CN111721865A - 同时测定烟草中14种多酚类化合物的hplc-dad分段检测方法 - Google Patents

同时测定烟草中14种多酚类化合物的hplc-dad分段检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于烟草化学成分分析技术领域，具体涉及一种同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC‑DAD分段检测方法。该方法以磷酸二氢钾水溶液和甲醇为流动相，按照特定的比例进行梯度洗脱，可以同时测定烟草中14种多酚类化合物，进一步限定分段波长，可以显著提高多酚类化合物的信号强度，灵敏度高，且目标峰峰型较好，分离度高，有利于烟草中低含量多酚类化合物的测定，有助于减少其他杂质的干扰；并且经方法学考察证明，本发明方法具有较高的精密度，重现性好、准确度高，可用于烟草质量控制、感官特性分析中。

Description

同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法
技术领域
本发明属于烟草化学成分分析技术领域。更具体地，涉及同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法。
背景技术
多酚是烟草中的一类重要化合物，在烟草中的含量可高达5％，对烟草的生长发育、调制特性、烟叶色泽、烟气香吃味和烟气生理强度等方面起着重要作用。例如，绿原酸是咖啡酸与奎尼酸的二缩酯，本身具有弱的青香，在多酚氧化酶的作用下形成多醌，与氨基酸发生非酶棕色化反应，生成吡嗪、吡啶、吡咯类物质等，这些物质具有坚果香、烘烤香或面包香，是烟草的特征香味物质。另外的，卷烟烟气中的简单酚，如儿茶酚、对苯二酚等二羟基苯化合物，对卷烟烟气有害成分释放量也有显著影响。由于烟草中的多酚类化合物具有的多种特性，可以将其作为有效的标识化合物进行相关研究，如烟叶陈化、品质研究等。鉴于多酚在衡量烟草品质、指导卷烟配方等方面的重要作用，有必要建立一种针对烟草多酚的准确、方便的定性定量分析方法。
目前针对烟草中多酚类化合物的检测主要为高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-TQMS)技术。如中国专利申请CN104777256A公开了一种同时测定烤烟中6中多酚含量的分析方法，该方法将烤烟烟叶用甲醇萃取后，在342nm波长处，以冰乙酸水溶液和冰乙酸甲醇溶液作为流动相，以梯度洗脱的方式用超高效液相色谱同时测定了烤烟中6种多酚的含量；刘萍萍等也公开了高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟叶中10中多酚类化合物，该方法加个烟叶用乙醇溶液提取后，加入内标伞形花内酯，以0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸甲醇溶液作为流动相，以梯度洗脱的方式用HPLC-TQMS同时测定了烟叶中10种多酚的含量(刘萍萍，卢紫舒，罗朝鹏,等.高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟叶中10种多酚类化合物[J].烟草科技，2019(6).)。但是上述两种方法都只能同时检测10种左右的多酚类化合物，而烟草中含量较低的七叶亭、对香豆酸、阿魏酸、7-羟基香豆素、槲皮苷等目前还没有方法可以同时检出，且所采用的甲酸、冰乙酸等酸性物质添加至流动相，pH处于较低水平，长期使用会缩短色谱柱或仪器的使用寿命；另外，采用HPLC-TQMS技术测定时，需加入较为昂贵的内标物质提高准确度，成本显著提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有烟草多酚检测技术仅能同时检测10种左右的多酚类化合物，检测不到质量分数较低的其它多酚类化合物，采用的流动相会缩短色谱柱或仪器的使用寿命等缺陷和不足，提供一种灵敏度、精密度、准确性高，可以同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法。
本发明的目的是提供一种同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法，包括以下步骤：
S1、烟草待测样品处理：将烟草粉碎后用甲醇溶液超声提取，过滤，得烟草待测样品；
S2、混合标准溶液制备：将14种多酚类化合物的标准品用甲醇溶液溶解并定容为10～2400μg/mL的混合标准母液，再分别稀释为10～200倍，得系列标准溶液；
S3、HPLC-DAD分段检测：检测器：二极管阵列检测器；波长：288～374nm，参比波长：413～467nm；色谱柱：C18色谱柱；流动相：A相为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液，B相为甲醇，在柱温16～20℃条件下，以0.16mL/min进行梯度洗脱，测定步骤S1、S2所得烟草待测样品和系列标准溶液；
