CN108802206A - 一种同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中主要成分和主要杂质的含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中主要成分和主要杂质的含量的方法。该方法以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱的填充剂，以一定比例的磷酸‑磷酸盐缓冲液和甲醇的混合溶液为流动相，可同时检测复方制剂注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中两种主要成分及两种主要杂质的含量，从而有效控制注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠的质量。另外，本发明还研制了已知杂质定位用对照溶液，适用于在HPLC检测方法中对头孢噻肟杂质B和杂质F进行定位，提高了杂质测定的针对性。本发明的方法专属性强，准确度高，稳定性好，操作简便，针对性强，规避了昂贵杂质对照品的使用，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中主要成分和主要杂质的含量的方法。
背景技术
注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠为头孢噻肟钠(Cefotaxime Sodium，CTX)和他唑巴坦钠(Tazobactam Sodium，TAZ)的复方制剂。头孢噻肟钠(分子式为 C16H16N5O7S2Na，分子量为477.45)为第三代半合成头孢菌素，他唑巴坦钠(分子式为C10H11N4O5SNa，分子量为322.27)为半合成β-内酰胺酶抑制剂，二者联合用药可以增强抑菌效果并拓宽抗菌谱。
目前，各国药典均只收载了针对单一的主要成分的检验方法，此类检验方法虽然能够有效地检验单一成分，但是尚不确定能否检验二者的混合物，因为两种成分在制成制剂后的检测过程中是否会产生相互影响仍存在许多不确定因素，需要进行大量的试验来验证。
CN101592637A公开了一种新的复方头孢噻肟钠他唑巴坦钠的检测方法，其中流动相为乙腈-磷酸二氢钾溶液(0.03mol/L)-四丁基氢氧化铵溶液(10％) (190:795:15)(磷酸调节pH值为4.0)。然而，该方法采用离子对试剂四丁基氢氧化铵溶液作为缓冲盐，流动相配制比较复杂，乙腈及四丁基氢氧化铵的价格也比较昂贵，并且离子对试剂和固定相结合后将产生不可逆的吸附，进而影响固定相上的活性位点，对色谱柱造成不可逆的损害，大大缩短色谱柱的使用寿命。另外，离子对试剂对pH值比较敏感，并且离子对试剂的浓度对样品的保留时间影响较大，配制流动相时的精确度要求较高，否则直接影响实验的重复性和重现性。
在该复方制剂的杂质谱研究过程中，研究者发现相关杂质多达十余种，通过来源分析可知，这些杂质主要来源于头孢噻肟钠。进一步分析可知，注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中需要重点控制的杂质有两种，即头孢噻肟杂质B(头孢噻肟的脱乙酰化产物)和头孢噻肟杂质F(头孢噻肟的二聚体)，均为本品的主要降解产物。这些杂质可能引起过敏反应，故应对其进行单独的质量控制。
从准确性的角度考虑，采用杂质对照品外标法的测定法是最为理想的。但是，制备杂质对照品及准确标定杂质的含量的难度较大，而且从质量风险控制和检验经济学的角度考虑也大可不必。综合各方面的因素，拟对杂质B和杂质F进行定位。鉴于我国境内尚无杂质B和杂质F对照品的生产机构和供应商，且上述杂质又是头孢噻肟钠的必然降解产物，故为了弥补我国该品种质量标准中杂质控制缺乏针对性的不足，必须寻求一种便捷的方式来保证在日常检验过程中能够轻易获得含有杂质B和杂质F的溶液，用于测试分析中的杂质定位。
通过文献检索发现，目前尚无文献报道能够同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中主要成分和主要杂质的含量的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种基于HPLC的用于同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中两种主要成分(头孢噻肟钠和他唑巴坦钠)和两种主要杂质(头孢噻肟杂质B和头孢噻肟杂质F)的含量的方法，以弥补现有技术中的空白。
具体而言，本发明采用如下技术方案：
一种同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中主要成分和主要杂质的含量的方法，其包括下列步骤：
1)色谱条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充剂(固定相)；
流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A和流动相B均为磷酸-磷酸盐缓冲液和甲醇的混合溶液，但混合比例不同；
洗脱方式为先等度后梯度洗脱；
流动相流速为1.0mL/min；
进样量为10μL；
检测波长为230nm；
2)供试品溶液的配制：
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟1mg的溶液，作为供试品溶液；
3)自身对照溶液的配制：
量取步骤2)中的供试品溶液适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟 20μg的溶液，作为自身对照溶液；
4)对照品溶液的配制：
称取头孢噻肟对照品和他唑巴坦对照品各适量，加流动相A配制成每1mL 含头孢噻肟1mg、他唑巴坦0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液；
5)已知杂质定位用溶液的配制：
称取头孢噻肟对照品适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟1mg的溶液，作为头孢噻肟杂质F定位用溶液；取头孢噻肟杂质F定位用溶液，高温降解后，作为头孢噻肟杂质B定位用溶液；
