CN108717091A - 一种磁性石墨烯、烟草特有n-亚硝胺的测定方法及样品前处理方法 - Google Patents

一种磁性石墨烯、烟草特有n-亚硝胺的测定方法及样品前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种磁性石墨烯、烟草特有N‑亚硝胺的测定方法及样品前处理方法。该样品前处理方法包括以下步骤：向样品提取液中加入磁性石墨烯进行萃取，然后对吸附在磁性石墨烯上的目标分析物进行洗脱，收集洗脱液即为待测溶液。本发明提供的用于烟草特有N‑亚硝胺测定的样品前处理方法，利用石墨烯和烟草特有N‑亚硝胺之间可以发生π‑π、疏水等多种相互作用力，实现目标分析物的特异性吸附，实现了复杂基质中干扰物质的去除和目标分析物的富集，测定结果表明，没有干扰物质影响目标分析物的定量，该针对样品提取液的处理方法对实际样品具有良好的净化能力，提高了净化效率。

Description

一种磁性石墨烯、烟草特有N-亚硝胺的测定方法及样品前处 理方法
技术领域
本发明属于烟草化学检验技术领域，具体涉及一种磁性石墨烯、烟草特有N-亚硝胺的测定方法及样品前处理方法。
背景技术
烟草特有N-亚硝胺类化合物不仅是霍夫曼清单和美国食品药品监督管理局“烟草制品及烟气中有害及潜在有害物质名单”中的重要化合物，也是国际癌症研究机构“无烟气烟草制品中28种有害物质”名单中的重要成分。例如，N-亚硝基降烟碱(NNN)和4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)被国际癌症研究机构确认为Ⅰ类致癌物。因此，准确分析烟草特有N-亚硝胺含量具有重要意义。
烟草及烟草制品及其烟气释放物是极其复杂的混合物，目前一共已鉴定出的成分超过8000余种，而其中烟草特有N-亚硝胺的含量水平一般在μg或ng级别，尤其是国内生产的烤烟型卷烟主流烟气中的NAB含量更低。美国卫生部和食品药品监督管理局已经在2017年1月提出了无烟气烟草制品中NNN的含量上限为1μg/g的提议。
测定烟草特有N-亚硝胺的释放量时通常面临以下难点：目标物含量低、存在基质干扰。在对烟草特有N-亚硝胺进行测定时需要针对其性质选择合适的提取、纯化和浓缩方法才能进行后续的仪器测定。目前在卷烟主流烟气总粒相物和烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的测定中均有相应的推荐方法，同时烟草科学研究合作中心(CORESTA)也有卷烟主流烟气总粒相物和新型烟草制品中烟草特有N-亚硝胺测定的推荐方法。
YC/T184-2004《烟草及烟草制品烟草特有N-亚硝胺的测定》中，是利用二氯甲烷的碱性溶液萃取烟草和烟草制品中的TSNAs(烟草特有N-亚硝胺)，萃取液经碱性氧化铝层析柱纯化，通过气相色谱-热能分析联用仪定量分析检测其中四种TSNAs的含量。
上述方法基本能满足绝大多数情况下的分析需求，然而对个别目标物含量极低、且基质复杂的样品(如专门针对降低烟草特有N-亚硝胺而研发的转基因烟叶品种)，现有测定方法的操作过程较为复杂、对样品提取液的净化没有选择性，导致净化能力和净化效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，从而解决现有样品处理方法存在的操作过程复杂、净化效率低的问题。
本发明还提供了一种样品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法及磁性石墨烯。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，包括以下步骤：向样品提取液中加入磁性石墨烯进行萃取，然后对吸附在磁性石墨烯上的目标分析物进行洗脱，收集洗脱液即为待测溶液。
本发明提供的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，利用石墨烯和烟草特有N-亚硝胺之间可以发生π-π、疏水等多种相互作用力，实现目标分析物的特异性吸附，实现了复杂基质中干扰物质的去除和目标分析物的富集，测定结果表明，没有干扰物质影响目标分析物的定量，该针对样品提取液的处理方法对实际样品具有良好的净化能力，提高了净化效率。
采用石墨烯材料利用固相萃取技术进行样品预处理时，通常是将石墨烯填装在固相萃取小柱内，微小的石墨烯会在使用过程中穿过筛板，造成填料流失或堵塞筛板，引起萃取效率的下降或使用过程中压力增大。而利用磁性石墨烯实现磁固相萃取，可快速进行样品的预处理，具有快速高效、操作简单、易于批量处理的优点。
