CN106645442B

CN106645442B - 烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的uplc-ms/ms检测方法

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Publication number: CN106645442B
Application number: CN201610847044.7A
Authority: CN
Inventors: 付淑军; 石小娜; 王鹏
Original assignee: Integrated Testing Technology (tianjin) Co Ltd
Current assignee: Integrated Testing Technology (tianjin) Co Ltd
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: CN106645442A

Abstract

本发明提供烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC‑MS/MS检测方法：包括以下步骤：（1）样品处理：称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3‑5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。取烟叶样品提取液5μL进样UPLC‑MS/MS分析，或样品稀释100倍摇匀后取5μL进样UPLC‑MS/MS分析；（2）按照一定条件进行UPLC‑MS/MS检测；（3）根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的浓度。本发明的有益效果是UPLC‑MS/MS检测方法检测烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合对烟草中生物碱类物质进行分析，以探索这些对人体的影响及质量控制。

Description

烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法

技术领域

本发明属于生物分析领域，尤其是涉及一种烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法。

背景技术

烟草中的生物碱主要以有机酸盐和无机酸盐的形式存在,主要有烟碱、降烟碱和新烟碱等。烟碱(又名尼古丁,nicotine)是烟草中生物碱的主要成分,在烟草中的含量一般为1％～2％,占烟草生物碱的95％,是导致人吸烟上瘾的主要因子。其化学名称为1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷[1～2]。烟碱也是烟气中最主要的生物碱,是主流烟气中具有毒性的粒相成分,中等剂量的烟碱能使人呼吸加快、血管舒张和呕吐明显加剧,稍高剂量的烟碱可引起震颤和痉挛。烟碱固然有害,但也有某些益处,如可使人得到安慰和快感,解除焦虑,调节情绪,平息激动和烦燥,增强记忆和技巧,降低肥胖的食欲,在脑内可模拟乙酰胆碱的作用,从而减轻帕金森综合症和老年性痴呆症等。因此,烟碱是评价烟叶品质的主要指标,也是衡量烟气质量的主要指标。

烟碱及其代谢物含量的高低不仅影响烟叶、烟制品和相关产品(如烟草香料、农药等)的质量,还关系到人体健康。所以,很多研究者不仅对烟草、卷烟、总粒相物和农药中的烟碱进行测定,而且还对唾液、头发、血液、尿、空气等中的烟碱及其代谢物的含量进行分析,以探索烟碱对人体的影响。

N-亚硝基降烟碱(NNN)，NNN是发现最早的一个烟草特有亚硝胺，并且在1977年报道了烤烟品Coker139中的NNN的平均含量为1.31mg/kg。烟草特有亚硝胺有致癌性，N-亚硝基降烟碱NNN致癌性最为强烈。所以对烟草中NNN的检测尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、检测效率高、成本低的烟碱、降烟碱和亚硝基降碱浓度检测方法，尤其适合对烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的检测。

本发明的技术方案是：

烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法：

(1)样品处理：

称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。

样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，此时由于烟碱成分含量高，测定时，在烟碱出峰时间段不进行质谱采集。

样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5

μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于烟碱含量测定。

(2)HPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析

检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：

流动相：A:水，用氨水调pH至11.0 B:甲醇

流速：0.3ml/min 进样量：5μL

柱温：45℃

色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18,1.7μm,2.1*50mm Column

表1.梯度洗脱程序

Time/min	A％	B％
			0	95	5
3.5	10	90
			4.0	10	90
4.01	95	5
			6	95	5

表2.质谱条件

其他质谱参数：

毛细管电压:3.2kV；源温度:120℃；

脱溶剂气温度:350℃；脱溶剂气流量:800L/Hr；

气帘气流量:50L/Hr；驻留时间：0.1s

(3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的浓度。

为了取得更好的技术效果，制作标准曲线时所用标准溶液的制备：

烟碱系列溶液配制：将烟碱标准品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的标准品母液，用稀释液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。

混合标准品母液配制：取降烟碱和亚硝基降烟碱的母液，用稀释液配制成100μg/mL的混合标准品母液，用稀释液(甲醇/水＝1/1，V/V)配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。

步骤(1)中样品的处理方法：称取烟叶样品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超声30min，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。

表3 三化合物定量检测线性与范围

本发明具有的优点和积极效果是：UPLC-MS/MS检测方法检测烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合对烟草中生物碱类物质进行分析，以探索这些物质对人体的影响及质量控制。

附图说明

图1是空白溶剂色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱，烟碱、降烟碱的色谱图。

图2是2ng/ml的三化合物混合标准溶液色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱(RT＝1.71min)，烟碱(RT＝2.54min)、降烟碱(RT＝2.07min)的色谱图。