6)主要成分及主要杂质的含量测定：
将步骤4)中的对照品溶液利用步骤1)中的色谱条件进行高效液相分析，得到头孢噻肟和他唑巴坦的回归方程，再利用外标法计算步骤2)中的供试品溶液中作为主要成分的头孢噻肟和他唑巴坦的含量，完成主要成分的含量测定；
比较步骤2)中的供试品溶液以及步骤5)中的头孢噻肟杂质F定位用溶液和头孢噻肟杂质B定位用溶液的液相色谱图，确定作为主要杂质的头孢噻肟杂质F和杂质B在供试品溶液的色谱图中的位置，并采用借助于步骤3)中的自身对照溶液的主成分自身对照法来计算头孢噻肟杂质F和杂质B的含量，完成主要杂质的含量测定。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述色谱柱选自Waters XBridge ShieldC18色谱柱、Agilent ZORBAX SB C18色谱柱和GRACE Alltima C18色谱柱中的任意一种，优选Waters XBridge Shield C18色谱柱。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述流动相A中磷酸-磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为86:14，所述流动相B中磷酸-磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为 60:40。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述磷酸-磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的摩尔浓度为0.05mol/L。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述磷酸-磷酸盐缓冲液的pH值为6.25。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述先等度后梯度洗脱的洗脱条件如下：先采用流动相A为95v％，流动相B为5v％的流动相进行等度洗脱，待头孢噻肟洗脱完毕后再立即进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0分钟，流动相A为 95v％，流动相B为5v％；2分钟，流动相A为75v％，流动相B为25v％；8分钟，流动相A为75v％，流动相B为25v％；23分钟，流动相B为100v％；28 分钟，流动相B为100v％；33分钟，流动相A为95v％，流动相B为5v％；43 分钟，流动相A为95v％，流动相B为5v％。
在一项优选的实施方案中，步骤5)中所述高温降解的温度为60℃，时间为 1小时。
本发明以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱的填充剂，以一定比例的磷酸- 磷酸盐缓冲液和甲醇的混合溶液为流动相，可同时检测复方制剂注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中两种主要成分及两种主要杂质的含量，从而有效控制注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠的质量。另外，本发明还研制了已知杂质定位用对照溶液，适用于在HPLC检测方法中对头孢噻肟杂质B和杂质F进行定位，提高了杂质测定的针对性。本发明的方法专属性强，准确度高，稳定性好，操作简便，针对性强，规避了昂贵杂质对照品的使用，具有很好的应用价值。
附图说明
图1为实施例一中对照品溶液在本发明的色谱条件下的液相色谱图。
图2为实施例一中供试品溶液在本发明的色谱条件下的液相色谱图。
图3为实施例一中系统适用性溶液在本发明的色谱条件下的液相色谱图。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明中的技术方案做出进一步的阐述。下列实施例中未注明具体技术或条件者均按照本领域的文献中所描述的技术或条件进行。除另有说明外，下列实施例中所使用的试剂、药品及仪器均可通过常规商业手段获得。
试剂：磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、乙酸铵(CH3COONH4)、乙酸(CH3COOH)、甲醇(CH3OH)、超纯水(H2O)。
药品：注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(5:1)(批号：20110102、20120601、20120602、20120603，自制)。
对照品：头孢噻肟对照品(批号：130483-200904，由中国药品生物制品检定所提供)；他唑巴坦对照品(批号：130511-200402，由中国药品生物制品检定所提供)。
仪器：Waters 2996，DAD检测器。
实施例一：测定方法的确定。
1、色谱条件的确定：
采用下列色谱条件来筛选最佳的检测方法：
色谱条件(1)：
参照第7版欧洲药典中头孢噻肟钠有关物质项下色谱条件试验，其中：
色谱柱：Waters XBridge Shield C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；
流动相：混合磷酸盐缓冲液(取3.5g磷酸二氢钾和11.6g磷酸氢二钠，加 1000mL水溶解，用磷酸调节pH值至7.0)-甲醇(100:18v/v)；
洗脱方式：等度洗脱；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：235nm。
溶液配制(1)：
称取头孢噻肟对照品约10mg、他唑巴坦对照品约2mg，精密称定，置于10mL 容量瓶中，加流动相溶解后定容，摇匀，作为对照品溶液；
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约0.13mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流动相溶解后定容，摇匀，作为供试品溶液。