磁性固相萃取是一种基于磁性或可磁化吸附剂的样品预处理技术，在该模式下吸附剂通过涡旋或者超声均匀分散在样品溶液或解吸溶液中，因此与目标分析物有很大的接触面积，可以实现目标分析物的快速吸附和解吸。同时利用外界磁场可以很容易地收集吸附剂，通过清洗、洗脱等步骤实现干扰物质的去除和目标分析物的富集。利用上述磁性石墨烯对烟草特有N-亚硝胺进行磁性固相萃取，磁颗粒赋予了石墨烯磁分离的能力，在外界磁场的作用下，可以方便快速地从分散液中将石墨烯性回收，避免了常规固相萃取过程中的堵塞柱管的问题。
所述磁性石墨烯可采用市售商品或使用现有技术制备。为进一步优化对烟草特有N-亚硝胺的特异性吸附能力，优选的，所述磁性石墨烯由石墨烯材料和磁性纳米颗粒复合而成。所述石墨烯材料为石墨烯、氨基修饰石墨烯、羧酸修饰石墨烯中的至少一种。萃取试验表明，不同性质的石墨烯对目标分析物均有较好的萃取效果，其中不经过修饰的石墨烯的萃取效果最佳，这可能是由于不经过修饰的石墨烯片层的缺陷少、规整度高，与目标分析物之间的疏水和π-π作用较强所致。
所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁或硅胶包覆的四氧化三铁。四氧化三铁可通过水热法或溶剂热法制备得到。硅胶包覆的四氧化三铁可通过stober法制得。磁性石墨烯中，磁性纳米颗粒对烟草特有N-亚硝胺的吸附基本无影响，其相对于石墨烯材料的用量主要依据在磁固相萃取中石墨烯的回收快慢情况进行调整，一般情况下，石墨烯材料和磁性纳米颗粒的质量比为1：(1-10)。
所述样品提取液是使用甲酸铵溶液或乙酸铵溶液对样品提取得到的。所述样品为卷烟主流烟气总粒相物、烟草和/或烟草制品。为达到更好的提取效果，优选的，所述甲酸铵溶液或乙酸铵溶液的浓度为0.005-0.5mol/L。每0.5-2g烟草及烟草制品中，甲酸铵溶液或乙酸铵溶液的用量为10-50mL。所述提取可采用超声或振荡提取，提取的时间可设定为10-60min。
从提高萃取效率，兼顾石墨烯材料的利用效率出发，优选的，每0.5-2g烟草及烟草制品的样品提取液，石墨烯材料的用量为0.25-10mg。为了保证在较短的萃取时间内获得较好、且稳定的萃取效果，所述萃取的时间为1.0-20.0min，优选为3.0min。
考虑到解吸效率和配制解吸液时的操作简单，优选的，洗脱时所用的洗脱溶剂为丙酮、乙腈、丙酮与甲酸的混合溶剂、丙酮与氨水的混合溶剂中的至少一种。进一步优选的，丙酮与甲酸的混合溶剂中，甲酸的体积百分比不大于5％。丙酮与氨水的混合溶剂中，氨水的体积百分比不大于5％。
一种样品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：
1)向含有内标物的样品提取液中加入磁性石墨烯进行萃取，然后对吸附在磁性石墨烯上的目标分析物进行洗脱，收集洗脱液得到洗脱溶液；
2)对洗脱溶液进行液相色谱-串联质谱分析，由烟草特有N-亚硝胺的峰面积和内标峰面积之比进行定量，即得。
本发明提供的样品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，使用磁性石墨烯对样品提取液进行净化，再用液相色谱-串联质谱仪对净化液进行分析，利用内标法测定主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的含量。本发明的方法克服了现有测定技术中对样品不净化或者净化没有选择性、净化效率不高、没有通用测定方法等不足，针对样品提取物的特点和目标分析物的性质，简化了烟草特有N-亚硝胺的测定步骤，提高了测定效率。
步骤1)中，所述磁性石墨烯由石墨烯材料和磁性纳米颗粒复合而成。所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁或硅胶包覆的四氧化三铁。所述石墨烯材料为石墨烯、氨基修饰石墨烯、羧酸修饰石墨烯中的至少一种。石墨烯材料和磁性纳米颗粒的质量比为1：(1-10)。
所述样品为卷烟主流烟气总粒相物、烟草和/或烟草制品。所述样品提取液是使用甲酸铵溶液或乙酸铵溶液对烟草及烟草制品提取得到的。优选的，所述甲酸铵溶液或乙酸铵溶液的浓度为0.005-0.5mol/L。每0.5-2g烟草及烟草制品中，甲酸铵溶液或乙酸铵溶液的用量为10-50mL。所述提取可采用超声或振荡提取，提取的时间可设定为10-60min。
每0.5-2g烟草及烟草制品的样品提取液，石墨烯材料的用量为0.25-10mg。
步骤1)、步骤2)中，烟草特有N-亚硝胺包括N-亚硝基降烟碱NNN、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮NNK、N-亚硝基新烟碱NAT和N-亚硝基假木贼碱NAB，内标物包括NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4。