其中，步骤S3中，所述梯度洗脱的条件为：
0～10min，流动相B为3～38％；10～25min，流动相B为38～47％；25～28min，流动相B为47～47.8％；28～47min，流动相B为47.8～80％；47～50min，流动相B为80～3％；50～66min，流动相B为3％。
进一步地，步骤S3中，所述波长和参比波长采用分段设置：
0～19.1min：波长322～326nm，参比波长522～526nm；
19.1～21.3min：波长324～328nm，参比波长423～427nm；
21.3～24.0min：波长318～322nm，参比波长423～427nm；
24.0～25.6min：波长346～350nm，参比波长432～437nm；
25.6～29.6min：波长288～292nm，参比波长413～417nm；
29.6～34.0min：波长342～346nm，参比波长423～427nm；
34.0～40.0min：波长354～358nm，参比波长453～457nm；
40.0～45.0min：波长348～352nm，参比波长458～462nm；
45.0～66.0min：波长370～374nm，参比波长463～467nm。
优选地，步骤S3中，所述波长和参比波长采用分段设置：
0～19.1min：波长324nm，参比波长524nm；
19.1～21.3min：波长326nm，参比波长425nm；
21.3～24.0min：波长320nm，参比波长425nm；
24.0～25.6min：波长348nm，参比波长435nm；
25.6～29.6min：波长290nm，参比波长415nm；
29.6～34.0min：波长344nm，参比波长425nm；
34.0～40.0min：波长356nm，参比波长455nm；
40.0～45.0min：波长350nm，参比波长460nm；
45.0～66.0min：波长372nm，参比波长465nm。
进一步地，步骤S3中，所述波长的带宽为4～8nm，所述参比波长的带宽为40～60nm。
优选地，步骤S3中，所述柱温为16～18℃。发明人在实践中发现，当柱温高于20℃时，色谱峰的分离效果不太好；但温度过低时，容易析出晶体堵塞色谱柱造成漏液。更优选地，步骤S3中，所述柱温为16～18℃。
进一步地，所述14种多酚类化合物为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、七叶亭、对香豆酸、阿魏酸、槲皮苷、7-羟基香豆素和槲皮素。具体信息参见表1。
表1烟草中14种多酚类化合物信息
Figure BDA0002541848500000031
Figure BDA0002541848500000041
Figure BDA0002541848500000051
更进一步地，所述混合标准母液中，各标准品的浓度为：新绿原酸120～360μg/mL、绿原酸800～2400μg/mL、隐绿原酸180～540μg/mL、东莨菪苷100～300μg/mL、咖啡酸20～60μg/mL、莨菪亭30～100μg/mL、芦丁450～1350μg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷20～60μg/mL、七叶亭10～30μg/mL、对香豆酸10～30μg/mL、阿魏酸10～30μg/mL、槲皮苷10～30μg/mL、7-羟基香豆素10～30μg/mL和槲皮素10～30μg/mL。
优选地，步骤S3中，所述C18色谱柱为Agilent SB-C18柱，规格为1.8μm，3.0×150mm。
进一步地，步骤S3中，所述烟草待测样品或系列标准溶液的进样量为5～10μL。
更进一步地，步骤S1中，所述烟草待测样品处理的具体步骤为：
将烟草粉碎后用质量体积比为1:(2～10)g/mL的甲醇溶液超声30～50min提取，过滤，得烟草待测样品。
进一步地，步骤S1、S2中，所述甲醇溶液为50～60vol％甲醇水溶液。实践中发现，甲醇比例从30％增加到40％时，多酚类化合物提取效率显著提高；当甲醇比例增至50％～60％时，提取效果最佳；当甲醇比例增至70％以后，提取效率逐渐下降。
本发明具有以下有益效果：
本发明首创性地提供了一种同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-D AD分段检测方法，以磷酸二氢钾水溶液和甲醇为流动相，按照特定的比例进行梯度洗脱，可以同时测定烟草中14种多酚类化合物，洗脱过程中进一步限定分段波长，可以显著提高多酚类化合物的信号强度，灵敏度高，且目标峰峰型较好，分离度高，有利于烟草中低含量多酚类化合物的测定，有助于减少其他杂质的干扰；并且经方法学考察证明，本发明方法具有较高的精密度，重现性好、准确度高，可用于烟草质量控制、感官特性分析中。