测定结果(1)：
分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液进样，记录色谱图，如表1～2所示。
表1.对照品溶液在色谱条件(1)下的液相色谱结果
峰结果
表2.供试品溶液在色谱条件(1)下的液相色谱结果
峰结果
结果表明：在等度洗脱条件下，他唑巴坦峰与相邻杂质峰的分离度不理想，头孢噻肟主峰后脂溶性较强的杂质的出峰时间晚，检测时间过长(至少为头孢噻肟主峰保留时间的8倍)，不适合较不稳定的头孢类样品的批量测定，故未采用该色谱条件。
色谱条件(2)：
参照第35版美国药典中头孢噻肟钠有关物质项下色谱条件试验，其中：
色谱柱：Waters XBridge Shield C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；
流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(取7.1g磷酸氢二钠，加1000mL水溶解，用磷酸调节pH值至6.25)-甲醇(86:14v/v)；
流动相B：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.25)-甲醇(60:40v/v)；
洗脱方式：梯度洗脱，具体的梯度洗脱条件如下：0min，流动相A为100v％； 7min，流动相A为100v％；9min，流动相A为80v％，流动相B为20v％；16min，流动相A为80v％，流动相B为20v％；45min，流动相B为100v％；50min，流动相B为100v％；55min，流动相A为100v％；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
柱温：30℃；
检测波长：235nm。
溶液配制(2)：
称取头孢噻肟对照品约10mg、他唑巴坦对照品约2mg，精密称定，置于10mL 容量瓶中，加流动相A溶解后定容，摇匀，作为对照品溶液；
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约0.13mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流动相A溶解后定容，摇匀，作为供试品溶液。
测定结果(2)：
分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液进样，记录色谱图，如表3～4所示。
表3.对照品溶液在色谱条件(2)下的液相色谱结果
峰结果
表4.供试品溶液在色谱条件(2)下的液相色谱结果
峰结果
结果表明：在该色谱条件下，在供试品溶液的色谱图中，头孢噻肟在梯度变化时出峰。由于美国药典中的方法指定了色谱柱的特定型号，考虑到不同仪器及色谱柱的差异，头孢噻肟的保留时间会受到流动相梯度变化的干扰，故亦未采用该色谱条件。
色谱条件(3)：
参照2010版中国药典中头孢噻肟钠有关物质项下色谱条件试验，其中：
色谱柱：Waters XBridge Shield C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；
流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(取7.1g磷酸氢二钠，加1000mL水溶解，用磷酸调节pH值至6.25)-甲醇(86:14v/v)；
流动相B：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.25)-甲醇(60:40v/v)；
洗脱方式：先等度后梯度洗脱，具体的洗脱条件如下：先以流动相A-流动相B(95:5v/v)进行等度洗脱，待头孢噻肟洗脱完毕后再立即进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min，流动相A为95v％，流动相B为5v％；2min，流动相A 为75v％，流动相B为25v％；8min，流动相A为75v％，流动相B为25v％；23min，流动相B为100v％；28min，流动相B为100v％；33min，流动相A为95v％，流动相B为5v％；43min，流动相A为95v％，流动相B为5v％；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：235nm。
溶液配制(3)：
称取头孢噻肟对照品约10mg、他唑巴坦对照品约2mg，精密称定，置于10mL 容量瓶中，加流动相A溶解后定容，摇匀，作为对照品溶液；
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约0.13mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流动相A溶解后定容，摇匀，作为供试品溶液。
测定结果(3)：
分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液进样，记录色谱图，如表5～6所示。
表5.对照品溶液在色谱条件(3)下的液相色谱结果
峰结果
表6.供试品溶液在色谱条件(3)下的液相色谱结果
峰结果
结果表明：在该色谱条件下，在供试品溶液的色谱图中，头孢噻肟和他唑巴坦的保留时间分别为22.043分钟和5.079分钟，理论塔板数分别为54692和14928，色谱峰之间的分离度较好，且检测时间较短。但是，他唑巴坦在该色谱条件下的紫外扫描图谱显示其为末端吸收。为了使两种主要成分均能够有较大的响应，同时避免因末端吸收带来的基线干扰问题，故将检测波长调整为230nm。在此检测波长下，头孢噻肟的响应值无显著性变化，而他唑巴坦的响应值明显增加，峰面积增大了约2.4倍，如表7和图1～2所示。
表7.不同检测波长下两种主要成分的峰面积比较