步骤2)中，将洗脱溶液进行浓缩后，再进行所述液相色谱-串联质谱分析。具体浓缩比例可依据实际情况进行调整，一般可将洗脱溶液浓缩至原体积的1/5-1/15。
步骤2)中，液相色谱-串联质谱分析时的色谱条件为：色谱柱：Poroshell 120EC-C18；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相为0.01mol/L甲酸铵(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；流速：0.4mL/min；流动相梯度程序：t＝0min，10％B，t＝2.0min，40％B，t＝4.0min，60％B，t＝6.0min，90％B，t＝9.0min，90％B，t＝9.5min，10％B，t＝15.0min，10％B。
液相色谱-串联质谱分析时的质谱条件为：电喷雾电压5000V；雾化气压力50psi；辅助雾化气压力50psi；气帘气压力35psi；离子源温度450℃；进口电压8V；出口电压10V；去簇电压40V；驻留时间40ms；监测方式：多反应监测。
目标分析物及内标的保留时间多反应监测参数具体为：NNN、NNK、NAT、NAB的定量离子对依次为178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1、192.1>162.2，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV；NNN、NNK、NAT、NAB的定性离子对依次为178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1、192.1>133.1，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV；NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4的定量离子对依次为182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1、196.1>166.2，相应的碰撞电压依次为15、16、15和17eV。NNN、NNN-d4、NNK、NNK-d4、NAT、NAT-d4、NAB、NAB-d4的保留时间依次为4.52、4.47、5.08、5.06、5.45、5.42、5.57、5.54min。
步骤2)中，配制含内标的不同浓度的系列混合标准溶液，以烟草特有N-亚硝胺的峰面积和相应内标峰面积之比为纵坐标，以烟草特有N-亚硝胺的浓度为横坐标，绘制工作曲线；根据样品溶液中烟草特有N-亚硝胺峰面积和相应内标峰面积之比，依据工作曲线，得到样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。
本发明的样品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，将磁性固相萃取技术用于烟草特有N-亚硝胺的快速测定，可以解决目前烟草特有N-亚硝胺测定时存在的操作繁琐费事的问题，具有操作简单快速、净化效率高、灵敏度高、适用范围广等优点，能提高测试效率、降低仪器维护成本。
一种磁性石墨烯，由包括以下步骤的方法制备而成：将磁性纳米颗粒和石墨烯材料分散于水中，混合均匀即得；石墨烯材料和磁性纳米颗粒的质量比为1：(1-10)。
本发明的磁性石墨烯，制备过程简单，对石墨烯材料的缺陷少、规整度高，与烟草特有N-亚硝胺的疏水和π-π作用强，有助于样品中烟草特有N-亚硝胺的特异性吸附，可实现主流烟气、烟草及烟草制品中目标分析物的高效净化，从而降低后续分析干扰，提高检测灵敏度。
所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁或硅胶包覆的四氧化三铁。所述石墨烯材料为石墨烯、氨基修饰石墨烯、羧酸修饰石墨烯中的至少一种。
为提供石墨烯材料和磁性纳米颗粒的混合效率，优化混合效果，优选的，所述混合为涡旋混合。进一步优选的，所述涡旋混合的转速为800-1500rpm，时间为3-5分钟。每毫升水对应石墨烯材料的用量为5-50mg。
附图说明
图1为石墨烯材料及磁性石墨烯材料的透射电镜图，其中，A为粒径为80nm的Fe3O4颗粒、B为石墨烯、C为由A和B制备得到的磁性石墨烯、D为粒径为400nm的Fe3O4颗粒、E为D包硅处理后得到的Fe3O4@SiO2、F为由B和E制备得到的磁性石墨烯；