附图说明
图1为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和东莨菪苷在190nm～550nm波长范围内的紫外吸收光谱图。
图2为咖啡酸、七叶亭、对豆香酸和阿魏酸在190nm～550nm波长范围内的紫外吸收光谱图。
图3为莨菪亭、7-羟基香豆素、芦丁和槲皮苷在190nm～550nm波长范围内的紫外吸收光谱图。
图4为山奈酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素在190nm～550nm波长范围内的紫外吸收光谱图。
图5为标准溶液在328nm波长检测条件下得到的高效液相色谱图。
图6为标准溶液在340nm波长检测条件下得到的高效液相色谱图。
图7为标准溶液在分段波长检测条件下得到的高效液相色谱图。
图8为提取溶剂甲醇与水的比例对多酚提取结果的影响统计图。
图9为烟草样品3检测得到的高效液相色谱图；其中，1：新绿原酸；2：绿原酸；3：隐绿原酸；4：东莨菪苷；5：咖啡酸；6：七叶亭；7：对香豆酸；8：阿魏酸；9：莨菪亭；10：7-羟基香豆素；11：芦丁；12：槲皮苷；13：山奈酚-3-O-芸香糖苷；14：槲皮素。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明所用标准品新绿原酸、隐绿原酸购自德国Phytolab公司；绿原酸、咖啡酸、七叶亭、对香豆酸、莨菪亭、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷购自美国Sigma-Aldrich公司；东莨菪苷购自美国International Laboratory公司；阿魏酸购自加拿大TRC公司；7-羟基香豆素购自美国ChemService公司；芦丁购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；槲皮素购自德国HWIAnalytik GMBH公司。除非特别说明，其余实施例所用试剂和材料均为市购。
其中，本发明所用混合标准母液：准确称量约12mg新绿原酸、80mg绿原酸、18mg隐绿原酸、10mg东莨菪苷、2mg咖啡酸、3.3mg莨菪亭、45mg芦丁、2mg山奈酚-3-O-芸香糖苷、1mg七叶亭、1mg对香豆酸、1mg阿魏酸、1mg槲皮苷、1mg 7-羟基香豆素和1mg槲皮素，置于50mL棕色容量瓶中，加入50％甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得。
系列标准溶液：分别准确移取50μL、100μL、200μL、400μL、800μL的混合标准母液至10mL棕色容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，作为系列标准溶液。
实施例1色谱条件的优化
1.1流动相的选择
由于多酚类化合物化学性质较活泼，酚羟基易氧化和电离。在甲醇-水作为流动相的环境下，多酚作为一种弱电解质会发生电离，在固定相表面有双重保留机制，酚酸类化合物难以获得很好的分离，而且峰拖尾严重，导致分离效果差。实践中也证实，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸在流动相不加入适当添加剂的情况下色谱峰脱尾严重。
在其它色谱条件相同的情况下，分别采用流动相体系I(流动相A：93％水+4.5％甲醇+2.5％乙酸；流动相B：10％水+88％甲醇+2％乙酸)和流动相体系II(流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液；流动相B：甲醇)对系列标准溶液的中间浓度标准溶液进行测定。
结果发现：
使用流动相体系II时，磷酸二氢钾的浓度较低，对色谱柱的使用寿命影响较小；检测得到的最大峰宽的色谱峰是新绿原酸的，峰宽为0.1186min，并且，绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和东莨菪苷四种化合物的分离度要明显大于使用流动相体系I时的色谱。
使用流动相体系I时，由于2％左右的醋酸浓度使流动相pH值为2左右，会在一定程度上缩短色谱柱的使用寿命，且检测得到的隐绿原酸色谱峰峰宽是最大的，为0.4046min，在隐绿原酸色谱峰之前出峰的4个多酚类化合物峰宽分别为0.1618min、0.3233min、0.2724min和0.3525min，均大于使用流动相体系II时相应化合物的峰宽，其余化合物峰宽在两种流动相体系相当。
综上所述，为了获得较佳的检测灵敏、色谱分离度和较长的色谱柱使用寿命，流动相体系II作为优选。
1.2柱温的选择