图3是26号样品(不采集烟碱质谱信息)色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱(RT＝1.72min)，烟碱(RT＝2.54min)，降烟碱(RT＝2.07min)的色谱图。

图4是26号样品(稀释100倍)色谱图，由上至下分别为亚硝基降烟碱(RT＝1.72min)，烟碱(RT＝2.54min)、降烟碱(RT＝2.07min)的色谱图。

具体实施方式

实施例1

从市场购买7种样烟叶作为检测样品，对其进行编号分别为1号，2号，3号，26号，3-17号，A2-2号，W1号，按照发明内容中的方法对其进行检测，即：称取烟叶样品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超声30min，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。

样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC-MS/MS分析，用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5μL进样UPLC-MS/MS分析，用于烟碱含量测定。

在样品进样分析前，标准曲线制备时需要先扣除空白溶剂的量，空白溶剂色谱图见图1。每种物质扣除空白溶剂后得标准曲线，见表3。然后将2ng/ml的标准品混合，进样分析，三种化合物混合标准品进样分析色谱图见图2。

7种样品进样分析后结果见表4。

图3为其中26号样品的样品不稀释的色谱图，此图中，亚硝基降烟碱(RT＝1.72min)，降烟碱(RT＝2.07min)，图4为26号样品稀释100倍的色谱图，此图中烟碱的RT＝2.54min。

表4烟叶样品中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定结果

ND表示为：未检测到

实施例2

2.1定量限检测

对烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱的定量限和检测限是根据信噪比法来确定的。把已知浓度的贮备液稀释至低浓度的试样，测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较，算出可能被可靠的检测出的最低浓度或百分比。要求：定量限信噪比不低于10，测定6次峰保留时间的相对标准差应不大于2.0％，峰面积的相对标准差应不大于10.0％。

定量限试验：取烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱适量，精密称定，分别用乙腈/水＝1/1，V/V，甲醇/水＝1/1，V/V稀释制成每1ml中含烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱0.5ng的溶液，精密量取该溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，平行测定6次。结果表5。

表5定量限试验结果

结论

定量限试验：重复测定6次，烟碱保留时间RSD为0.301％，峰面积的RSD为9.00％；降烟碱保留时间RSD为0.241％，峰面积的RSD为4.82％；亚硝基降烟碱保留时间RSD为0.336％，峰面积的RSD为4.74％；符合验证方案要求(峰保留时间RSD不得大于2.0％；峰面积RSD不得大于10.0％)；

2.2系统精密度试验

通过配制一个浓度的对照品溶液，对照品溶液重复进样6针，6次测定结果要具有良好的重复性；对照品溶液6次测定结果的峰面积的RSD不得过5.0％，保留时间的RSD不得过2.0％，来证实系统具有良好的精密度。

具体操作：取线性系列溶液中100％的溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次。分别计算各峰面积和保留时间的RSD。

测试结果

表6对照品溶液精密度试验测定结果

结论

烟碱对照品溶液重复6次的峰面积及保留时间的RSD分别为0.792％、0.186％；降烟碱对照品溶液重复6次的峰面积及保留时间的RSD分别为0.480％、0.227％；亚硝基降烟碱对照品溶液重复6次的峰面积及保留时间的RSD分别为0.434％、0.527％；说明系统精密度良好，符合方法学验证要求。

2.3线性试验

用稀释液配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱系列标准溶液进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)为纵坐标(y)，以各被分析物浓度为横坐标(x)，进行线性回归分析。要求回归方程的相关系数r的值不得小于0.990。具体操作

稀释液：乙腈/水＝1/1，V/V，甲醇/水＝1/1，V/V；

烟碱系列溶液配制：将烟碱标准品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的标准品母液，用稀释液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。注：配制烟碱标准曲线切记不可用甲醇/水＝1/1

结果详见表7、8。

表7线性试验结果

表8相关系数考察试验结果

参数	烟碱	降烟碱	亚硝基降烟碱
				浓度范围	0.5-500ng/mL	0.5-500ng/mL	0.5-500ng/mL
回归方程	y＝0.0026452x-0.00621152	y＝0.00178715x+0.00340516	y＝0.00311964x-0.0114075
				相关系数(r)	r＝0.9952	r＝0.9983	r＝0.9998

结论：烟碱、降烟碱及亚硝基降烟碱在0.5～500ng/ml的浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数r≥0.9952。

2.4回收试验

准确度是通过在供试品中加入指标的70％，100％，130％三个不同浓度各杂质对照品测得的回收率所得。加入已知量的分析物对照品，再测定加样样品中各化合物的测定结果和理论值之间的比值(回收率)，以百分率％表示，要求每个浓度平均回收率在80.0％～115.0％之间，RSD不高于10％，以证实方法具有良好的准确度。

具体操作

烟碱系列溶液配制：将烟碱标准品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的标准品母液，用稀释液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成浓度为2000ng/mL的工作储备溶液。

