CN109490452B

CN109490452B - 一种同时检测茶叶中6种合成甜味剂的方法

Info

Publication number: CN109490452B
Application number: CN201811286658.8A
Authority: CN
Inventors: 王晨; 诸力; 刘新; 鲁成银
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109490452A

Abstract

本发明公开了一种同时检测茶叶中6种合成甜味剂的方法，所述方法为，茶叶样品用体积比1:1的乙腈、水混合溶液提取，然后加入吸附剂对样品提取液进行分散固相萃取净化，所述吸附剂为石墨化炭黑或多壁碳纳米管或两者的混合，然后经液相色谱‑串联质谱仪分析，在负离子模式下，进行多反应监测测定，根据标准曲线和外标法定量，检测计算得到茶叶中6种合成甜味剂的含量；所述6种合成甜味剂为甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜或纽甜。本发明方法仅需要对茶叶样品进行一次提取，操作简便，适用于单次实验处理大批量样品，净化效果佳，减少对仪器的污染，一次样品分析可完成对6种合成甜味剂的同时检测，实现了高通量检测。

Description

一种同时检测茶叶中6种合成甜味剂的方法

技术领域

本发明属于化学分析方法技术领域，具体涉及一种茶叶中6种合成甜味剂的检测方法。

背景技术

茶叶的感官品质包括外形、汤色、滋味、香气和叶底等方面，其中滋味和香气起了重要的作用。根据《GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》和茶叶相关的产品标准，茶叶中不得使用食品添加剂；调味茶虽然可使用食品添加剂，但目前允许使用的添加剂仅有甜菊糖苷。但是，由于产地气候、采摘时节、鲜叶嫩度、加工工艺等原因，一些茶叶及其制成的调味茶感官品质不佳，香气不足，苦味、涩味重。茶叶生产者存在通过违法添加甜味剂改善茶叶滋味和香气的动机。

甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜是目前常用的合成甜味剂。出入境行业标准《出口食品中六种合成甜味剂的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》(SN/T 3538-2013)中规定了奶粉、液态奶、酸奶、奶油、奶酪、冰激凌、红酒、果汁、糕点、蜜饯、甜酸藠头中这6种合成甜味剂的测定方法。但茶叶基质成分复杂，与这些基质差别较大，直接将方法移植到茶叶上难以适用。其他标准方法，如《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》(GB 5009.28-2016)、《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》(GB5009.247-2016)和《食品安全国家标准食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》(GB5009.263-2016)，并不专用于茶叶基质，也无法同时测定6种合成甜味剂。现有发表的文献中，合成甜味剂的检测方法也多用于液体茶饮料，不适用于干茶叶。

因此，开发一种简便、快速、灵敏的同时分析茶叶中甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的检测方法，可以满足茶叶中违法添加合成甜味剂的识别需要，具有很强的实用价值。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种同时检测茶叶中6种合成甜味剂的方法，可一次性检测6种合成甜味剂，实现了高通量，且提取方法简便，结果准确。

本发明采用的技术方案是，

一种同时检测茶叶中6种合成甜味剂的方法，所述方法为，茶叶样品用体积比1:1的乙腈、水混合溶液提取，然后加入吸附剂对样品提取液进行分散固相萃取净化，所述吸附剂为石墨化炭黑或多壁碳纳米管或两者的混合，然后经液相色谱-串联质谱仪分析，在负离子模式下，进行多反应监测测定，根据标准曲线和外标法定量，检测计算得到茶叶中6种合成甜味剂的含量；所述6种合成甜味剂为甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜或纽甜。

进一步，所述方法具体包括以下步骤：

(1)样品提取：称取2g(通常精确到0.01g)粉碎后的茶叶样品于离心管，加入20mL体积比1:1的乙腈、水混合溶液，在振荡器上振荡30分钟，离心，得上清液A备用；

(2)样品净化：取步骤(1)的上清液A 1.00mL至含有吸附剂的离心管中，涡旋振荡1分钟，离心，取1mL上清液B经0.22μm滤膜过滤，所得滤液作为样品溶液，待液相色谱-串联质谱仪检测；所述吸附剂为下列之一：200mg石墨化炭黑、50mg多壁碳纳米管、100mg石墨化炭黑与25mg多壁碳纳米管的混合；

(3)将步骤(2)所得样品溶液进行液相色谱-串联质谱仪检测，得样品溶液的液相色谱图，色谱条件为：使用以C18为填料的色谱柱，梯度洗脱，流速0.25mL/min，流动相A为含体积分数0.1％的甲酸和1mmol/L甲酸铵的甲醇溶液，流动相B为含体积分数0.1％甲酸和1mmol/L甲酸铵的水溶液；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测，离子源极性为负离子；

