CN103954710A - 一种lc-ms/ms检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法 - Google Patents

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一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，步骤如下：1）配制乙酸铵缓冲溶液；2）烟草及烟草制品的干燥、粉碎；3）粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取；4）提取完的样品室温高速离心，得第一上清液；5）在第一上清液中加入乙酸乙酯进行萃取净化后，离心得第二上清液；6）取第二上清液经氮气吹干、去离子水复溶，制得待测样品；7）通过LC-MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。本发明的优点在于：样品前处理方法简单易行，利用乙酸铵缓冲溶液将烟草特有亚硝胺溶出，并通过乙酸乙酯液液萃取进行净化，除去了蛋白质和干扰物质，得到除杂后的精制样液，使得样品检测具有较高精确度，且提取效率高，操作简便、省时，试剂消耗量小。

Description

一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法
 
技术领域
本发明涉及烟草代谢组学烟草及烟草制品中特有亚硝胺（TSNAs）的样品前处理方法，具体是一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法。
背景技术
烟草特有亚硝胺(TSNAs)包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-甲基亚硝基吡啶基丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)等，是烟草及烟草制品中的一类有害物质，其中NNN和NNK被国际癌症研究组织定义为Group 1-确认的人类致癌物。目前，对TSNAs的测定采用LC-MS/MS的分析方法，（CORESTA recommended method N 72 of 61st Tobacco Science Research Conference） 报道的样品前处理方法包括以下步骤：1）样品提取：称取均匀试样，加入乙酸铵缓冲溶液并进行超声提取，离心取上清液待用；2）提取液净化：将固相萃取柱装好，依次用甲醇、水和甲酸活化，取待净化提取液低速过柱，再用甲醇-水(5：95)淋洗，最后用甲醇-水(70：30)洗脱，合并收集洗脱液，浓缩蒸干，并加入去离子水复溶，进行LC-MS/MS测定。上述方法采用固相萃取小柱净化，利用其离子交换和反相保留的双重保留模式完成对样品的富集纯化。然而，该方法的前处理试剂消耗量大，每个样的净化处理需要13 mL的试剂，并且该方法提取液中的蛋白质会对固相萃取小柱造成堵塞，样品处理时间较长，每天只能完成20个样品的净化处理。
发明内容
本发明所要解决的问题在于现有技术中用LC-MS/MS检测烟草及烟草制品特有亚硝胺的样品前处理方法耗时长，试剂消耗量大，进而提供一种适用于简便、快速检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，包括以下步骤：
1）配制乙酸铵缓冲溶液；
2）烟草及烟草制品的干燥、粉碎；
3）粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取；
4）提取完的样品室温高速离心，得第一上清液；
5）在所述第一上清液中加入乙酸乙酯进行液液萃取净化后，离心得第二上清液；
6）取第二上清液经氮气吹干、复溶，制得待测样品；
7）采用LC-MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。
所述步骤1）中乙酸铵缓冲溶液的浓度为100 mM，粉碎好的样品和乙酸铵缓冲溶液的用量比值介于1:40~1:20范围之间。。
    所述步骤3）中超声提取时间为30 min，频率为100 HZ。
    所述步骤4）和步骤5）中的离心速率为8000 rpm，时间为5 min。
    所述步骤5）中的乙酸乙酯和上清液的体积比为1:1。
所述步骤6）中的复溶溶剂是去离子水。
所述步骤2）中的烟草及烟草制品可为速冻的新鲜烟叶样品（冷冻干燥、粉碎机打碎），也可为卷烟烟丝。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的样品前处理方法，利用乙酸铵缓冲溶液将烟草特有亚硝胺溶出，并通过乙酸乙酯液液萃取进行净化，得到除杂后的精制样液，即可通过LC-MS/MS进行目标化合物的检测。较之现有技术，本发明的前处理提取效率高，操作简便、省时，试剂消耗量小。
本发明的样品前处理方法，还具有以下特点：
1）有机试剂使用种类少，仅使用了乙酸乙酯。
2）提取时间短，样品重现性好（参见图5）。
3）浓缩步骤采用氮气吹干的方式，不仅可以同时对多个样品进行浓缩处理，效率较高，而且相较于旋转蒸发的方式，氮气吹干更适于样品的平行处理。
4）操作安全便捷，能有效除去待测样品中的蛋白质分子和脂肪分子等，无需固相萃取柱的纯化富集，更适合大批量样品的测定。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
图2为本发明方法实例1的烟草特有亚硝胺的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。
图3为本发明方法实例2的烟草特有亚硝胺的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。
图4为本发明方法实例3的烟草特有亚硝胺的总离子流TIC图和提取离子流MRM图。
图2、3、4中：从上到下依次为：TIC；NNK-d4；NNK；NAB-d4；NAB；NAT-d4；NAT；NNN-d4；NNN。
图5为本发明方法对白肋烟烟叶进行了6次重复提取和进样分析的烟草特有亚硝胺总离子流TIC图。
具体实施方式
