CN104237431B - 一种电子烟烟雾中TSNAs的测定方法 - Google Patents

一种电子烟烟雾中TSNAs的测定方法 Download PDF

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本发明涉及一种电子烟烟雾中烟草特有亚硝胺（简称TSNAs）的高效液相色谱-串联质谱测定方法，属于电子烟理化检验技术领域，其特征在于：将电子烟样品经吸烟机抽吸，捕集方式采用全烟气捕集器或剑桥滤片串联吸收瓶或单独使用剑桥滤片或单独使用吸收瓶进行电子烟烟雾捕集，然后采用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪进行测定，采用内标法定量分析物。本发明为全新的电子烟烟雾中TSNAs含量的测定方法，该方法具有较好的选择性与准确性。

Description

一种电子烟烟雾中TSNAs的测定方法
技术领域
本发明为一种电子烟烟雾中TSNAs的测定方法，涉及电子烟理化检验技术领域。
背景技术
电子烟，世界卫生组织对其官方的定义为——电子尼古丁传送系统（electronicnicotinedeliverysystems，ENDS），它是一种消费产品，能够向肺部传输尼古丁，因其在生理感受、心理感知、吸食方式等方面比较接近传统卷烟，受到广大消费者的青睐。面对市售的形形色色的电子烟，相继有报道称其存在安全隐患问题，部分国家也开始对其进行监管和相关的研究。4-（亚硝基甲氨基）-1-β-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基降烟碱（NNN）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）和N-亚硝基假木贼碱（NAB）是广泛存在于卷烟烟雾中的致癌物，并且这些物质只存在于烟草制品或者卷烟烟雾中，因此被称为烟草特有亚硝胺（TSNAs）。国际癌症研究机构IARC、Hecht研究团队等，对加拿大政府名单中有害成分的毒性评价结果表明：TSNAs中的NNK对实验室动物有致癌性。因此针对电子烟烟雾中TSNAs含量的检测对人类健康具有十分重要的意义，然而关于烟雾中TSNAs的测定方法鲜有报道。Goniewicz对12个品牌的电子烟中的TSNAs含量进行了测定，发现NNN含量范围为0.8-4.3ng/支烟（150口），NNK含量范围为1.1-28.3ng/支烟（150口）。因此，能否提供一种前处理简单的、快速、高灵敏度的测定电子烟烟雾中TSNAs的方法，已成为目前的研究人员的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于建立一种简单、快速、选择性好的测定电子烟烟雾中烟草特有TSNAs的测定方法该方法能快速、准确检测电子烟烟雾中烟草特有亚硝胺的含量，测定结果准确、测定干扰少。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种电子烟烟雾中烟草特有亚硝胺（TSNAs）的测定方法为高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测定方法，该方法是对四种特有亚硝胺：NNK、NNN、NAT和NAB的测定，该方法包括了以下步骤：
a、烟支抽吸：电子烟样品经吸烟机抽吸；
b、烟雾捕集：进行电子烟烟雾捕集；
c、配置系列标准溶液：用NNK、NNN、NAT和NAB标准物质制备系列标准溶液；
d、待测液制备：将捕集得到的剑桥滤片和吸收液放入锥形瓶中，加入含内标物的乙酸铵溶液进行萃取制备，即为样品待测液，所述内标物为NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4；
e、标准曲线的绘制：吸取配制好的不同浓度的系列标准溶液，注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统，得到NNK、NNN、NAT和NAB四种物质浓度和峰面积的标准曲线，即一元线性回归方程；
f、样品待测液测定：将制备好的待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
所述的吸烟机抽吸模式采用加拿大深度抽吸、Massachusetts或ISO抽吸模式。
所述的电子烟烟雾捕集方式采用全烟气捕集器串联吸收瓶或剑桥滤片，或剑桥滤片串联吸收瓶或单独使用剑桥滤片或单独使用吸收瓶进行电子烟烟雾捕集。
所述液相色谱柱选取WatersAcquityUPLCBEHC18色谱柱，流动相为甲醇A和0.1-0.5%（V/V）乙酸水溶液B；流速为0.1-1.0mL/min；梯度洗脱条件：0-2min，10%A，2-4.5min，100%A-10%A，4.5-6min，10%A；选取WatersXTerraMSC18色谱柱，梯度洗脱条件：0-4min，5%A，4-4.1min，100%A-5%A，4.1-10min，5%A。
所述含内标物NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4的乙酸铵萃取溶液，其制备方法：①分别称取5.0mg的上述四种物质，甲醇溶解在4个10mL棕色容量瓶并定容；②分别移取1.0mL①中的4种溶液至100mL棕色容量瓶，甲醇定容；③移取10.0mL②中溶液至100mL棕色容量瓶，甲醇定容；④移取5.0mL③中溶液至500mL容量瓶，用0.1mol/L乙酸铵溶液定容，配制成5.0ng/mL含内标物的乙酸铵萃取溶液。
所述系列标准溶液配制方法：①分别称取10.0mgNNK、NNN、NAT和NAB，甲醇溶解，转移至4个10mL棕色容量瓶，甲醇定容；②分别移取上述溶液0.1mL、0.5mL、0.5mL和0.5mL至100mL容量瓶中，甲醇定容；③移取10.0mL②中溶液至100mL棕色容量瓶中，甲醇定容；④移取③中溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和5.0mL至100mL棕色容量瓶，分别加入1mL，浓度1.0μg/mL的NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，用0.1mol/L乙酸铵溶液定容，即配制成六级系列标准溶液，其浓度均为10.0ng/mL，如样品浓度超出标准溶液覆盖范围，可适当扩展标准溶液覆盖范围。
F步骤中待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统时NNK、NNN、NAT和NAB所选择的定量离子对分别为208.1/122.1，178.1/148.2，190.1/160.1和192.1/162.1；NNK、NNN、NAT和NAB所选择的定性离子对分别为208.2/148.1，178.2/120.01，190.2/106.1，192.1/133.1。