图2为Fe3O4(A)和Fe3O4@SiO2(B)对主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的吸附效果图；
图3为不同基团修饰石墨烯对目标分析物的萃取效果比较；
图4为盐浓度对萃取效果的影响及经过样品前处理后与直接进样的峰面积比较；
图5为不同有机溶剂及其含量对萃取效果的影响结果；
图6为不同有萃取时间对萃取效果的影响；
图7为吸附剂质量对萃取效果的影响；
图8为分析肯塔基3R4F参比卷烟得到的4种烟草特有N-亚硝胺的典型色谱图；
图9为本方法与CORESTA推荐方法测定NNN得到的结果比较；
图10为本方法与CORESTA推荐方法测定NNK得到的结果比较。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。
以下实施例中，Fe3O4颗粒可由溶剂热法和共沉淀法制得：溶剂热法制备时，在反应釜内将六水合氯化铁溶解在乙二醇中并通过不断搅拌得到澄清的溶液，之后再依次加入乙酸钠和聚乙二醇10000。将上述混合物放在磁力搅拌器上剧烈搅拌，取出磁子后将反应釜密封并置于200℃反应。待反应釜的温度降至室温后用水和乙醇充分清洗反应产物，之后将黑色的四氧化三铁颗粒干燥后备用，可以通过调整反应时间来调整Fe3O4颗粒的粒径。
共沉淀法制备时，将亚铁盐和三价铁盐的混合溶液加入到三口瓶中，加入氨水后在氮气保护作用下剧烈搅拌反应。反应结束后用水和乙醇充分清洗反应产物，之后将黑色的四氧化三铁颗粒干燥后备用。
硅胶包覆的Fe3O4颗粒由以下步骤制得：将120mg Fe3O4颗粒分散在139mL纯水中，之后加入467mL乙醇和15mL氨水(质量浓度为25％)。待充分搅拌均匀后，在不断搅拌的条件下将6mL四乙氧基硅烷加入到上述反应体系。室温下不断搅拌反应12h后，用乙醇清洗产物并干燥即可。
磁性石墨烯分散液由以下步骤制得：将Fe3O4颗粒或Fe3O4@SiO2颗粒与石墨烯材料分散于水中，以800-1500rpm的速度涡旋混合3-5分钟，即得。Fe3O4颗粒或Fe3O4@SiO2颗粒与石墨烯材料的质量比为(1-10)：1，两者的质量比与Fe3O4、Fe3O4@SiO2颗粒的粒径有关，可依据在磁固相萃取中石墨烯的回收快慢情况进行调整。
石墨烯可采用化学还原氧化石墨烯的方法制备，氨基化石墨烯、羧酸化石墨烯均为市售常规商品，购自南京先丰纳米材料科技有限公司。
实施例1
本实施例的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，采用以下步骤制备样品待测溶液：向肯塔基3R4F参比卷烟主流烟气总粒相物(抽吸5支卷烟)中加入15mL 0.1mol/L的乙酸铵溶液后进行超声提取30min，取上层清液为样品提取液。
向10mL样品提取液中加入磁性石墨烯分散液0.5mL(以石墨烯计的浓度为20mg/mL)，涡旋10min后在磁铁作用下弃去上清液，加入2.0mL丙酮解吸5.0min，得到样品待测溶液。
磁性石墨烯分散液由80nm的Fe3O4颗粒与石墨烯按质量比1:1以1000rpm速度涡旋混合3分钟而成。
实施例2-3
实施例2-3的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例1基本相同，区别仅在于，实施例2使用氨基化石墨烯，实施例3使用羧酸化石墨烯。
实施例4
本实施例的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，参考实施例1的方法制备样品提取液，然后向样品提取液中加入NaCl(控制浓度为20mmol L-1)，加入磁性石墨烯分散液0.5mL(以石墨烯计的浓度为20mg/mL)，涡旋20min后在磁铁作用下弃去上清液，加入1.0mL的乙腈解吸5.0min，得到样品待测溶液。
实施例5-9
实施例5-9的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例4基本相同，区别仅在于，控制体系中NaCl的浓度分别为0mmol L-1、50mmol L-1、100mmol L-1、200mmol L-1和500mmol L-1。
实施例10
本实施例的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，参考实施例1的方法制备样品提取液，然后向样品提取液中加入1vol％的乙腈，加入磁性石墨烯分散液0.5mL(以石墨烯计的浓度为20mg/mL)，涡旋20min后在磁铁作用下弃去上清液，加入1.0mL的乙腈解吸5.0min，得到样品待测溶液。