(4)配制标准溶液

以不含6种目标合成甜味剂的空白茶叶样品经步骤(1)和(2)处理获得空白样品溶液，取甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜或纽甜的标准品用水配制标准溶液，然后用空白样品溶液稀释标准溶液，得到不同标准品浓度的基质匹配标准溶液，所述基质匹配标准溶液中空白样品溶液的体积占比不低于95％，将基质匹配标准溶液按步骤(3)相同条件进行液相色谱-串联质谱仪检测，得基质匹配标准溶液的液相色谱图，分别对各个标准品，按照其浓度和峰面积，绘制得到6种标准品的标准曲线；

(5)根据步骤(3)样品溶液的液相色谱图中各待测成分的峰面积及其对应的标准品的标准曲线，计算出样品溶液中各待测成分的浓度，并换算得到茶叶样品中甜味剂含量。

进一步，所述步骤(4)中，绘制标准曲线时经方法验证，6种合成甜味剂标准曲线的线性关系良好(R＞0.9990)且截距接近于0，因此步骤(5)的样品定量计算可以按以下方法简化计算：

根据步骤(3)中样品溶液的液相色谱图中各待测成分的峰面积及其对应的标准品的液相色谱图中的峰面积，以下列公式计算茶叶样品中甜味剂含量：

其中，X为茶叶样品中待测甜味剂含量，单位mg/kg；A为样品溶液中甜味剂的峰面积，c_s为标准溶液浓度，单位mg/L，V为提取溶剂体积，20mL，m为茶叶样品质量，单位g，A_s为标准溶液中甜味剂的峰面积。

进一步，所述步骤(3)中，所述梯度洗脱的程序优选为：

初始流动相B的体积分数为90％，保持1分钟；然后在7分钟内变换流动相B的体积分数为10％，保持2分钟；再在0.1分钟内变换流动相B的体积分数为90％，保持3.9分钟。

即如下表1所示：

表1液相色谱-串联质谱分析6种合成甜味剂的液相色谱梯度洗脱程序

时间min	流动相A的体积分数％	流动相B的体积分数％
			0	10	90
1	10	90
			8	90	10
10	90	10
			10.1	10	90
14	10	90

所述步骤(1)中，所述离心通常以4700rpm转速离心5分钟。

所述步骤(2)中，所述离心通常是以15000rpm转速离心5分钟。

所述步骤(3)中，优选采用ACQUITY HSS T3色谱柱。

液相色谱的柱温箱温度为40℃，进样量为1μL；

所述步骤(3)中，质谱条件优选为：气帘气压力为35psi，碰撞气压力为7psi，离子喷雾电压为-4500V，离子源温度为500℃，雾化气压力为50psi，辅助气压力为50psi；

本发明中，所用的石墨化炭黑的平均粒径为120-400目。

本发明中，所述多壁碳纳米管的直径1～30nm，长度1～100μm，优选10～20μm。

所述步骤(4)中，所述空白样品溶液是指，将不含6种目标合成甜味剂的空白茶叶样品经按照步骤(1)和(2)的方法处理，经过样品提取和样品净化，获得的空白样品溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)方法仅需要对茶叶样品进行一次提取，使用有机溶剂少，避免了繁琐的多次提取操作。

2)方法使用分散固相萃取进行样品净化，操作简便，适用于单次实验处理大批量样品，并能大量吸附色素等非目标物，净化效果佳，减少对仪器的污染。

3)一次样品分析可完成对6种合成甜味剂的同时检测，实现了高通量检测。

具体实施方式

现结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

1)样品制备

茶叶样品经粉碎机粉碎至粉末。

2)样品前处理

准确称取2.00g茶叶样品于50mL具塞离心管，加入20mL乙腈/水(1:1，v/v)，在振荡器上振荡30分钟，以4700rpm离心5分钟。移取1.00mL上清液至含有200mg石墨化炭黑或50mg多壁碳纳米管或100mg石墨化炭黑与25mg多壁碳纳米管混合的2mL离心管，涡旋振荡1分钟，以15000rpm离心5分钟，取1mL上清液经尼龙滤器(13mm，0.22μm)，所得滤液作为样品溶液，待液相色谱-串联质谱分析。

3)标准溶液配制

以不含6种目标合成甜味剂的空白茶叶样品经按照步骤2)的方法获得空白样品溶液。以空白样品溶液稀释标准溶液，空白样品液体积占比不低于95％，获得基质匹配标准溶液，待液相色谱-串联质谱分析。