在其它色谱条件相同的情况下，采用不同柱温(10～45℃)对系列标准溶液的中间浓度标准溶液进行测定。
结果发现：
当柱温介于20～35℃之间时，阿魏酸与莨菪亭、7-羟基香豆素与芦丁的分离效果始终不太理想；当柱温升至45℃时，阿魏酸与莨菪亭、7-羟基香豆素与芦丁实现了基线分离，但绿原酸出峰位置多出了一个分裂峰，应该是由于温度太高导致绿原酸发生反应产生其他物质所致。经大量的创造性劳动发现，当柱温为16℃左右时，分离效果等均较好。
1.3检测波长的选择
用二极管阵列检测器在190nm～550nm波长范围内对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、七叶亭、对香豆酸、阿魏酸、槲皮苷、7-羟基香豆素和槲皮素进行全扫，得图1～4多酚标准品单标在190nm～550nm波长范围内的紫外吸收光谱图。
由图可以看出，不同多酚类化合物的最大吸收波长存在较大差异，从290nm(对香豆酸)～372nm(槲皮素)不等。以现有技术中选择的328nm、340nm等单一检测波长对系列标准溶液的中间浓度标准溶液进行测定，得图5～6，可见，有一些目标物的在选定的波长处没有响应或响应很弱，导致检测灵敏度显著降低。
为了获得较好的检测灵敏度，以及减少其他物质的干扰，本发明结合14种多酚类化合物的最大吸收波长和保留时间，设置了分段波长检测的方法，所述分段波长为：
0～19.1min：波长324nm，参比波长524nm；
19.1～21.3min：波长326nm，参比波长425nm；
21.3～24.0min：波长320nm，参比波长425nm；
24.0～25.6min：波长348nm，参比波长435nm；
25.6～29.6min：波长290nm，参比波长415nm；
29.6～34.0min：波长344nm，参比波长425nm；
34.0～40.0min：波长356nm，参比波长455nm；
40.0～45.0min：波长350nm，参比波长460nm；
45.0～66.0min：波长372nm，参比波长465nm；
所述波长的带宽为8nm，所述参比波长的带宽为50nm。
用分段波长检测方法对系列标准溶液的中间浓度标准溶液进行测定，得图7，由图可见，采用分段波长检测方法得到的色谱图中，14中多酚类化合物分离良好，与328nm和340nm检测波长相比，得到的多酚类化合物的信号峰明显增强，响应值更高。
1.4最优色谱条件
检测器：二极管阵列检测器；波长：分段波长；色谱柱：Agilent SB-C18柱(1.8μm，3.0×150mm)；流动相：A相为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液，B相为甲醇，在柱温16℃条件下，以0.16mL/min进行梯度洗脱，测定烟草待测样品和系列标准溶液，进样量为5μL；
其中，所述分段波长为：
0～19.1min：波长324nm，参比波长524nm；
19.1～21.3min：波长326nm，参比波长425nm；
21.3～24.0min：波长320nm，参比波长425nm；
24.0～25.6min：波长348nm，参比波长435nm；
25.6～29.6min：波长290nm，参比波长415nm；
29.6～34.0min：波长344nm，参比波长425nm；
34.0～40.0min：波长356nm，参比波长455nm；
40.0～45.0min：波长350nm，参比波长460nm；
45.0～66.0min：波长372nm，参比波长465nm；
所述波长的带宽为8nm，所述参比波长的带宽为50nm；
所述梯度洗脱的条件为：
0～10min，流动相B为3～38％；10～25min，流动相B为38～47％；25～28min，流动相B为47～47.8％；28～47min，流动相B为47.8～80％；47～50min，流动相B为80～3％；50～66min，流动相B为3％。
实施例2提取条件的选择
2.1溶剂比例和提取时间的选择
将0.02g烟草粉碎后(精确至0.0001g)，置于10mL具塞玻璃管瓶中，分别加入5mL浓度为30～100vol％甲醇溶液超声10～50min提取，取上清液过0.22μm水相滤膜，得烟草待测样品，用1.4最优色谱条件进行检测。
结果参见图8，图中为烟草中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷8种含量较高的多酚类化合物在不同甲醇/水比例下的提取效果，其他6种多酚含量低，在图中显示接近一条直线，因此未在图中展示。由图8可见，甲醇比例从30％增加到40％时，多酚类化合物提取效率显著提高；当甲醇比例增至50％～60％时，提取效果最佳；当甲醇比例增至70％以后，提取效率逐渐下降。
对提取时间的考察发现，超声时间到达30min后，提取得到的多酚类化合物含量均趋于稳定，杂质峰较少，且与目标物能较好地分离。