因此，最终确定的色谱条件如下：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A为磷酸-磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.25)-甲醇(86:14v/v)；
流动相B为磷酸-磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.25)-甲醇(60:40v/v)；
洗脱方式为先等度后梯度洗脱，具体的洗脱条件如下：先以流动相A-流动相B(95:5v/v)进行等度洗脱，待头孢噻肟洗脱完毕后再立即进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min，流动相A为95v％，流动相B为5v％；2min，流动相A 为75v％，流动相B为25v％；8min，流动相A为75v％，流动相B为25v％；23min，流动相B为100v％；28min，流动相B为100v％；33min，流动相A为95v％，流动相B为5v％；43min，流动相A为95v％，流动相B为5v％；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长为230nm。
2、系统适用性溶液的确定：
为了验证上述色谱条件，需要进行系统适用性试验考察。该检验项目旨在检测注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中的杂质。由于他唑巴坦的含量较少，因此关注的重点在于头孢噻肟的杂质，故系统适用性试验主要参考头孢噻肟的方法。
由于目前无法得到相应的特定杂质对照品，我们分别考察了由中国食品药品检定研究院提供的头孢噻肟钠系统适用性对照品以及参考第35版美国药典和第 7版欧洲药典中的强制破坏方法而制得的溶液。
(1)考察由中国食品药品检定研究院提供的头孢噻肟钠系统适用性对照品：
第7版欧洲药典对头孢噻肟中潜在杂质的研究较为透彻，其中列出了A～G 等7种杂质的结构，并且采用相对保留时间来进行杂质定位。虽然采用相对保留时间进行定位的方法在一定情况下可以解决无法获得杂质对照品的问题，但是往往也会由于保留时间漂移而为实际操作时的具体判断带来困难。为此，中国药典通过制备系统适用性标准物质并结合系统适用性标准图谱来解决该问题。
称取头孢噻肟钠系统适用性对照品适量，加流动相A溶解并制成约1mg/mL 的溶液，即得。取该溶液进样，所检出的色谱峰的个数和保留时间均无法与由中检院提供的系统适用性标准图谱相对应，故不适合作为系统适用性溶液。
(2)考察参照第35版美国药典制备的破坏溶液A：
称取头孢噻肟对照品适量，加流动相A溶解并制成约1mg/mL的溶液；取1mL 该溶液，与7mL水和2mL甲醇混匀，再加入25mg碳酸钠，于室温放置10分钟，不时振摇；然后再加入3滴冰醋酸、1mL头孢噻肟对照品溶液(1mg/mL)和2mg他唑巴坦对照品，摇匀，即得。取该破坏溶液A进样，破坏溶液A产生的杂质数较少，故也不适合作为系统适用性溶液。
(3)考察参照第7版欧洲药典制备的破坏溶液B：
称取头孢噻肟对照品适量，加流动相A溶解并制成约1mg/mL的溶液；取4mL 该溶液，加入1mL稀盐酸，于40℃加热2小时；然后加入5mL磷酸盐缓冲液(称取1.74g磷酸二氢钠、2.7g磷酸氢二钠和1.7g氯化钠，加400mL水溶解，pH＝6.6)， 1mL氢氧化钠水溶液(8.5wt％)，摇匀，再加入2mg他唑巴坦对照品，摇匀，即得。取破坏溶液B进样，其液相色谱图如表8和图3所示。
表8.系统适用性溶液在本发明的色谱条件下的液相色谱结果
峰结果
结果表明：破坏溶液B产生的杂质数较多，因此选用破坏溶液B作为系统适用性溶液进行分离度试验，规定主峰与前后杂质峰的分离度应符合规定，更能保证色谱条件的分离效果。
3、已知杂质定位用溶液的确定：
在由中检院提供的头孢噻肟对照品中，主要成分色谱峰后的主要杂质(相对于头孢噻肟主峰的保留时间约为1.8)为头孢噻肟杂质F(头孢噻肟的二聚体)；而头孢噻肟溶液于60℃加热1小时后的色谱图中的最大杂质峰(相对于头孢噻肟主峰的保留时间约为0.4)为头孢噻肟杂质B(头孢噻肟的脱乙酰化产物)。
具体配制过程如下：称取头孢噻肟对照品10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/mL的溶液，作为定位用溶液(1)，即头孢噻肟杂质F定位用溶液；取定位用溶液(1)，于60℃加热1小时，作为定位用溶液(2)，即头孢噻肟杂质B定位用溶液。
实施例二：测定方法的方法学验证。
1、杂质分析方法的验证：
实施例一中记载了测定方法的建立过程，而本实施例中的下列试验则用于说明该测定方法的优点。
●专属性：
(1)酸破坏：
样品酸破坏溶液：称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约 50mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL盐酸溶液(0.1mol/L)，于室温放置30分钟，加入等量的氢氧化钠溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
头孢噻肟对照品酸破坏溶液：称取头孢噻肟对照品约42mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL盐酸溶液(0.1mol/L)，于室温放置30分钟，加入等量的氢氧化钠溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
他唑巴坦对照品酸破坏溶液：称取他唑巴坦对照品约8.3mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL盐酸溶液(0.1mol/L)，于室温放置30分钟，加入等量的氢氧化钠溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
酸破坏空白溶液：量取1mL盐酸溶液(0.1mol/L)，置于50mL容量瓶中，再加入等量的氢氧化钠溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
