CN109212042A - 一种采用液质联用法测定盐酸培唑帕尼基因毒性杂质的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明名称为一种采用液质联用法测定盐酸培唑帕尼基因毒性杂质的分析方法，属于药物分析技术领域。本发明采用高效液相色谱‑三重四极杆质谱联用仪为检测仪器，质谱检测采用电喷雾离子源和多反应监测模式，液相色谱采用碳十八色谱柱为固定相，以甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液为流动相，采取梯度洗脱方式。所建立的HPLC‑MS/MS方法能够同步、快速、准确地测定盐酸培唑帕尼中4种潜在基因毒性杂质，为其质量标准的制定提供了可靠依据。

Description

一种采用液质联用法测定盐酸培唑帕尼基因毒性杂质的分析 方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体公开了一种采用HPLC-MS/MS法测定盐酸培唑帕尼中4种基因毒性杂质的药物分析方法。

背景技术

盐酸培唑帕尼(pazopanib hydrochloride)由葛兰素史克公司率先开发，该化合物的口服制剂于2009年10月获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国的上市，商品名为Votrient，是第二代多靶点酪氨酸激酶抑制剂，对血管内皮生长因子受体、血小板源性生长因子受体等有明显的抑制作用，用于治疗晚期肾细胞癌、软组织肉瘤、晚期卵巢癌等疾病，是疗效显著的抗肿瘤激酶抑制剂。

基于临床疗效方面的优越性和市场需求，企业界对培唑帕尼的工艺优化、质量控制进行了不懈的深入探索，而作为产品质量控制的重要组成部分，基因毒性杂质的研究随着国内外药政部门相关法规的逐步健全，已成为影响产品获批上市的关键因素之一。根据原研企业葛兰素史克公司于2009年在期刊Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis上所发表的题为《Analytical control of genotoxic impurities in thepazopanib hydrochloride manufacturing process》的文献(以下简称“该文献”)，该公司依据“质量源于设计”的理念对培唑帕尼合成路线中潜在基因毒性杂质的传递规律、检测方法和控制限度进行了研究。依据FDA、EDQM及ICH的相关法规和毒理研究，原研公司将路线中的化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ及作为起始原料之一的DMS确定为基因毒性杂质，控制限度分别是：DMS、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ、化合物Ⅷ，均为1.7ppm，化合物Ⅵ为115ppm。

上述化合物除DMS由于结构特点须经衍生化另行检测外，该文献中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ均可直接采用液相色谱-质谱联用法进行测定。原研公司使用不同的离子源、扫描模式、色谱柱、流动相体系分别为化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ建立了4种等度洗脱的HPLC-MS方法，其缺点在于：(1)4种杂质无法实现同时检测，在使用同一台液质联用仪检测时，离子源与流动相的频繁更换降低了检测效率；(2)用一级质谱的准分子离子峰[M+H]⁺或[M-H]^-进行定量，不利于复杂基质干扰的排除和灵敏度的进一步提高。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种可同步检测盐酸培唑帕尼中上述4种基因毒性杂质的HPLC-MS/MS分析方法，本发明与该文献相比，重要区别特征及有益进步为：(1)液相色谱部分，采用甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液为流动相，以内径和长度均小于该文献方法的色谱柱为固定相，采用梯度洗脱方式，在13min内使化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ均可出峰并检测；(2)质谱检测器部分，统一采用电喷雾离子源(ESI)和多反应检测模式(MRM)，以二级质谱的碎片离子峰进行定量，进一步提高了杂质的灵敏度和专属性。

具体地，本发明的分析方法的内容如下：

(1)仪器：高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪

(2)质谱参数

扫描模式：多反应监测(MRM)

碰撞气压力(CAD)：4Psi～8Psi，优选5Psi～7Psi，更优选6Psi

雾化气压力(GS1)：45Psi～65Psi，优选50～60Psi，更优选55Psi

喷雾电压(IS)：4500V～6500V，优选5000V～6000V，更优选5500V

气帘气压力(CUR)：15Psi～25Psi，优选18Psi～22Psi，更优选20Psi

辅助气压力(GS2)：45Psi～65Psi，优选50～60Psi，更优选55Psi

离子源温度(TEM)：450℃～650℃，优选500℃～600℃，更优选500℃

检测离子与检测模式：

名称	检测模式	母离子(m/z)	子离子(m/z)
				化合物Ⅱ	正离子	192.2	146.2
化合物Ⅲ	正离子	162.2	147.2
				化合物Ⅵ	正离子	288.2	237.2
化合物Ⅷ	负离子	215.1	151.0