4)液相色谱-串联质谱分析

液相色谱条件：使用ACQUITY HSS T3色谱柱(1.8μm，2.1×100mm)。以梯度洗脱，流速保持0.25mL/min。流动相A为甲醇(含0.1％甲酸和1mmol甲酸铵)，流动相B为水(含0.1％甲酸和1mmol甲酸铵)；初始为90％B，保持1分钟；在7分钟内变换B为10％，保持2分钟；在0.1分钟内变换为90％，保持3.9分钟。柱温箱温度为40℃。进样量为1μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测，离子源极性为负离子。气帘气压力为35psi，碰撞气压力为7psi，离子喷雾电压为-4500V，离子源温度为500℃，雾化气压力为50psi，辅助气压力为50psi。

各化合物的离子对、去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能(CE)和碰撞室出口电压(CXP)和保留时间如下表2。

表2液相色谱-串联质谱分析6种合成甜味剂的质谱参数

5)定量

根据基质匹配标准溶液的液相色谱图，分别对各个标准品，按照其浓度和峰面积，绘制得到6种标准品的标准曲线；根据样品溶液的液相色谱图中各待测成分的峰面积及其对应的标准品的标准曲线，计算出样品溶液中各待测成分的浓度，并换算得到茶叶样品中甜味剂含量。

实施例2：

对采用3种不同分散固相萃取吸附剂的检测方法进行添加回收试验，分别以绿茶和红茶为基质，6种合成甜味剂的添加水平分别为0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg。

添加回收试验结果如表3。以石墨化炭黑作为分散固相萃取吸附剂时，绿茶中6种合成甜味剂的平均回收率为92.9％-106.9％，相对标准偏差均小于3.8％；红茶中6种合成甜味剂的平均回收率为84.4％-99.5％，相对标准偏差均小于4.4％。以多壁碳纳米管作为分散固相萃取吸附剂时，绿茶中6种合成甜味剂的平均回收率为89.5％-99.9％，相对标准偏差均小于4.6％；红茶中6种合成甜味剂的平均回收率为86.2％-102.2％，相对标准偏差均小于7.3％。以石墨化炭黑和多壁碳纳米管混合作为分散固相萃取吸附剂时，绿茶中6种合成甜味剂的平均回收率为91.5％-101.8％，相对标准偏差均小于9.6％；红茶中6种合成甜味剂的平均回收率为83.3％-103.5％，相对标准偏差均小于4.4％。采用3种不同分散固相萃取吸附剂的检测方法准确度和精密度可以满足检测的要求。

表3茶叶中6种合成甜味剂的检测方法添加回收试验结果

实施例3：

对采用3种不同分散固相萃取吸附剂的检测方法验证6种合成甜味剂的线性关系，配制浓度分别为0.0005mg/L、0.001mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L的绿茶和红茶基质匹配标准溶液，以1/c_s为权重拟合线性标准曲线。折算信噪比为10时的样品中浓度为方法定量限。

标准曲线的线性关系和定量限如表4。在相应的线性范围内，绿茶和红茶中6种甜味剂的线性相关系数均大于等于0.9990，3种方法具有良好的线性关系。以石墨化炭黑作为分散固相萃取吸附剂时，绿茶和红茶中甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的定量限分别均能达到0.0093mg/kg、0.12mg/kg、0.036mg/kg、0.091mg/kg、0.022mg/kg和0.0048mg/kg；以多壁碳纳米管作为分散固相萃取吸附剂时，绿茶和红茶中甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的定量限分别均能达到0.017mg/kg、0.078mg/kg、0.011mg/kg、0.19mg/kg、0.046mg/kg和0.0042mg/kg；以石墨化炭黑和多壁碳纳米管混合作为分散固相萃取吸附剂时，绿茶和红茶中甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的定量限分别均能达到0.011mg/kg、0.085mg/kg、0.020mg/kg、0.27mg/kg、0.018mg/kg和0.0038mg/kg；可以满足茶叶中检测的需要。

表4茶叶中6种合成甜味剂的检测方法标准曲线的线性关系和定量限

由于6种合成甜味剂标准曲线的线性关系良好(R＞0.999)且截距接近于0，因此步骤(5)的样品定量计算可以按以下方法简化计算：

以下列公式计算茶叶样品中甜味剂含量：

实施例4：

比较3种提取条件的提取效果，3种提取条件分别为20mL体积比1:1的乙腈/水混合溶液、20mL体积比1:1的甲醇/水混合溶液、20mL乙腈和5mL水经3g氯化钠盐析分层后取上层乙腈。进行回收试验，以红茶为基质，6种合成甜味剂的添加水平均为0.1mg/kg，不经净化直接分析。