取上述溶液，分别进样检测，记录色谱图，如表9～11所示。
表9.样品酸破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表10.头孢噻肟对照品酸破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表11.他唑巴坦对照品酸破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
结果表明，头孢噻肟对照品经酸破坏后，于色谱图中5.726、6.390和36.836 分钟处产生新的杂质峰；他唑巴坦对照品经酸破坏后，色谱图中2.773分钟处色谱峰的峰面积有所增加；注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠经酸破坏后，于色谱图中 2.755、6.104、9.870和12.411分钟处产生新的杂质峰。杂质与主要成分的色谱峰分离度良好，不干扰测定。
(2)碱破坏：
样品碱破坏溶液：称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约 50mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，于室温放置30分钟，加入等量的盐酸溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
头孢噻肟对照品碱破坏溶液：称取头孢噻肟对照品约42mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，于室温放置30分钟，加入等量的盐酸溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
他唑巴坦对照品碱破坏溶液：称取他唑巴坦对照品约8mg，精密称定，置于 50mL容量瓶中，加入1mL氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，于室温放置30分钟，加入等量的盐酸溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
碱破坏空白溶液：量取1mL氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，置于50mL容量瓶中，再加入等量的盐酸溶液(0.1mol/L)中和，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
取上述溶液，分别进样检测，记录色谱图，如表12～14所示。
表12.样品碱破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表13.头孢噻肟对照品碱破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表14.他唑巴坦对照品碱破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
结果表明，头孢噻肟对照品经碱破坏后，于色谱图中3.017、10.072和26.563 分钟处产生新的杂质峰；他唑巴坦对照品经碱破坏后，色谱图中2.781分钟处色谱峰的峰面积有所增加；注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠经碱破坏后，于色谱图中 2.776、6.220和6.689分钟处产生新的杂质峰。杂质与主要成分的色谱峰分离度良好，不干扰测定。
(3)氧化破坏：
样品氧化破坏溶液：称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102) 约50mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL H2O2溶液(3v％)，于室温放置30分钟，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
头孢噻肟对照品氧化破坏溶液：称取头孢噻肟对照品约42mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL H2O2溶液(3v％)，于室温放置30分钟，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
他唑巴坦对照品氧化破坏溶液：称取他唑巴坦对照品约8mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入1mL H2O2溶液(3v％)，于室温放置30分钟，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
氧化破坏空白溶液：量取1mL H2O2溶液(3v％)，置于50mL容量瓶中，于室温放置30分钟，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
取上述溶液，分别进样检测，记录色谱图，如表15～17所示。
表15.样品氧化破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表16.头孢噻肟对照品氧化破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表17.他唑巴坦对照品氧化破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
结果表明，头孢噻肟对照品经氧化破坏后，于色谱图中3.652、4.849、5.316、5.754、9.067和16.955分钟处产生新的杂质峰；他唑巴坦对照品经氧化破坏后，未产生新的杂质峰；注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠经氧化破坏后，于色谱图中3.484、5.903、10.005、27.178和35.991分钟处产生新的杂质峰。杂质与主要成分的色谱峰分离度良好，不干扰测定。