2.2最优提取条件
将烟草粉碎后用质量体积比为1:5g/mL的50～60vol％甲醇溶液超声30min提取，过滤，得烟草待测样品。
实施例3方法学考察
3.1线性范围、检测限、定量限测定
用1.4最优色谱条件对系列标准溶液进行测定，对目标化合物的色谱峰面积与浓度进行线性回归分析，得到回归方程及其相关参数将最低浓度的标准溶液平行测定13次，以所得测定结果标准偏差的3倍为方法的检测限，以所得测定结果标准偏差的10倍为方法的定量限，结果参见表2。
表2线性关系、检测限、定量限测定结果
Figure BDA0002541848500000111
注：回归方程的相关系数R2＝0.99976～0.99997。
由表2可见，在测试范围内，目标物响应与其浓度相关系数为0.99976～0.99997，线性关系良好；检出限较低，为0.01～0.05μg/mL；定量限为0.03～0.50μg/mL。
3.2精密度、加标回收率、重复性测定
用1.4最优色谱条件对系列标准溶液中同一样品进行5次平行测定，计算结果的标准偏差；对某烟草样品添加14中多酚类化合物的标准品，每个水平重复测定3次，计算方法的回收率；日内重复性：同一天内系列标准溶液中同一样品平行测定5次，计算方法相对标准偏差；日间重复性：连续5天对系列标准溶液中同一样品进行平行测定，计算方法相对标准偏差，结果参见表3。
表3精密度、加标回收率、重复性测定结果
Figure BDA0002541848500000121
由表3可见，本发明方法的精密度为0.7～3.6％，加标回收率在95.2～109.1％之间，精密度、回收率和重复性均较好。
实施例4样品检测
分别称取6个市售的卷烟产品的烟草粉碎后0.02g(精确至0.0001g)，置于10mL具塞玻璃管瓶中，分别加入5mL浓度为50vol％甲醇溶液超声30min提取，取上清液过0.22μm水相滤膜，得烟草待测样品，用1.4最优色谱条件对烟草待测样品和系列标准溶液进行检测，计算得到6个样品中14种多酚类化合物的含量，参见表4，其中样品3的色谱图参见图9。
表4市售卷烟产品多酚含量测定结果(单位：μg/g)
化合物名称 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6
新绿原酸 1290.3 1628.9 1303.0 794.8 1216.0 1099.6
绿原酸 7156.1 9251.6 7120.5 3828.3 6772.2 6247.9
隐绿原酸 1883.4 2505.2 1954.1 1215.7 1821.1 1622.5
东莨菪苷 859.4 994.0 893.3 524.1 899.5 755.2
咖啡酸 181.5 248.6 174.6 103.3 197.7 165.1
七叶亭 11.5 29.3 10.2 17.5 30.1 32.0
对香豆酸 29.1 15.3 27.6 ND ND 38.2
阿魏酸 37.6 ND 45.1 ND 25.4 ND
莨菪亭 280.4 265.4 358.4 233.8 333.7 315.1
7-羟基香豆素 20.0 42.6 16.3 ND 23.4 25.7
芦丁 4776.1 6412.6 5431.9 2825.9 4938.7 4928.0
槲皮苷 ND 37.5 19.4 22.4 ND 37.9
山奈酚-3-o-芸香糖苷 363.1 525.7 449.7 295.3 359.7 390.9
槲皮素 46.2 96.5 31.5 64.3 44.2 36.0
注：ND：not detected。
由表4可见，检测得到的14种多酚类化合物含量差异较大，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷是烟草中含量较高的8种多酚类化合物，槲皮素、七叶亭、对香豆酸、阿魏酸、7-羟基香豆素和槲皮苷在烟草中的含量较低。若为探明多酚化合物与感官风格品质的关系，则需要在本文建立的方法基础上，进行大量的样品测试和进一步数据分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.同时测定烟草中14种多酚类化合物的HPLC-DAD分段检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、烟草待测样品处理：将烟草粉碎后用甲醇溶液超声提取，过滤，得烟草待测样品；
S2、混合标准溶液制备：将14种多酚类化合物的标准品用甲醇溶液溶解并定容为10～2400μg/mL的混合标准母液，再分别稀释为10～200倍，得系列标准溶液；
S3、HPLC-DAD分段检测：检测器：二极管阵列检测器；波长：288～374nm，参比波长：413～467nm；色谱柱：C18色谱柱；流动相：A相为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液，B相为甲醇，在柱温16～20℃条件下，以0.16mL/min进行梯度洗脱，测定步骤S1、S2所得烟草待测样品和系列标准溶液；