F步骤中待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统时内标物NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4所选择的定量离子对分别为212.2/126.1，182.1/152.2，194.1/164.2，196.2/166.2；NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4所选择的定性离子对分别为212.2/110.1，182.1/124.1，194.1/110.1，196.2/137.2。
F步骤中所述高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统的离子源为电喷雾电离源（ESI）；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测（MRM）；电喷雾电压为5000-6000V；离子源温度为600-700℃；辅助气Gas1压力为50.0-60.0Psi；辅助气Gas2压力为70.0-80.0Psi。
与现有技术相比本发明方法具有如下良好效果：①填补电子烟烟雾中关于TSNAs的检测方法的空白；②高效液相色谱-三重四级杆串联质谱对难挥发的、热不稳定的、极性较强的化合物的分离优势与串联质谱较强大的分离能力、定性定量能力结合起来，分析结果比较准确、重复性较好，满足了新型烟草特别是电子烟烟雾中TSNAs含量检测的要求；③本方法前处理简便，不需要经过复杂的固相萃取过程，可以提高分析通量，具有快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
附图说明
图1内标物NNN-d4色谱图。
图2NNN色谱图。
图3内标物NNK-d4色谱图。
图4NNK色谱图。
图5内标物NAT-d4色谱图。
图6NAB色谱图。
图7内标物NAB-d4色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但并不是限于实施例。
实施例1：
一种电子烟烟雾中烟草特有亚硝胺的液相色谱串联质谱测定方法，其测试过程是电子烟烟雾样品经稀释后直接引入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统分析。
该方法是对四种特有亚硝胺：NNK、NNN、NAT和NAB的测定，包括了以下步骤：
a、烟支抽吸：电子烟样品采用加拿大深度抽吸、Massachusetts或ISO抽吸模式抽吸；
b、烟雾捕集：采用全烟气捕集器串联吸收瓶或剑桥滤片，或剑桥滤片串联吸收瓶或单独使用剑桥滤片或单独使用吸收瓶进行电子烟烟雾捕集。
c、配置标准系列溶液：将NNK、NNN、NAT和NAB标准物质制备系列标准溶液；①分别称取10.0mgNNK、NNN、NAT和NAB，甲醇溶解，转移至4个10mL棕色容量瓶，甲醇定容；②分别移取上述溶液0.1mL、0.5mL、0.5mL和0.5mL至100mL容量瓶中，甲醇定容；③移取10.0mL②中溶液至100mL棕色容量瓶中，甲醇定容；④移取③中溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和5.0mL至100mL棕色容量瓶，分别加入1mL，浓度1.0μg/mL的NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，用0.1mol/L乙酸铵溶液定容，即配制成六级系列标准溶液，其浓度均为10.0ng/mL。
d、待测液制备：将捕集得到的剑桥滤片和吸收液放入锥形瓶中，加入含内标物的乙酸铵溶液进行萃取制备，即为样品待测液，所述内标物为NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4；
所述含内标物NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4的乙酸铵萃取溶液的制备方法：①分别称取5.0mg的上述四种物质，甲醇溶解在4个10mL棕色容量瓶并定容；②分别移取1.0mL①中的4种溶液至100mL棕色容量瓶，甲醇定容；③移取10.0mL②中溶液至100mL棕色容量瓶，甲醇定容；④移取5.0mL③中溶液至500mL容量瓶，用0.1mol/L乙酸铵溶液定容，配制成5.0ng/mL含内标物的乙酸铵萃取溶液。
e、标准曲线的绘制：吸取配制好的不同浓度的混合标准溶液，注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统，得到NNK、NNN、NAT和NAB四种物质浓度和峰面积的标准曲线，即一元线性回归方程；
f、样品待测液测定：将制备好的待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
液相色谱柱选取C18，液相色谱条件：
色谱柱：C18柱(1.7μm，2.1×100mm)或等效柱，使用WatersAcquityUPLCBEHC181.7μm，2.1×100mm分析柱；
流速：0.1-1.0mL/min；
柱温：30-60℃；
进样量：5-10μL；
流动相A：甲醇，流动相B：0.1-0.5%（V/V）的乙酸水溶液；
梯度洗脱条件如下表所示。
快速型高效液相色谱梯度洗脱条件
或色谱柱：C18柱(5μm，4.6×150mm)或等效柱；本项目研究使用WatersXTerraMSC185μm4.6×150mm分析柱；
流速：0.1-1.0mL/min；
柱温：30-60℃；
进样量：5-10μL；
流动相A：甲醇，流动相B：0.1-0.5%（V/V）的乙酸水溶液；
梯度洗脱条件如下表所示。
普通型高效液相色谱梯度洗脱条件
f步骤中待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统时NNK、NNN、NAT和NAB所选择的定量离子对分别为208.1/122.1，178.1/148.2，190.1/160.1和192.1/162.1；NNK、NNN、NAT和NAB所选择的定性离子对分别为208.2/148.1，178.2/120.01，190.2/106.1，192.1/133.1；NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4所选择的定量离子对分别为212.2/126.1，182.1/152.2，194.1/164.2，196.2/166.2；NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4所选择的定性离子对分别为212.2/110.1，182.1/124.1，194.1/110.1，196.2/137.2。
f步骤中所述高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统的离子源为电喷雾电离源（ESI）；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测（MRM）；电喷雾电压为5500V；离子源温度为650℃；辅助气Gas1压力为50.6Psi；辅助气Gas2压力为70.0Psi。