试验结果如表5。使用乙腈和水盐析时，6种合成甜味剂的平均回收率为21.5％-70.8％，仅纽甜的回收率达到70％以上，满足方法对准确度的要求。使用甲醇/水和乙腈/水时，6种合成甜味剂的平均回收率分别为79.1％-94.5％和87.6％-96.6％。两种条件的回收率均满足方法要求。乙腈/水的平均回收率均更接近100％，准确度优于甲醇/水。

表5不同提取条件的添加回收试验结果

实施例5：

比较石墨化炭黑、多壁碳纳米管、石墨化炭黑与多壁碳纳米管混合和N-丙基乙二胺键合硅胶(PSA)作为分散固相萃取吸附剂的净化效果。进行回收试验，以红茶为基质，6种合成甜味剂的添加水平均为0.1mg/kg，分散固相萃取吸附剂分别为200mg石墨化炭黑、50mg多壁碳纳米管或100mg石墨化炭黑与25mg多壁碳纳米管混合和200mg N-丙基乙二胺键合硅胶。

试验结果如表6。使用石墨化炭黑时，6种合成甜味剂的平均回收率为84.4％-102.9％；使用多壁碳纳米管时，6种合成甜味剂的平均回收率为87.7％-101.9％；使用石墨化炭黑和多壁碳纳米管混合时，6种合成甜味剂的平均回收率为86.3％-97.9％；3种方法具有良好的准确度。使用N-丙基乙二胺键合硅胶时，阿斯巴甜、阿力甜和纽甜的平均回收率为83.1％-88.2％，准确度良好；但甜蜜素、糖精钠和安赛蜜的平均回收率为54.5％-60.3％，准确度无法满足定量检测的要求。

表6不同分散固相萃取吸附剂的添加回收试验结果

实施例6：

根据实施例1的检测方法和实施例3的简化计算方法，净化剂选用石墨化炭黑，检测10个茶叶样品和7个调味茶样品中待测成分的含量。10个茶叶样品中均未检出6种合成甜味剂；7个调味茶样品中2个检出合成甜味剂，一个样品中甜蜜素含量为0.29mg/kg，另一个样品中纽甜含量为0.49mg/kg。

Claims

1.一种同时检测茶叶中6种合成甜味剂的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）样品提取：称取2g粉碎后的茶叶样品于离心管，加入20 mL体积比1:1的乙腈、水混合溶液，在振荡器上振荡30分钟，离心，得上清液A备用；

（2）样品净化：取步骤（1）的上清液A 1.00 mL至含有吸附剂的离心管中，涡旋振荡1分钟，离心，取1 mL上清液B经0.22μm滤膜过滤，所得滤液作为样品溶液，待液相色谱-串联质谱仪检测；所述吸附剂为下列之一：200 mg石墨化炭黑、50 mg多壁碳纳米管、100 mg石墨化炭黑与25 mg多壁碳纳米管的混合；

（3）将步骤（2）所得样品溶液进行液相色谱-串联质谱仪检测，得样品溶液的液相色谱图，色谱条件为：使用以C18为填料的色谱柱，梯度洗脱，流速0.25 mL/min，流动相A为含体积分数0.1%的甲酸和1mmol/L甲酸铵的甲醇溶液，流动相B为含体积分数0.1%甲酸和1mmol/L甲酸铵的水溶液；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测，离子源极性为负离子；

所述梯度洗脱的程序为：

初始流动相B的体积分数为90%，保持1分钟；然后在7分钟内变换流动相B的体积分数为10%，保持2分钟；再在0.1分钟内变换流动相B的体积分数为90%，保持3.9分钟；

（4）配制标准溶液

以不含6种目标合成甜味剂的空白茶叶样品经步骤（1）和（2）处理获得空白样品溶液，取甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜或纽甜的标准品用水配制标准溶液，然后用空白样品溶液稀释标准溶液，得到不同标准品浓度的基质匹配标准溶液，所述基质匹配标准溶液中空白样品溶液的体积占比不低于95%，将基质匹配标准溶液按步骤（3）相同条件进行液相色谱-串联质谱仪检测，得基质匹配标准溶液的液相色谱图，分别对各个标准品，按照其浓度和峰面积，绘制得到6种标准品的标准曲线；

（5）根据步骤（3）样品溶液的液相色谱图中各待测成分的峰面积及其对应的标准品的标准曲线，计算出样品溶液中各待测成分的浓度，并换算得到茶叶样品中甜味剂含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，质谱条件为：气帘气压力为35psi，碰撞气压力为7 psi，离子喷雾电压为-4500V，离子源温度为500℃，雾化气压力为50psi，辅助气压力为50 psi。