实施例11-17
实施例11-17的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例10基本相同，区别仅在于，分别向样品提取液中加入2％乙腈、5％乙腈、10％乙腈，1％丙酮、2％丙酮、5％丙酮、10％丙酮。
实施例18
本实施例的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例1基本相同，区别仅在于，在丙酮中加入1％(v/v)的甲酸作为解吸溶剂，在磁铁作用下弃去上清液后以1.0mL上述解吸溶剂重复三次，每次解吸时间为5.0min。
实施例19
本实施例的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例18基本相同，区别仅在于，在丙酮中加入1％(v/v)的氨水作为解吸溶剂。
实施例20-23
实施例20-23的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例1基本相同，区别仅在于，涡旋时间分别为1.0min、2.0min、5.0min和20.0min。
实施例24-28
实施例24-28的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的提取方法，与实施例1基本相同，区别仅在于，加入不同体积的磁性石墨烯分散液，使石墨烯的加入质量分别为0.25mg、0.50mg、1.0mg、2.5mg和5.0mg。
实施例29
本实施例的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：
1)标准系列溶液的配制：以甲醇和0.1mol/L乙酸铵溶液(体积比为1：1)为溶剂，以4种烟草特有N-亚硝胺(N-亚硝基降烟碱NNN、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮NNK、N-亚硝基新烟碱NAT和N-亚硝基假木贼碱NAB)和4种同位素内标(NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4)的标准品为溶质，配制不同浓度的含内标的系列标准溶液；
系列标准溶液中4种烟草特有N-亚硝胺的浓度梯度均为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50ng/mL，且NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4内标浓度均为10ng/mL。
2)样品提取液的制备：在肯塔基3R4F参比卷烟主流烟气总粒相物(抽吸5支卷烟)中依次加入4种同位素内标(NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4和NAB-d4，加入量均为150ng)和15mL0.1mol/L的乙酸铵溶液后进行超声提取30min，取上层清液为样品提取液。卷烟主流烟气总粒相物的捕集按照GB/T 19609-2004、ISO 4387︰2000规定的条件的进行。
3)样品提取液的净化：向10mL样品提取液中加入磁性石墨烯分散液0.3mL(以石墨烯计的浓度为10mg/mL)，涡旋萃取3.0min后，分离出吸附有目标分析物和内标的磁性石墨烯，用2.0mL的丙酮进行洗脱解吸，将解吸液于35℃下用氮气流浓缩至0.1mL，转移至内置衬管的色谱瓶中，即得待测溶液。
磁性石墨烯分散液由粒径为80nm的Fe3O4颗粒和石墨烯按质量比1：1分散于水中，涡旋混合得到。
4)将系列标准溶液和待测溶液在相同条件下进行液相色谱-串联质谱分析，条件为：色谱柱：Poroshell 120EC-C18；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相为0.01mol/L甲酸铵(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；流速：0.4mL/min；流动相梯度程序：t＝0min，10％B，t＝2.0min，40％B，t＝4.0min，60％B，t＝6.0min，90％B，t＝9.0min，90％B，t＝9.5min，10％B，t＝15.0min，10％B；质谱条件：电喷雾电压5000V；雾化气压力50psi；辅助雾化气压力50psi；气帘气压力35psi；离子源温度450℃；进口电压8V；出口电压10V；去簇电压40V；驻留时间40ms；监测方式：多反应监测；目标分析物及内标的保留时间多反应监测参数如表1所示：
