类化合物的含量。本发明的方法操作简便，灵敏度高，适合雪茄烟等低多酚含量晾晒烟的快速检测分析。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法，包括以下步骤：

步骤1，雪茄烟样品的处理；

有机溶剂甲醇可以提高多酚的溶解度，并且多酚类化合物为酸性化合物，加入乙酸可以加大目标物的萃取效率。因此分别选用50％甲醇水溶液，水+甲醇+乙酸(88+10+2)和水+甲醇+乙酸(10+88+2)进行样品的萃取，结果表明，采用水+甲醇+乙酸(10+88+2)溶液萃取效率最高，可以实现雪茄烟中痕量多酚化合物的萃取。萃取溶液的准备：按水：甲醇：乙酸体积分数为10：88：2配制成萃取溶液，混匀。

分别考察料液比为1:10和1:20，结果，由于雪茄烟中多酚含量较低，只有芸香苷含量较高，因此1:10的料液比更有利于绿原酸的检出，最终选择称取1g样品，加入10ml萃取溶剂。按YC/T31制备试样，测定水分含量。称取1g样品，准确至0.1mg，置于25mL锥形瓶内，再准确加人10mL萃取溶液，置于超声波振荡器超声(频率:40kHz)提取20min。取适量萃取溶液经0.45μm的水相滤膜过滤后，转移至2mL色谱瓶中，进行HPLC分析。

步骤2，配制标准溶液；

分别称量5mg新绿原酸、100mg绿原酸、5mg隐绿原酸、5mg新绿原酸、5mg莨菪亭、100mg芸香苷，准确至0.1mg，加人约30ml甲醇完全溶解后，转移到100mL的容量瓶中，加萃取溶液稀释至刻度，配制成一级标准溶液，此溶液密封于4℃存放，有效期为一年。然后各取10mL一级标准溶液移至100mL容量瓶中用萃取溶液稀释至刻度，此为二级标准溶液，密封于4℃存放，有效期为3个月；然后分别准确移取1mL、2mL、5mL二级标准溶液，1mL、 2mL、5mL一级标准溶液至100mL容量瓶中用萃取溶液稀释至刻度，此六个标准溶液以及二级标准溶液为系列标准校准溶液。在4℃冰箱内存放，有效期为3个月。

步骤3，对样品进行高效液相色谱法测定；采用Luna色谱柱可以实现5个目标物的分离，效果较好。利用高效液相色谱仪对标准工作溶液和样品萃取溶液进行检测，分析条件为色谱柱：使用Agilent Luna 3u PFP(2)色谱柱，150mm×4.6mm，填料粒度3μm，柱温：30℃；流动相A：水：甲醇：乙酸体积分数为10：88：2；流动相B：水：甲醇：乙酸体积分数为10：88：2；柱流量：0.8mL/min；进样体积：10μL；检测器：紫外检测器；紫外检测器波长为:340nm 参比波长:480nm，梯度：二元溶剂流动相梯度如表1所示。

表1洗脱梯度表

时间，min	流动相A，％	流动相B，％
			0	100	0
16.5	80	20
			30	20	80
30.5	100	0
			40	100	0

本发明方法的标准曲线和检测限：

采用高效液相色谱仪测定绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的标准系列工作曲线溶液，得到5种化合物的积分峰面积，分别用5种化合物的积分面积作为纵坐标，各化合物的浓度作为横坐标，建立5种化合物的校正曲线。对校正数据进行线性回归，R²应不小于0.99。测定样品时，根据样品中的峰面积计算5种化合物的浓度(μg/g)。各化合物的标准工作曲线及检测限见表2。

表2化合物的标准曲线和检测限

注：检出限以3倍信噪比(S/N＝3)计算。

本发明方法的重复性和加标回收率：

分别采用烤烟、香料烟、白肋烟和雪茄烟为样品，进行方法的重复性测试，每个样品重复测定5次，计算本方法中绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的相对标准偏差，结果如表3，可以看出，样品测试结果的平均相对偏差小于2.80％；说明本法的重复性较好。结果如表3所示，测定结果的相对标准偏差显示方法具有较好的重复性。

表3方法的重复性(n＝5)

次数	新绿原酸	绿原酸	隐绿原酸	莨菪亭	芸香苷
						1	1.06	1.37	1.25	1.17	31.66
2	1.02	1.32	1.23	1.15	32.21
						3	1.03	1.36	1.26	1.13	31.68
4	1.05	1.34	1.24	1.21	32.05
						5	1.09	1.42	1.31	1.16	31.58
平均值(μg/g)	1.05	1.36	1.26	1.16	31.84
						相对标准偏差	2.61％	2.79％	2.46％	2.55％	0.87％