(3)色谱参数

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；色谱柱粒径为3.5μm；色谱柱长度为100mm；色谱柱内径为2.1mm。优选色谱型号为Waters Atlantis T3(2.1×100mm，3.5μm)。

流动相A：甲酸浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；优选浓度为0.08％～0.12％，更优选浓度为0.1％。

流动相B：甲酸浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；优选浓度为0.08％～0.12％，更优选浓度为0.1％。

流速：0.20～0.30ml/min；优选流速为0.22～0.28ml/min，更优选流速为0.25ml/min。

柱温：25～35℃；优选柱温为28℃～32℃，更优选柱温为30℃。

进样体积：2μl。

液相色谱所用洗脱梯度按下表操作：

梯度洗脱程序：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.01	80	20
1	80	20
			6.5	5	95
7	5	95
			7.2	80	20
13	80	20

(4)样品的配制

溶剂：35％～50％乙腈水溶液；优选浓度范围为40％～45％，更优选浓度为40％。

对照品溶液：取化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ各适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含化合物Ⅱ10ng、化合物Ⅲ10ng、化合物Ⅷ10ng和化合物Ⅵ700ng的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液：精密称取盐酸培唑帕尼供试品约60mg，置10ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，取1ml置2ml离心管中，12000转/分钟离心10分钟，取上清液作为供试品溶液。

(5)样品的检测

精密量取对照品溶液2μl注入液质联用仪，连续进样6针，记录离子流图，峰面积的相对标准偏差不得大于10.0％。再精密量取供试品溶液2μl注入液质联用仪，记录离子流图。

(6)结果计算

所用公式如下：

公式中：A_样为供试品溶液中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰面积；

C_样为供试品溶液中盐酸培唑帕尼的浓度；

A_对为对照品溶液中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰面积；

C_对为对照品溶液中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的浓度。

附图说明

图1实施例1中化合物Ⅱ对照品溶液的离子流图谱；

图2实施例1中化合物Ⅲ对照品溶液的离子流图谱；

图3实施例1中化合物Ⅵ对照品溶液的离子流图谱；

图4实施例1中化合物Ⅷ对照品溶液的离子流图谱；

图5实施例3中化合物Ⅱ线性的标准曲线图谱；

图6实施例3中化合物Ⅲ线性的标准曲线图谱；

图7实施例3中化合物Ⅵ线性的标准曲线图谱；

图8实施例3中化合物Ⅷ线性的标准曲线图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。

实施例1系统精密度

(1)高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪参数设置

1)质谱条件

仪器：三重四极杆质谱仪

扫描模式：多反应监测(MRM)

碰撞气压力(CAD)：6.00Psi

雾化气压力(GS1)：55.00Psi

喷雾电压(IS)：5500V

气帘气压力(CUR)：20.00Psi

辅助气压力(GS2)：55.00Psi

离子源温度(TEM)：500℃

检测离子与检测模式：

名称	检测模式	母离子(m/z)	子离子(m/z)
				化合物Ⅱ	正离子	192.2	146.2
化合物Ⅲ	正离子	162.2	147.2
				化合物Ⅵ	正离子	288.2	237.2
化合物Ⅷ	负离子	215.1	151.0

2)色谱条件

仪器：岛津高效液相色谱仪(LC-20AD XR，SIL-20A XR，CTO-20AC)

色谱柱：Waters Atlantis T3(2.1×100mm，3.5μm)

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液

流速：0.25ml/min；柱温：30℃；进样体积：2μl；

梯度洗脱程序：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.01	80	20
1	80	20
			6.5	5	95
7	5	95
			7.2	80	20
13	80	20

(2)溶液的配制与检测

精密称取化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ各约40mg，置100ml量瓶中，加溶剂40％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(1)；精密称取化合物Ⅵ约28mg，置100ml量瓶中，同时精密量取储备溶液(1)1ml置该量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(2)；精密量取储备溶液(2)5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液(3)；精密量取储备溶液(3)5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含化合物Ⅱ10ng、化合物Ⅲ10ng、化合物Ⅷ10ng和化合物Ⅵ700ng的混合溶液，作为对照品溶液。