表1目标分析物及内标的保留时间多反应监测参数表
5)样品中4种烟草特有N-亚硝胺的定量：由烟草特有N-亚硝胺的峰面积和内标峰面积之比进行定量。具体操作过程为：以标准系列溶液中烟草特有N-亚硝胺的峰面积和相应内标峰面积之比为纵坐标，标准系列溶液中烟草特有N-亚硝胺的浓度为横坐标，绘制工作曲线；根据样品溶液中烟草特有N-亚硝胺峰面积和相应内标峰面积之比，依据工作曲线，得到样品中烟草特有N-亚硝胺的含量，其计算公式为其中x为目标物与内标物的峰面积之比，m为样品中目标物的含量(单位为ng/g或ng/支)，a和b为工作曲线中的斜率和截距，均由工作曲线求出，V为提取液的体积(单位为mL)，n为样品量(单位为克或支)。
分析目标分析物标准工作溶液，以目标分析物和内标的峰面积之比对目标分析物浓度作工作曲线(权重为1/x)，分别以3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限，结果如表2所示。
表2本发明测定方法的线性范围、工作曲线、检测限和定量限
表2的结果表明，4种目标分析物在各自的线性范围内具有较好的线性关系，其工作曲线的线性相关系数的平方不小于0.9992，目标分析物的检出限和定量限分别在0.006-0.019ng/mL和0.020-0.062ng/mL之间。
进一步考察该方法的重复性和准确性，向样品中添加3种浓度的目标分析物(低、中、高3种浓度分别为各目标分析物线性范围最低值的2、10和100倍)，然后按同样的操作进行磁固相萃取，1d内重复分析5次，通过标准工作曲线计算得到实际检测值，并计算不同浓度下的回收率和日内相对标准偏差；以连续3d制备的样品进行测定，计算不同浓度下的回收率和日间相对标准偏差，结果如表3所示。
表3目标分析物在不同浓度下的回收率和精密度
表3的检测结果表明，实际样品中目标分析物在不同浓度下的加标回收率为89.3％-109.4％，日内及日间精密度分别不大于11.2％和10.1％。以上说明该方法的重复性和稳定性等可以满足烟草特有N-亚硝胺的日常检测需求。
实施例30-37
实施例30-37的卷烟主流烟气、烟草及烟草制品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，参考实施例29的测定步骤，称取7种烟草及烟草制品各1.0g，依次进提取和磁性石墨烯固相萃取净化，以液相色谱-串联质谱仪分析标准系列溶液和样品溶液，分析其中烟草特有N-亚硝胺含量。
为了比较方法的准确性，同时采用国标方法和CORESTA推荐方法对相同样品进行分析，结果如表4所示。
表4不同烟草及烟草制品中目标分析物的检测结果(ng/g)
(注：括号中为国标或CORESTA推荐方法得到的结果。)
由表4的结果可知，本方法与国标或CORESTA推荐方法得到的结果一致性良好，说明本方法的测定结果准确可靠。
对比例1
对比例1的烟草特有N-亚硝胺的测定方法，按实施例1的方法制备样品提取液，将50mg Fe3O4颗粒(粒径为80nm)置于10mL提取液中，不断涡旋，然后分别在第0、2、5、10、20、40min取上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。
对比例2
对比例2的烟草特有N-亚硝胺的测定方法，在对比文件1的Fe3O4颗粒的基础上制备硅胶包覆的Fe3O4颗粒(采用stobers法制备，Fe3O4@SiO2)，然后参考实施例1的方法进行目标分析物分析。
对比例3
对比例3的烟草特有N-亚硝胺的测定方法，Fe3O4颗粒的粒径为400nm，然后参考对比例1的方法进行目标分析物分析。
试验例1
本试验例对Fe3O4颗粒、Fe3O4@SiO2颗粒、Fe3O4/石墨烯、Fe3O4@SiO2/石墨烯进行TEM分析，结果如图1所示。
图1中，A为粒径为80nm的Fe3O4颗粒、B为石墨烯、C为由A和B制备得到的磁性石墨烯、D为粒径为400nm的Fe3O4颗粒、E为D包硅处理后得到的Fe3O4@SiO2、F为由B和E制备得到的磁性石墨烯。
由图1可以看出，水热法制备的Fe3O4纳米颗粒为均匀球形结构，具有很窄的粒径分布，其平均粒径分别约为80nm和400nm(图1A和1D)；包裹硅胶的四氧化三铁(Fe3O4@SiO2)表面可以清晰地观察到硅胶层的形成(图1E)，该硅胶层可以有效地避免四氧化三铁在酸性介质下的溶解和腐蚀；石墨烯为透明丝绸状，同时也能看到到一些正常的皱褶和弯曲(图1B)；不同磁性石墨烯(图1C和1F)中，磁颗粒嵌入石墨烯片层之间或附着在片层结构上，同时也观察到了部分磁颗粒是游离于石墨烯片层结构之外的，这些与石墨烯共存的磁颗粒赋予了石墨烯磁分离的优点。