分别采用烤烟、香料烟、白肋烟和雪茄烟为样品，添加低、中、高不同浓度水平的的标样，进行加标回收率试验，每个水平样品重复测定3次，计算本方法中绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的回收率，结果如表4，可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测烟草样品中绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的平均回收率在92.94％～99.36％之间，说明本法的回收率较高，本发明除了能准确测定雪茄烟中多酚含量，同样也能用于其他烟草类型样品的多酚测定。

表4方法的回收率(％)

化合物	新绿原酸	绿原酸	隐绿原酸	莨菪亭	芸香苷
						烤烟	92.94	97.63	97.65	98.14	99.18
香料烟	93.46	98.26	98.25	97.68	99.25
						白肋烟	98.02	99.14	98.61	96.82	98.67
雪茄烟	96.42	99.34	99.31	98.36	99.36

本发明的有益效果在于：

本发明通过改进样品处理方法、优化仪器检测条件，雪茄烟中多酚HPLC检测方法的灵敏度大幅提高，5个多酚色谱峰分离效果好，多酚化合物检出限为0.01～0.03μg/g，加标回收率为92.94％～99.36％，相对标准偏差为0.87％～2.79％，灵敏度高、重复性和回收率好；本发明检出限比当前烟草行业标准(YC/T 202-2006)和文献报道提高2个数量级。

采取本发明方法对100余个国内外雪茄烟原料和成品烟支的多酚含量测定，含量分布范围位于0.02～598.3μg/g之间，本发明方法前处理简便、稳定、可靠，完全满足雪茄烟及低含量烟草的多酚含量准确、高效测定的需求，适合推广应用于雪茄烟等晾晒烟感官质量和风格特征研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要实用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明标准溶液色谱图；

图2为本发明样品色谱图；

1—新绿原酸；2—绿原酸；3—隐绿原酸；4—莨菪亭；5—芸香苷；

图3为本发明国内外雪茄烟叶和雪茄烟支样品多酚含量分布图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1：

1.试剂与仪器：

标准品：绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷标准品；

试剂：甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，乙酸(分析纯，美国Sigma-Aldrich公司)。实验用水为Milli-Q纯水系统所制去离子水。

仪器：高效液相色谱仪(安捷伦公司)；电子分析天平，感量：0.0001g，(瑞士Mettler 公司)；超声波振荡器(美国必能信公司)；有机相针式滤器，13mm×0.45μm(上海安谱科学仪器有限公司)。

2.样品处理：

萃取溶液的准备：按水：甲醇：乙酸体积分数为10：88：2配制成萃取溶液，混匀。

按YC/T31制备试样，测定水分含量。称取1g样品，准确至0.1mg，置于25mL锥形瓶内，再准确加人10mL萃取溶液，置于超声波振荡器超声(频率:40kHz)提取20min。取约 2mL萃取溶液经0.45μm的水相滤膜过滤后，转移至2mL色谱瓶中，进行HPLC分析。

3.标准工作溶液制备：

分别称量5mg新绿原酸、100mg绿原酸、5mg隐绿原酸、5mg莨菪亭、100mg芸香苷，准确至0.1mg，加人约30ml甲醇完全溶解后，转移到100mL的容量瓶中，加萃取溶液稀释至刻度，配制成一级标准溶液，此溶液密封于4℃存放，有效期为一年。然后各取10mL 一级标准溶液移至100mL容量瓶中用萃取溶液稀释至刻度，此为二级标准溶液，密封于4℃存放，有效期为3个月；然后分别准确移取1mL、2mL、5mL二级标准溶液，1mL、2mL、 5mL一级标准溶液至100mL容量瓶中用萃取溶液稀释至刻度，此六个标准溶液以及二级标准溶液为系列标准校准溶液。在4℃冰箱内存放，有效期为3个月。

各指标浓度如表5所示：

表5标准溶液浓度

名称	1#μg/mL	2#μg/mL	3#μg/mL	4#μg/mL	5#μg/mL	6#μg/mL	7#μg/mL
								新绿原酸	0.05	0.1	0.25	0.5	1	2.5	5
绿原酸	1	2	5	10	20	50	100
								隐绿原酸	0.05	0.1	0.25	0.5	1	2.5	5
莨菪亭	0.05	0.1	0.25	0.5	1	2.5	5
								芸香苷	1	2	5	10	20	50	100

4.高效液相色谱检测条件

利用高效液相色谱仪对标准工作溶液和样品萃取溶液进行检测，条件如下。色谱柱：推荐使用Agilent Luna 3u PFP(2)色谱柱，150mm×4.6mm，填料粒度3μm。柱温：30℃；流动相A：水+甲醇+乙酸＝88+10+2(体积分数)；流动相B：水+甲醇+乙酸＝10+88+2(体积分数)；柱流量：0.8mL/min；进样体积：10μL。检测器：紫外检测器；紫外检测器波长为:340nm参比波长:480nm，梯度：二元溶剂流动相梯度如表1所示。