本发明通过以下具体实例作进一步描述，但并不限制本发明。
样品前处理实例1：
称取45~50 mg冻干处理的新鲜白肋烟烟叶样品于玻璃试管中，加入1.5 mL 100 mM乙酸铵缓冲溶液于玻璃管中(4种氘代TSNAs内标预先加入到乙酸铵缓冲溶液中，浓度分别为5 ng mL-1 NNN-d4，4 ng mL-1 NNK-d4，20 ng mL-1 NAT-d4，0.24 ng mL-1 NAB-d4)，加盖密封后置于超声波清洗机内，在室温下超声抽提30 min，超声功率为100 HZ，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取0.8 mL上清液，在所述上清液中加入0.8 mL乙酸乙酯，加盖密封，室温震荡5 min，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取上清液0.4 mL并用氮气吹干，用0.4 mL去离子水复溶，转移到色谱分析瓶中进行LC-MS/MS分析。
通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图2所示，各个定量离子对NNK-d4（212>126）；NNK（208>122）；NAB-d4（196>166）；NAB（192>162）；NAT-d4（194>164）； NAT（190>160）；NNN-d4（182>152）；NNN（178>148）可达到基线分离并准确定量4种特有亚硝胺。
样品前处理实例2：
称取20~25 mg烤烟烟丝样品于玻璃试管中，加入0.75 mL 100 mM乙酸铵缓冲溶液于玻璃管中(4种氘代TSNAs内标预先加入到乙酸铵缓冲溶液中，浓度分别为5 ng mL-1 NNN-d4，4 ng mL-1 NNK-d4，20 ng mL-1 NAT-d4，0.24 ng mL-1 NAB-d4)，加盖密封后置于超声波清洗机内，在室温下超声抽提30 min，超声功率为100 HZ，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取0.4 mL上清液，在所述上清液中加入0.4 mL乙酸乙酯，加盖密封，室温震荡5 min，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取上清液0.2 mL并用氮气吹干，用0.2 mL去离子水复溶，转移到色谱分析瓶中进行LC-MS/MS分析。
通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图3所示，各个定量离子对NNK-d4（212>126）；NNK（208>122）；NAB-d4（196>166）；NAB（192>162）；NAT-d4（194>164）； NAT（190>160）；NNN-d4（182>152）；NNN（178>148）可达到基线分离并准确定量4种特有亚硝胺。
样品前处理实例3：
称取90~100 mg冻干处理的香料烟于玻璃试管中，加入3.0 mL 100 mM乙酸铵缓冲溶液于玻璃管中(4种氘代TSNAs内标预先加入到乙酸铵缓冲溶液中，浓度分别为5 ng mL-1 NNN-d4，4 ng mL-1 NNK-d4，20 ng mL-1 NAT-d4，0.24 ng mL-1 NAB-d4)，加盖密封后置于超声波清洗机内，在室温下超声抽提30 min，超声功率为100 HZ，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取1.6 mL上清液，在所述上清液中加入1.6 mL乙酸乙酯，加盖密封，室温震荡5 min，然后在8000 rpm的转速下离心5 min，取上清液0.8 mL并用氮气吹干，用0.8 mL去离子水复溶，转移到色谱分析瓶中进行LC-MS/MS分析。
通过LC-MS/MS分析，所得的总离子流TIC和提取离子流MRM如图4所示，各个定量离子对NNK-d4（212>126）；NNK（208>122）；NAB-d4（196>166）；NAB（192>162）；NAT-d4（194>164）； NAT（190>160）；NNN-d4（182>152）；NNN（178>148）可达到基线分离并准确定量4种特有亚硝胺。

Claims (8)

1.一种LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制乙酸铵缓冲溶液；
烟草及烟草制品的干燥、粉碎；
粉碎好的样品加入乙酸铵缓冲溶液，超声提取；
提取完的样品室温高速离心，得第一上清液；
在所述第一上清液中加入乙酸乙酯进行萃取净化后，离心得第二上清液；
取第二上清液经吹干、复溶，制得待测样品；
采用LC-MS/MS对待测样品中含有的烟草特有亚硝胺进行检测。
2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：步骤1）中乙酸铵缓冲溶液的浓度为100 mM，粉碎好的样品与乙酸铵缓冲溶液的用量比值介于1:40~1:20范围之间。
3.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：步骤3）中超声提取时间为30 min，功率为100 HZ。
4.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：步骤4）和步骤5）中的离心速率为8000 rpm，时间为5 min。
5.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：步骤5）中的乙酸乙酯和上清液的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：步骤6）中的复溶溶剂是去离子水。
7.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：所述的烟草及烟草制品为速冻的新鲜烟叶。
8.根据权利要求1所述的LC-MS/MS检测烟草及烟草制品中特有亚硝胺的样品前处理方法，其特征在于：所述的烟草及烟草制品为卷烟烟丝。
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