(4)光照破坏：
样品光照破坏溶液：称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102) 约50mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，再加入溶剂定容，摇匀，即得。置于低温光照箱内(照度4500Lx)放置10小时，备用。
头孢噻肟对照品光照破坏溶液：称取头孢噻肟对照品约42mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，再加入溶剂定容，摇匀，即得。置于低温光照箱内(照度 4500Lx)放置10小时，备用。
他唑巴坦对照品光照破坏溶液：称取他唑巴坦对照品约8mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，再加入溶剂定容，摇匀，即得。置于低温光照箱内(照度 4500Lx)放置10小时，备用。
取上述溶液，分别进样检测，记录色谱图，如表18～20所示。
表18.样品光照破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表19.头孢噻肟对照品光照破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表20.他唑巴坦对照品光照破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
结果表明，头孢噻肟对照品经光照破坏后，色谱图中6.337、7.060和38.917 处色谱峰的峰面积有所增加；他唑巴坦对照品经光照破坏后，于色谱图中2.813 分钟处产生新的杂质峰；注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠经光照破坏后，色谱图中 6.346和6.951分钟处色谱峰的峰面积有所增加。杂质与主要成分的色谱峰分离度良好，不干扰测定。
(5)高温破坏：
样品高温破坏溶液：取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)适量，置于80℃恒温烘箱中干燥1小时，放冷，称取约50mg，精密称定，置于50mL 容量瓶中，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
头孢噻肟对照品高温破坏溶液：取头孢噻肟对照品适量，置于80℃恒温烘箱中干燥1小时，放冷，称取约42mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
他唑巴坦对照品高温破坏溶液：取他唑巴坦对照品适量，置于80℃恒温烘箱中干燥1小时，放冷，称取约8mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，再加入溶剂定容，摇匀，即得。
取上述溶液，分别进样检测，记录色谱图，如表21～23所示。
表21.样品高温破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表22.头孢噻肟对照品高温破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
表23.他唑巴坦对照品高温破坏溶液的液相色谱结果
峰结果
结果表明，头孢噻肟对照品经高温破坏后，色谱图中6.299、7.014、15.347 和19.857分钟处色谱峰的峰面积有所增加，并于29.251分钟处产生新的杂质峰；他唑巴坦对照品经高温破坏后，于色谱图中2.827分钟处产生新的杂质峰；注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠经高温破坏后，色谱图中6.318、7.041和15.467分钟处色谱峰的峰面积有所增加，并于29.367分钟处产生新的杂质峰。杂质峰与主成分峰分离良好，不干扰测定。
●溶液稳定性：
(1)室温条件下的溶液稳定性：
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约0.13mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流动相A溶解后定容，摇匀，作为供试品溶液。于室温条件下放置，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8小时测定，其结果见表 24。
表24.室温条件下的溶液稳定性试验结果
由表24可知，在室温/8小时的检测过程中，他唑巴坦的峰面积变化不大，但头孢噻肟的峰面积明显下降，最大单个杂质峰面积和总杂质峰面积明显增加，说明供试品溶液的室温稳定性较差。
(2)5℃条件下的溶液稳定性：
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约0.13mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流动相A溶解后定容，摇匀，作为供试品溶液。置于5℃自动进样器上，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8小时测定，其结果见表25。
表25.5℃条件下的溶液稳定性试验结果
由表25可知，在5℃/8小时的检测过程中，供试品溶液的稳定性良好，两种主要成分的峰面积均无明显变化，最大单个杂质和总杂质的峰面积均无明显增加，说明供试品溶液需要临用新配或者置于5℃环境中保存。
●耐用性：
为了进一步验证方法的稳定性，制备系统适用性溶液，通过改变色谱条件中的多项参数来考察色谱条件的耐用性。
(1)改变色谱柱的品牌及型号：
仅改变色谱柱的品牌及型号，其他条件不变，其结果见表26。
表26.不同色谱柱品牌及型号的试验结果
注：
色谱柱1：Waters XBridge Shield C18(5μm，4.6×250mm)；
色谱柱2：Agilent ZORBAX SB C18(5μm，4.6×250mm)；
色谱柱3：GRACE AlltimaC18(5μm，4.6×250mm)。