其中，步骤S3中，所述梯度洗脱的条件为：
0～10min，流动相B为3～38％；10～25min，流动相B为38～47％；25～28min，流动相B为47～47.8％；28～47min，流动相B为47.8～80％；47～50min，流动相B为80～3％；50～66min，流动相B为3％。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述波长和参比波长采用分段设置：
0～19.1min：波长322～326nm，参比波长522～526nm；
19.1～21.3min：波长324～328nm，参比波长423～427nm；
21.3～24.0min：波长318～322nm，参比波长423～427nm；
24.0～25.6min：波长346～350nm，参比波长432～437nm；
25.6～29.6min：波长288～292nm，参比波长413～417nm；
29.6～34.0min：波长342～346nm，参比波长423～427nm；
34.0～40.0min：波长354～358nm，参比波长453～457nm；
40.0～45.0min：波长348～352nm，参比波长458～462nm；
45.0～66.0min：波长370～374nm，参比波长463～467nm。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述波长和参比波长采用分段设置：
0～19.1min：波长324nm，参比波长524nm；
19.1～21.3min：波长326nm，参比波长425nm；
21.3～24.0min：波长320nm，参比波长425nm；
24.0～25.6min：波长348nm，参比波长435nm；
25.6～29.6min：波长290nm，参比波长415nm；
29.6～34.0min：波长344nm，参比波长425nm；
34.0～40.0min：波长356nm，参比波长455nm；
40.0～45.0min：波长350nm，参比波长460nm；
45.0～66.0min：波长372nm，参比波长465nm。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述波长的带宽为4～8nm，所述参比波长的带宽为40～60nm。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述14种多酚类化合物为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪苷、咖啡酸、莨菪亭、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、七叶亭、对香豆酸、阿魏酸、槲皮苷、7-羟基香豆素和槲皮素。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述混合标准母液中，各标准品的浓度为：新绿原酸120～360μg/mL、绿原酸800～2400μg/mL、隐绿原酸180～540μg/mL、东莨菪苷100～300μg/mL、咖啡酸20～60μg/mL、莨菪亭30～100μg/mL、芦丁450～1350μg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷20～60μg/mL、七叶亭10～30μg/mL、对香豆酸10～30μg/mL、阿魏酸10～30μg/mL、槲皮苷10～30μg/mL、7-羟基香豆素10～30μg/mL和槲皮素10～30μg/mL。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述C18色谱柱为Agilent SB-C18柱，规格为1.8μm，3.0×150mm。
8.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述烟草待测样品或系列标准溶液的进样量为5～10μL。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述烟草待测样品处理的具体步骤为：
将烟草粉碎后用质量体积比为1:(2～10)g/mL的甲醇溶液超声30～50min提取，过滤，得烟草待测样品。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1、S2中，所述甲醇溶液为50～60vol％甲醇水溶液。
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