Claims (4)

1.一种电子烟烟雾中TSNAs的测定方法，其特征在于：该方法是对四种特有亚硝胺：NNK、NNN、NAT和NAB的测定，包括了以下步骤：
a、烟支抽吸：电子烟样品经吸烟机抽吸；吸烟机抽吸模式采用加拿大深度抽吸、Massachusetts或ISO抽吸模式；
b、烟雾捕集：进行电子烟烟雾捕集；所述的电子烟烟雾捕集采用全烟气捕集器串联吸收瓶或剑桥滤片，或剑桥滤片串联吸收瓶进行电子烟烟雾捕集；
c、配置系列标准溶液：用NNK、NNN、NAT和NAB标准物质制备系列标准溶液；系列标准溶液配制方法：①分别称取10.0mgNNK、NNN、NAT和NAB，甲醇溶解，转移至4个10mL棕色容量瓶，甲醇定容；②分别移取上述溶液0.1mL、0.5mL、0.5mL和0.5mL至100mL容量瓶中，甲醇定容；③移取10.0mL②中溶液至100mL棕色容量瓶中，甲醇定容；④移取③中溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和5.0mL至100mL棕色容量瓶，分别加入1mL，浓度1.0μg/mL的NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，用0.1mol/L乙酸铵溶液定容，即配制成六级系列标准溶液，其中NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4浓度均为10.0ng/mL；
d、待测液制备：将捕集得到的剑桥滤片和/或吸收液放入锥形瓶中，加入含内标物的乙酸铵溶液进行萃取制备，即为样品待测液，所述内标物为NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4；
所述含内标物的乙酸铵萃取溶液，其制备方法：①分别称取5.0mg的上述四种物质，甲醇溶解在4个10mL棕色容量瓶并定容；②分别移取1.0mL①中的4种溶液至100mL棕色容量瓶，甲醇定容；③移取10.0mL②中溶液至100mL棕色容量瓶，甲醇定容；④移取5.0mL③中溶液至500mL容量瓶，用0.1mol/L乙酸铵溶液定容，配制成5.0ng/mL含内标物的乙酸铵萃取溶液；
e、标准曲线的绘制：吸取配制好的不同浓度的系列标准溶液，注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统，得到NNK、NNN、NAT和NAB四种物质浓度和峰面积的标准曲线，即一元线性回归方程；
f、样品待测液测定：将制备好的待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量；选取WatersXTerraMSC18色谱柱，梯度洗脱条件：0-4min，5%A-100%A,95%B-0%B；4-4.1min，100%A-5%A,0%B-95%B；4.1-10min，5%A,95%B；A是甲醇，B是0.1-0.5%V/V乙酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的电子烟烟雾中TSNAs的测定方法，其特征在于：f步骤中待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统时NNK、NNN、NAT和NAB所选择的定量离子对分别为208.1/122.1，178.1/148.2，190.1/160.1和192.1/162.1；NNK、NNN、NAT和NAB所选择的定性离子对分别为208.2/148.1，178.2/120.01，190.2/106.1，192.1/133.1。
3.根据权利要求1所述的电子烟烟雾中TSNAs的测定方法，其特征在于f步骤中待测液注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统时内标物NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4所选择的定量离子对分别为212.2/126.1，182.1/152.2，194.1/164.2，196.2/166.2；NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4和NAB-d4所选择的定性离子对分别为212.2/110.1，182.1/124.1，194.1/110.1，196.2/137.2。
4.根据权利要求1所述的电子烟烟雾中TSNAs的测定方法，其特征在于f步骤中所述高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统的离子源为电喷雾电离源（ESI）；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测（MRM）；电喷雾电压为5000-6000V；离子源温度为600-700℃；辅助气Gas1压力为50.0-60.0Psi；辅助气Gas2压力为70.0-80.0Psi。
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