由表26可知，不同品牌及型号的色谱柱对两种主要成分色谱峰的保留时间、理论塔板数和分离度均产生显著影响，但均符合要求。
(2)微调磷酸氢二钠的用量：
仅改变磷酸氢二钠的用量，其他条件不变，其结果见表27。
表27.不同磷酸氢二钠用量的试验结果
由表27可知，微调流动相中磷酸氢二钠的用量对检测方法无明显影响。
(3)微调流动相的pH值：
仅改变流动相的pH值，其他条件不变，其结果见表28。
表28.不同流动相pH值的试验结果
由表28可知，微调流动相的pH值对检测方法无明显影响。
(4)微调柱温：
仅改变柱温，其他条件不变，其结果见表29。
表29.不同柱温的试验结果
由表29可知，柱温升高后，两种主要成分的色谱峰保留时间均缩短，但微调柱温对检测方法无明显影响。
(5)微调流动相流速：
仅改变流速，其他条件不变，其结果见表30。
表30.不同流动相流速的试验结果
由表30可知，流速增加两主峰保留时间均缩短，但微调流速对该检测方法无明显影响。
2、含量分析方法的验证：
●线性范围：
分别精密称取头孢噻肟对照品20.36mg和他唑巴坦对照品3.93mg，置于10mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，倍比稀释后，分别精密量取10μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其结果见表31～32。
表31.头孢噻肟的线性试验结果
| 进样浓度(μg/mL) | 峰面积 |
| 1.845 | 41535 |
| 4.612 | 98287 |
| 9.223 | 159492 |
| 18.45 | 401775 |
| 46.12 | 995014 |
| 92.23 | 1973813 |
| 184.5 | 3931832 |
| 461.2 | 9802112 |
| 922.3 | 19763476 |
| 1845 | 39101791 |
由表31计算出回归方程y＝21234x+14561，r＝1。结果表明，在进样浓度为 1.845～1845μg/mL的范围内，头孢噻肟的量与峰面积之间呈现良好的线性关系。
表32.他唑巴坦的线性试验结果
| 进样浓度(μg/mL) | 峰面积 |
| 0.3895 | 2284 |
| 0.9737 | 2765 |
| 1.947 | 5302 |
| 3.895 | 11561 |
| 9.737 | 28273 |
| 19.47 | 54399 |
| 38.95 | 108840 |
| 97.37 | 275720 |
| 194.7 | 551827 |
| 389.5 | 1099300 |
由表32计算出回归方程y＝2823.9x+282.67，r＝1。结果表明，在进样浓度为0.3895～389.5μg/mL的范围内，他唑巴坦的量与峰面积之间呈现良好的线性关系。
●检测限和定量限：
按信噪比3:1确定头孢噻肟的检测限为0.32ng，他唑巴坦的检测限为0.60ng；按信噪比10:1确定头孢噻肟的定量限为0.95ng，他唑巴坦的定量限为0.83ng。
●回收率：
称取头孢噻肟和他唑巴坦原料，分别以他唑巴坦为100％，制备头孢噻肟80％、100％、120％的样品，各配制三份，再以头孢噻肟为100％，制备他唑巴坦80％、 100％、120％的样品，各配制三份，按含量测定项下方法测定，计算回收率，其结果见表33。
表33.回收率试验结果
由表33可知，方法的回收率良好。
●进样精密度：
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)约0.13g，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流动相溶解并定容，连续进样6次，记录峰面积，其结果见表34。
表34.进样精密度试验结果
由表34可知，方法的进样精密度良好。
●重复性：
取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)共6份，每份加流动相溶解，制成含有1mg/mL头孢噻肟和0.2mg/mL他唑巴坦的溶液，作为供试品溶液。另取头孢噻肟对照品和他唑巴坦对照品适量，加流动相溶解，分别制成含有 1mg/mL头孢噻肟的溶液和含有0.2mg/mL他唑巴坦的溶液，作为对照品溶液。按照外标法测定含量，其结果见表35。
表35.重复性试验结果
由表35可知，方法的重复性较好。
●中间精密度：
取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠(批号：20110102)，在不同时间由不同分析人员用不同仪器，制成6份含有1mg/mL头孢噻肟和0.2mg/mL他唑巴坦的溶液，作为供试品溶液；另取头孢噻肟对照品和他唑巴坦对照品适量，分别制成含有1mg/mL头孢噻肟的溶液和含有0.2mg/mL他唑巴坦的溶液，作为对照品溶液。按照外标法测定含量，其结果见表36。
表36.中间精密度试验结果
由表36可知，方法的中间精密度较好。
实施例三：样品测定结果及限度确定。
1、主要杂质的含量测定：
对杂质分析方法进行了一系列方法学考察，结果证明：该方法的系统适用性良好，能够有效检出注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中的两种主要杂质。3批样品中的杂质含量测定结果见表37。
表37.主要杂质含量测定结果
根据上述检查结果，结合《中国药典》2010版中注射用头孢噻肟钠、第8 版欧洲药典中头孢噻肟钠杂质限度要求及稳定性试验考察结果，制定杂质含量限度：在供试品溶液的色谱图中，扣除空白溶剂峰、头孢噻肟色谱峰和他唑巴坦色谱峰，杂质B和杂质F的色谱峰面积不得大于对照品溶液中两个主峰面积之和的0.5倍(1.0％)；其他单个杂质的色谱峰面积不得大于对照品溶液中两个主峰面积之和的0.5倍(1.0％)；各种杂质的色谱峰面积的总和不得大于对照品溶液中两个主峰面积之和的2.5倍(5.0％)，供试品溶液的色谱图中任何小于对照品溶液中两个主峰面积之和的0.025倍的色谱峰均可忽略不计。
2、主要成分的含量测定：