混合标准品母液配制：取降烟碱和亚硝基降烟碱的母液，用稀释液配制成100g/mL的混合标准品母液，用稀释液(甲醇/水＝1/1，V/V)2000ng/mL的工作储备溶液。

称取烟叶样品粉末约20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇，超声30min，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液(浓度未知)。

精密量取烟碱及混合标准的工作储备溶液各1ml，置于10ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，得到每1ml约含200ng的混合溶液，作为对照溶液。

精密量取供试品储备溶液1ml，置于10ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，作为样品溶液。

精密量取混合的工作储备溶液1ml，置于10ml量瓶中，精密量取供试品储备溶液1ml加入此量瓶，用甲醇稀释至刻度，得到加标100％的回收率样品溶液。同法制备加标70％和130％的回收率样品溶液，其中加标100％的样品平行制备6份，同时考察重复性，其它两个浓度水平平行制备三份样品。分别取上述溶液10μl注入液相色谱仪，以测得量/添加量×100％计算回收率。

测试结果

结果详见表9。

表9回收率测试结果

结论

烟碱的回收率在94.2％～103％之间，RSD为3.26％；降烟碱的回收率在95.8％～104％之间，RSD为2.48％；亚硝基降烟碱的回收率在93.5％～102％之间，RSD为3.73％。符合验证方案要求，说明本方法准确度高。

2.5重复性试验

重复性试验是通过配制6个100％加样溶液，100％加样溶液每个溶液进样1针，100％加样溶液6次测得的测得量的RSD不得过5.0％，来证实方法具有良好的重复性。

具体操作

精密量取回收试验100％加样溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，照上述方法重复测定6次。结果表10。

测试结果

表10加样溶液重复性试验测定结果

结论

加样溶液6次烟碱测得量的RSD为4.08％、降烟碱测得量的RSD为4.22％、亚硝基降烟碱测得量的RSD为4.43％、，符合验证方案要求，说明本方法重复性好。

2.6溶液稳定性试验

考察100％加样溶液随时间的变化规律。100％加样溶液室温放置在0、0.5、2、4小时后考察杂质峰面积的变化情况，要求：化合物的峰面积RSD应不大于10.0％。若符合验证方案要求，则说明对照品溶液在该时间段内放置是稳定的，为以后检测时测试溶液放置时间的期限提供依据。

具体操作

分别取烟碱、降烟碱、亚硝基降烟碱及样品适量，精密称定，用甲醇稀释制成每1ml中分别含烟碱、降烟碱、亚硝基降烟碱20ng的溶液，作为100％加样溶液。

分别于0、0.5、2、4小时，精密量取100％加样溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表11。

试验结果

结论

本品100％加样溶液在4h内稳定。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法：其特征在于：包括以下步骤：

(1)样品处理：

称取烟叶样品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml进行提取，超声，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液；

样品不稀释：取烟叶样品提取液5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于降烟碱和亚硝基降烟碱含量测定，此时由于烟碱成分含量高，测定时，在烟碱出峰时间段不进行质谱采集；

样品稀释100倍：取烟叶样品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀后取5μL进样UPLC-MS/MS分析，主要用于烟碱含量测定；

检测条件为：三重四级杆液质联用仪，液相条件：

流动相：A:水，用氨水调pH至11.0 B:甲醇

流速：0.3ml/min 进样量：5μL

柱温：45℃

色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18,1.7μm,2.1*50mm Column

表1.梯度洗脱程序

Time/min A％ B％ 0 95 5 3.5 10 90 4.0 10 90 4.01 95 5 6 95 5

表2.质谱条件

其他质谱参数：

毛细管电压:3.2kV；源温度:120℃；

脱溶剂气温度:350℃；脱溶剂气流量:800L/Hr；

气帘气流量:50L/Hr；驻留时间：0.1s

2.根据权利要求1所述的烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：称取烟叶样品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超声30min，再用甲醇定容至刻度，摇匀后取上清液过膜，得烟叶样品提取液。

3.根据权利要求1所述的烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：步骤(3)所述标准曲线制作时选用的标准溶液为：

烟碱系列溶液配制：将烟碱标准品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的标准品母液，用稀释液乙腈/水＝1/1，V/V，配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。

混合标准品母液配制：取降烟碱和亚硝基降烟碱的母液，用稀释液配制成100μg/mL的混合标准品母液，用稀释液甲醇/水＝1/1，V/V，配制成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列标准溶液。

4.根据权利要求1所述的烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：该方法对烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的检测限均为0.1ng/ml。

5.根据权利要求1所述的烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：该方法对烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的定量限均为0.5ng/ml。

6.根据权利要求1所述的烟叶中烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：该方法对烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱的检测范围为0.5-500ng/ml。