试验例2
对比例1和对比例2的分析结果如图2所示，结果表明，4种目标分析物在所考察的时间内峰面积没有变化，且用两种磁颗粒吸附时目标分析物的峰面积没有显著差异，说明Fe3O4和Fe3O4@SiO2对主流烟气中烟草特有N-亚硝胺的吸附效果均可以忽略。
对对比例1和对比例3的目标分析物的峰面积进行对比分析，不同粒径Fe3O4对目标分析物的影响也可忽略。
试验例3
本实施例考察实施例1-3中，不同性质的石墨烯对目标分析物萃取效果的影响，对以上实施例得到的样品待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，结果如图3所示。
由图3可以看出，石墨烯对目标分析物的萃取效率是氨基修饰石墨烯的1.35-1.89倍、是羧酸修饰石墨烯的1.08-1.55倍。石墨烯对目标分析物的萃取效果最佳，也说明了石墨烯与目标分析物之间的疏水和π-π作用较强。
试验例4
本试验例考察实施例4-9中，无机盐对萃取效率的影响，对以上实施例得到的样品待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，结果如图4所示。
由图4可以看出，在所考察的范围内，目标物的萃取效率没有明显的变化。由于目标分析物和吸附剂在样品溶液中的存在形式受盐浓度影响不大，所以盐浓度对目标物的萃取效率没有太大影响。为了保证样品预处理过程的简单，在样品溶液中可不添加无机盐。
同时，与直接进样分析相比，4种目标分析物的峰面积具有显著提高，证明了样品前处理过程对目标分析物具有富集效果。
试验例5
本试验例考察实施例10-17中，添加有机溶剂对萃取效率的影响，对以上实施例得到的样品待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，结果如图5所示。
图5中，从图中可以看到随着样品溶液中有机溶剂含量的增大，目标分析物的萃取效率呈降低趋势，同时丙酮的加入对萃取效率的降低程度强于乙腈。这是可能是由于目标分析物与磁性石墨烯之间存在着疏水和π-π相互作用，因而有机溶剂含量的增大会降低其萃取效率，且丙酮的降低幅度大于乙腈。考虑到目标分析物的萃取效率和样品制备过程的简单性，在上样液中可不添加有机溶剂。
试验例6
本试验例考察实施例18-19中，解吸溶剂对解吸效果的影响，对以上实施例得到的样品待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，结果如表5所示。
表5不同解吸溶剂对目标分析物的解吸效率(％)
由表5的结果可知，丙酮中添加酸或碱对目标分析物的解吸效果影响不大，纯丙酮、1％甲酸丙酮和1％氨水丙酮对4种目标分析物的前两次解吸效率分别不小于92.8％、93.3％和92.1％，即目标分析物均能被2.0mL解吸液解吸92％以上。考虑到解吸效率和配制解吸液时的操作简单，可选用丙酮作为解吸溶剂。
试验例7
本试验例考察实施例1、实施例20-23中，涡旋时间对目标分析物萃取效率的影响，对以上实施例得到的样品待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，结果如图6所示。
由图6可知，在1.0-2.0min的范围内，目标分析物的峰面积随着萃取时间的延长而增大；当萃取时间大于2.0min时，随着萃取时间的延长，被分析物的峰面积增加不是很明显。由于吸附剂在萃取时是分散在整个样品溶液中的，因此可以很快地达到萃取平衡。为了保证在较短的萃取时间内获得较好、且稳定的萃取效果，萃取时间可设定为3.0min。
试验例8
本试验例考察实施例1、实施例24-28中，石墨烯用量对目标分析物的萃取效果，对以上实施例得到的样品待测溶液进行液相色谱-串联质谱分析，结果如图7所示。
由图7可知，被分析物的峰面积在石墨烯的加入量为0.25到2.5mg范围内有显著的增加，说明了石墨烯对目标分析物优良的萃取效果，这主要是石墨烯大的比表面积及其与目标分析物分子之间的疏水和π-π电子堆积作用引起的。当石墨烯的用量由2.5mg继续增加时，目标分析物的峰面积仍在不断增加，只是增加速度变得缓慢。综合考虑灵敏度和石墨烯用量，可将石墨烯的用量定为3.0mg。
试验例9
实施例29中，石墨烯的用量为3.0mg，萃取时间为3.0min，用2.0mL丙酮解吸，在该优选条件下对肯塔基3R4F参比卷烟主流烟气粒相物进行分析，得到的目标分析物的典型色谱图如图8所示，没有干扰物质影响目标分析物的定量，说明了该样品前处理过程对实际样品具有较好的净化能力。