对分析方法进行方法学考察，确定该检测方法的准确性高，精密度好，适用于注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠的含量测定。三批样品的含量测定结果见表38。
表38.主要成分含量测定结果
参照《中国药典》2010版二部一般药品的含量限度，并考虑到今后大生产的情况，指定主要成分含量限度：按无水物计算，每1mg样品中头孢噻肟 (C16H17N5O7S2)和他唑巴坦(C10H12N4O5S)的含量应分别不得少于716μg和 145μg；按平均装量计算，头孢噻肟(C16H17N5O7S2)和他唑巴坦(C10H12N4O5S) 的含量均应为标示量的90.0％～115.0％。
由实施例一至实施例三可以看出，本发明以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱的填充剂(例如Waters XBridge Shield C18色谱柱)，以一定比例的磷酸-磷酸盐缓冲液和甲醇的混合溶液为流动相，可同时检测复方制剂注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中两种主要成分及两种主要杂质的含量，从而有效控制注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠的质量。另外，本发明还研制了已知杂质定位用对照溶液，适用于在HPLC检测方法中对头孢噻肟杂质B和杂质F进行定位，提高了杂质测定的针对性。本发明的方法专属性强，准确度高，稳定性好，操作简便，针对性强，规避了昂贵杂质对照品的使用，具有很好的应用价值。
Claims (7)
1.一种同时测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中主要成分和主要杂质的含量的方法，其特征在于：
所述方法包括下列步骤：
1)色谱条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A和流动相B均为磷酸-磷酸盐缓冲液和甲醇的混合溶液，但混合比例不同；
洗脱方式为先等度后梯度洗脱；
流动相流速为1.0mL/min；
进样量为10μL；
检测波长为230nm；
2)供试品溶液的配制：
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟1mg的溶液，作为供试品溶液；
3)自身对照溶液的配制：
量取步骤2)中的供试品溶液适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟20μg的溶液，作为自身对照溶液；
4)对照品溶液的配制：
称取头孢噻肟对照品和他唑巴坦对照品各适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟1mg、他唑巴坦0.2mg的混合溶液，作为对照品溶液；
5)已知杂质定位用溶液的配制：
称取头孢噻肟对照品适量，加流动相A配制成每1mL含头孢噻肟1mg的溶液，作为头孢噻肟杂质F定位用溶液；取头孢噻肟杂质F定位用溶液，高温降解后，作为头孢噻肟杂质B定位用溶液；
6)主要成分及主要杂质的含量测定：
将步骤4)中的对照品溶液利用步骤1)中的色谱条件进行高效液相分析，得到头孢噻肟和他唑巴坦的回归方程，再利用外标法计算步骤2)中的供试品溶液中作为主要成分的头孢噻肟和他唑巴坦的含量，完成主要成分的含量测定；
比较步骤2)中的供试品溶液以及步骤5)中的头孢噻肟杂质F定位用溶液和头孢噻肟杂质B定位用溶液的液相色谱图，确定作为主要杂质的头孢噻肟杂质F和杂质B在供试品溶液的色谱图中的位置，并采用借助于步骤3)中的自身对照溶液的主成分自身对照法来计算头孢噻肟杂质F和杂质B的含量，完成主要杂质的含量测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述色谱柱选自Waters XBridge Shield C18色谱柱、Agilent ZORBAX SBC18色谱柱和GRACE Alltima C18色谱柱中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述流动相A中磷酸-磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为86:14，所述流动相B中磷酸-磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为60:40。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述磷酸-磷酸盐缓冲液中磷酸氢二钠的摩尔浓度为0.05mol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述磷酸-磷酸盐缓冲液的pH值为6.25。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中所述先等度后梯度洗脱的洗脱条件如下：先采用流动相A为95v％，流动相B为5v％的流动相进行等度洗脱，待头孢噻肟洗脱完毕后再立即进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0分钟，流动相A为95v％，流动相B为5v％；2分钟，流动相A为75v％，流动相B为25v％；8分钟，流动相A为75v％，流动相B为25v％；23分钟，流动相B为100v％；28分钟，流动相B为100v％；33分钟，流动相A为95v％，流动相B为5v％；43分钟，流动相A为95v％，流动相B为5v％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤5)中所述高温降解的温度为60℃，时间为1小时。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181113 |
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