5.测定方法:

采用高效液相色谱仪测定绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的标准系列工作曲线溶液(如图1)，得到5种化合物的积分峰面积，分别用5种化合物的积分面积作为纵坐标，各化合物的浓度作为横坐标，建立5种化合物的校正曲线。对制备好的雪茄烟叶样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积(如图2)，代入标准曲线，分别得到样品中的绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的含量，结果见表6。

表6多酚化合物的检测结果

化合物	含量(μg/g)
		新绿原酸	2.88
绿原酸	0.26
		隐绿原酸	0.02
莨菪亭	0.12
		芸香苷	5.11

实施例2：

具体步骤如实施例1所述，选择雪茄烟叶另一样品B，测得的含量见表7。

表7多酚化合物的检测结果

化合物	含量(μg/g)
		新绿原酸	0.10
绿原酸	0.46
		隐绿原酸	0.10
莨菪亭	0.14
		芸香苷	0.62

实施例3：

具体步骤如实施例1所述，选择雪茄烟另一样品C，测得的含量见表8。

表8多酚化合物的检测结果

化合物	含量(μg/g)
		新绿原酸	2.35
绿原酸	4.95
		隐绿原酸	6.87
莨菪亭	3.60
		芸香苷	243.11

实施例4：

具体步骤如实施例1所述，选择雪茄烟另一样品D，测得的含量见表9。

表9多酚化合物的检测结果

化合物	含量(μg/g)
		新绿原酸	2.95
绿原酸	3.39
		隐绿原酸	4.05
莨菪亭	5.30
		芸香苷	52.07

实施例5：

如图3，利用本发明的方法测定111个国内外雪茄烟叶和成品多酚含量分布，可见其含量分布范围位于0.02～598.3μg/g之间，本发明方法完全满足雪茄烟及低含量烟草的多酚含量准确、高效测定的需求。

对比例1：

对实施例2雪茄烟叶分别采取本发明方法和烟草行业标准(YC/T 202-2006)方法进行检测, 检测结果见表10。

表10多酚化合物的检测结果

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (1)

1.一种检测雪茄烟中多酚化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，雪茄烟样品的处理；

步骤2，配制标准溶液；

步骤3，对样品进行高效液相色谱法测定；利用高效液相色谱仪对标准工作溶液和样品萃取溶液进行检测，分析条件为色谱柱：使用Agilent Luna 3u PFP（2）色谱柱，150mm×4.6mm ，填料粒度3μm，柱温：30℃；流动相A：水：甲醇：乙酸体积分数为88:10:2；流动相B：水：甲醇：乙酸体积分数为10：88：2；柱流量：0.8mL/min；进样体积：10μL；检测器：紫外检测器;紫外检测器波长为:340nm 参比波长:480nm，梯度：二元溶剂流动相梯度如下：

；

所述步骤1中，首先配制萃取溶液：按水：甲醇：乙酸体积分数为10：88：2配制成萃取溶液，混匀；

称取1g样品，准确至0.1 mg，置于25 mL锥形瓶内，再准确加入10 mL 萃取溶液，置于超声波振荡器超声提取20 min；取适量萃取溶液经0.45 µm的水相滤膜过滤后，转移至2 mL色谱瓶中，进行HPLC分析；

所述步骤2具体为：分别称量5 mg新绿原酸、100 mg绿原酸、5 mg隐绿原酸、5 mg莨菪亭、100 mg芸香苷，准确至0.1 mg，加入30 ml甲醇完全溶解后，转移到100 mL的容量瓶中，加萃取溶液稀释至刻度，配制成一级标准溶液，此溶液密封于4℃存放，有效期为一年；然后各取10 mL一级标准溶液移至100mL容量瓶中用萃取溶液稀释至刻度，此为二级标准溶液，密封于4℃存放，有效期为3个月；然后分别准确移取1 mL、2 mL、5 mL二级标准溶液，1 mL、2mL、5 mL一级标准溶液至100 mL容量瓶中用萃取溶液稀释至刻度，此六个标准溶液以及二级标准溶液作为系列标准校准溶液；在4℃冰箱内存放，有效期为3个月；

所述步骤3中，采用高效液相色谱仪测定绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莨菪亭、芸香苷的标准系列工作曲线溶液，得到5种化合物的积分峰面积，分别用5种化合物的积分面积作为纵坐标，各化合物的浓度作为横坐标，建立5种化合物的校正曲线；对校正数据进行线性回归，R²应不小于0.99；各化合物的标准工作曲线及检测限如下：

。

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