以实施例29的方法测定国内市售卷烟中4中烟草特有N-亚硝胺。以CORESTA推荐方法对相同样品进行分析，以CORESTA推荐方法测定值为横坐标，以本方法测定值为纵坐标作图，显示两种一级致癌物(NNN和NNK)的测定结果，结果如图9和图10所示。
由图9和图10可以看出，本方法与CORESTA推荐方法分析NNN和NNK时结果具有较好的一致性，测定结果的相对标准偏差均小于10％，说明本发明具有良好的可靠性。
在其他样品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法的实施例中，样品提取液不限于乙酸铵溶液，其能够对烟草特有N-亚硝胺进行有效提取即可，如可以为甲酸铵溶液等。磁性石墨烯中，磁颗粒和石墨烯的相对质量可以依据磁颗粒的粒径、磁分离的情况进行适应性调整；涡旋混合可以为超声、振荡混合方式进行替换；在获得样品待检测液前提下，检测手段可以不限于液相色谱-质谱联用，可以利用其它本领域公知的检测分析技术，如气相色谱-热能分析、气相色谱-质谱分析等手段来实现烟草特有N-亚硝胺的检测。
本发明磁性石墨烯的实施例，与上述实施例中磁性石墨烯的制备方式相同，磁性石墨烯中，磁性纳米颗粒与石墨烯材料的质量比可依据Fe3O4颗粒、Fe3O4@SiO2颗粒的粒径、石墨烯的回收快慢等实际情况进行调整，如可依据实施例1的方式，在Fe3O4颗粒的粒径为10nm时，选择石墨烯与Fe3O4颗粒的质量比为1：5，将各原料分散于水中后，以800rpm的速度涡旋混合5min，可得到效果相当的磁性石墨烯分散液。
在其他实施情形下，可依据实施例1的方式，选择Fe3O4@SiO2颗粒为磁性纳米颗粒，在该磁性纳米颗粒的粒径为200nm时，选择石墨烯与磁性纳米颗粒的质量比为1：9，将各原料分散于水中后，以1500rpm的速度涡旋混合3min后，可得到耐酸溶解和腐蚀的磁性石墨烯分散液。
以上石墨烯材料和磁性纳米颗粒的比例没有特殊限制，根据石墨烯的回收快慢在1：(1-10)之间进行调整即可，磁性石墨烯分散液中，以石墨烯材料计的浓度可在10-50mg/mL之间调整，可获得与实施例1相当的试验效果。

Claims (10)

1.一种用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：向样品提取液中加入磁性石墨烯进行萃取，然后对吸附在磁性石墨烯上的目标分析物进行洗脱，收集洗脱液即为待测溶液。
2.如权利要求1所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，所述磁性石墨烯由石墨烯材料和磁性纳米颗粒复合而成。
3.如权利要求2所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，所述石墨烯材料为石墨烯、氨基修饰石墨烯、羧酸修饰石墨烯中的至少一种。
4.如权利要求2所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁或硅胶包覆的四氧化三铁。
5.如权利要求2-4中任一项所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，石墨烯材料和磁性纳米颗粒的质量比为1：(1-10)。
6.如权利要求1所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，所述样品提取液是使用甲酸铵溶液或乙酸铵溶液对样品提取得到的。
7.如权利要求1或6所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，样品为卷烟主流烟气总粒相物、烟草和/或烟草制品。
8.如权利要求1所述的用于烟草特有N-亚硝胺测定的样品前处理方法，其特征在于，洗脱时所用的洗脱溶剂为丙酮、乙腈、丙酮与甲酸的混合溶剂、丙酮与氨水的混合溶剂中的至少一种。
9.一种样品中烟草特有N-亚硝胺的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向含有内标物的样品提取液中加入磁性石墨烯进行萃取，然后对吸附在磁性石墨烯上的目标分析物进行洗脱，收集洗脱液得到洗脱溶液；
2)对洗脱溶液进行液相色谱-串联质谱分析，由烟草特有N-亚硝胺的峰面积和内标峰面积之比进行定量，即得。
10.一种磁性石墨烯，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备而成：将磁性纳米颗粒和石墨烯材料分散于水中，混合均匀即得；石墨烯材料和磁性纳米颗粒的质量比为1：(1-10)。
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