精密量取对照品溶液2μl注入液质联用仪，按照本发明实施例所述方法检测。连续进样6针，计算化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰面积和保留时间的相对标准偏差。

(3)试验结果

结果表明，化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的对照品溶液连续进样6针，保留时间与峰面积的相对标准偏差均小于3.0％，系统精密度良好。试验结果见表1，对照品溶液的离子流图谱见附图1～图4。

表1系统精密度结果

实施例2定量限和检测限

(1)高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪参数设置

同实施例1

(2)溶液的配制与检测

基线噪音的测定：精密量取溶剂2μl，注入液相色谱仪，连续进样3针，按照本发明实施例1所述色谱条件检测。记录化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的出峰时间范围内空白基线噪音，并计算平均值。

定量限溶液和检测限溶液的制备：精密量取“实施例1”项下对照品溶液适量，分别用溶剂逐步稀释，按照本发明实施例1所述色谱条件检测，直至稀释至化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰高与相应噪音的比值(即信噪比，S/N)约为10为止，此时样品浓度与供试品测定浓度的比值即为定量限，以该浓度连续进样6针，计算峰高平均值；进一步稀释至化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰高与相应噪音的比值(即信噪比，S/N)约为3为止，此时样品浓度与供试品测定浓度的比值即为检测限，以该浓度连续进样3针，计算峰高平均值。

(3)试验结果

试验结果表明，在本发明所述分析方法下，化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的定量限均在0.2ppm以下，即供试品中含量在0.2ppm以上的上述化合物均可被准确定量；检测限均在0.06ppm以下，即供试品中含量在0.06ppm以上的上述化合物均可被检测到；方法的灵敏度符合要求。试验结果见表2、表3。

表2检测限试验结果

名称	浓度(ng/ml)	平均峰高(cps)	平均噪音(cps)	信噪比	检测限(ppm)
						化合物Ⅱ	0.10	217	61	3.6	0.017
化合物Ⅲ	0.19	496	158	3.1	0.032
						化合物Ⅵ	0.36	232	64	3.6	0.061
化合物Ⅷ	0.097	153	44	3.5	0.016

表3定量限试验结果

名称	浓度(ng/ml)	平均峰高(cps)	平均噪音(cps)	信噪比	定量限(ppm)
						化合物Ⅱ	0.51	842	61	13.8	0.087
化合物Ⅲ	0.97	1837	158	11.6	0.16
						化合物Ⅵ	1.42	853	64	13.3	0.20
化合物Ⅷ	0.49	550	44	12.6	0.083

实施例3线性

(1)高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪参数设置

同实施例1

(2)溶液的配制与检测

精密量取“实施例1”项下储备液(3)1ml、3ml、5ml、3ml、2ml和5ml，分别置100ml、100ml、100ml、50ml、25ml和50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为限度的20％、60％、100％、120％、160％和200％的线性测定溶液。

分别精密量取上述线性溶液2μl注入液质联用仪，按照本发明实施例1所述方法检测。(3)试验结果

试验结果表明，化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ在定量限至限度的200％浓度范围内，线性方程相关系数均大于0.99，线性关系符合要求。试验结果见表3～表4，标准曲线图谱见图5～图8。

表4化合物Ⅱ线性试验结果

表5化合物Ⅲ线性试验结果

表6化合物Ⅵ线性试验结果

表7化合物Ⅷ线性试验结果

实施例4准确度

(1)高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪参数设置

同实施例1

(2)溶液的配制与检测

对照品溶液：精密量取“实施例1”项下储备液(3)5ml，置100ml量瓶中，用溶剂释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

回收率储备液：精密量取“实施例1”项下储备液(3)5ml、5ml、15ml，分别置200ml、100ml、200ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为50％限度、100％限度、150％限度的回收率储备液。

准确度测试溶液：取供试品约60mg，共3份，精密称定，分别置10ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液；另取供试品约60mg，共9份，每3份为一组，共3组，分别置10ml量瓶中，每组分别用50％、100％和150％的回收率储备液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为50％、100％和150％回收率测定溶液。上述溶液各取1ml分别置不同的2ml离心管中，12000转/分钟离心10分钟，取上清液作为供试品溶液。

分别精密量取上述对照品溶液和准确度测试溶液2μl，注入液质联用仪，按照本发明实施例所述方法检测。

(3)试验结果

按如下公式计算每组样品中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的检出量，扣除空白样品中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ含量后的数据为实际检出量，计算实际检出量与理论加入量的比值，结果作为回收率数据，并统计回收率的范围、平均值和相对标准偏差(RSD)，用于评价方法的准确度。试验结果表明，不同浓度的准确度测定溶液，其回收率范围均在90.0％～130.0％，RSD小于7.0％，方法的准确度良好。试验结果见表8。

公式中：A_样为供试品溶液中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰面积；

C_样为供试品溶液中盐酸培唑帕尼的浓度；

A_对为对照品溶液中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的峰面积；

C_对为对照品溶液中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的浓度。

表8准确度试验结果

综上所述，本发明所述方法可实现盐酸培唑帕尼中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ的同步快速检测，较原研公司文献中的已有方法，其操作更为简便，灵敏度更高，为盐酸培唑帕尼的合成工艺优化和质量标准制定的提供了可靠依据。

Claims (10)

1.一种用于测定盐酸培唑帕尼中基因毒性杂质的分析方法，其特征在于：

(1)仪器及色谱条件：所用仪器为高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，质谱检测器采用电喷雾离子源和多反应监测模式，液相色谱采用碳十八色谱柱为固定相，以甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液为流动相，采取梯度洗脱方式；

(2)样品溶液的配置：采用乙腈水溶液作为溶剂将待检测样品配制成样品溶液；

(3)分离分析：将样品溶液注入所述高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，完成培唑帕尼基因毒性杂质II、III、VI、VIII的测定；

其中所述化合物II、III、VI、VIII分别是：2,3-二甲基-6-硝基-吲唑、2,3-二甲基-6-氨基-吲唑、N-(2-氯嘧啶-4-基)-N，2，3-三甲基-2H-吲唑-6-胺、2-甲基-5-硝基苯磺酰胺，

结构式分别如下：

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述质谱检测器的碰撞气压力为4Psi～8Psi，优选5Psi～7Psi，更优选6Psi；

雾化气压力为45Psi～65Psi，优选50～60Psi，更优选55Psi；

喷雾电压为4500V～6500V，优选5000V～6000V，更优选5500V；

气帘气压力为15Psi～25Psi，优选18Psi～22Psi，更优选20Psi；

辅助气压力为45Psi～65Psi，优选50～60Psi，更优选55Psi；

离子源温度为450℃～650℃，优选500℃～600℃，更优选500℃。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述质谱检测器采用的离子模式为：化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ采用正离子模式；化合物Ⅷ采用负离子模式；其中定量离子对分别为：化合物Ⅱ为m/z192.2→m/z146.2，化合物Ⅲ为m/z162.2→m/z147.2，化合物Ⅵ为m/z288.2→m/z237.2，化合物Ⅷ为m/z215.1→m/z151.0。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述液相色谱所用碳十八色谱柱的粒径为3.5μm，长度为100mm，内径为2.1mm；优选地，所述色谱型号为Waters Atlantis T3(2.1×100mm，3.5μm)。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：作为流动相A使用的甲酸水溶液中，甲酸的浓度为0.05％～0.15％，优选浓度为0.08％～0.12％，更优选浓度为0.1％；作为流动相B使用的甲酸乙腈溶液中，甲酸的浓度为0.05％～0.15％，优选浓度为0.08％～0.12％，更优选浓度为0.1％。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述乙腈水溶液中乙腈的浓度为35％～50％，优选浓度为40％～45％，更优选浓度为40％。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：液相色谱所用流动相的流速为0.20～0.30ml/min，优选流速为0.22～0.28ml/min，更优选流速为0.25ml/min。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：液相色谱所用色谱柱的柱温为25℃～35℃，优选柱温为28℃～32℃，更优选柱温为30℃。

9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述样品溶液的进样体积为2μl。

10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：液相色谱所用洗脱梯度按下表操作：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0.01 80 20 1 80 20 6.5 5 95 7 5 95 7.2 80 20 13 80 20