CN109329869B - 一种酱油鲜味基料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲜味基料及其制备方法，所述鲜味基料含有2‑(2‑氨基‑3‑甲基丁酰胺基)‑4‑甲基戊酸和环六亮肽；本发明还公开了含有上述鲜味基料的酱油，以及一种酱油中鲜味成分的鉴定方法。本发明首次公开了酱油中能够显著提高酱油鲜味的物质成份为环六亮肽和2‑(2‑氨基‑3‑甲基丁酰胺基)‑4‑甲基戊酸，为制备高品质酱油奠定了基础，并且为不同酱油酿造工艺生产的酱油品质鉴定提供了理论依据，同时对酱油进行有效的深加工，从中提取多功能物质，谋求更大的经济价值提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，尤其是一种酱油鲜味基料及其制备方法。
背景技术
酱油成分复杂，含有多肽、氨基酸、低聚糖、有机酸等多种组分，滋味是酱油质量的重要指标。但我国现行酿造酱油等级标准仅根据其氨基酸态氮含量的高低划分为特级、一、二、三级酱油，即特级：氨基酸态氮≥0.8g/100ml，一级：0.8g/100ml>氨基酸态氮≥0.7g/100ml，二级：0.7g/100ml>氨基酸态氮≥0.55g/100ml，三级：0.55g/100ml>氨基酸态氮≥0.4g/100ml。但实际上同等级酱油，即使氨基态氮含量相同，风味也存在较大区别，高品质酱油香气突出、鲜味醇厚、口感丰满、柔顺，因此，酱油中除氨基酸外还存在其他物质对其整体滋味产生关键影响。
有研究表明，呈味肽是指从食物中提取或由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的分子质量低于5000u的寡肽类，呈味肽无论对于加工食品还是未经加工的食品的风味都非常重要，呈味肽不仅能产生特征滋味，还可以作为挥发性风味物质的前体物质参与美拉德反应，形成特殊的芳香气味，呈味肽因含有氨基和羧基两性基团而具有缓冲能力，能赋予食品细腻微妙的风味，不仅可直接对基本味产生贡献，还可与其他氨基酸产生交互作用，明显提升或改变原有味感，使食品的总体味感协调、天然、醇厚浓郁。
呈味肽物质一般具有如下一些特征：（1）大都以低浓度存在，它们分布于大量的对风味并不重要的介质中，使得呈味肽物质的分离过程更加困难；（2）呈味肽物质具有复杂性，风味成份之间，呈味性质常常存在相互影响；（3）挥发性极高；（4）具有不稳定性以及与食品其他组分间存在动态平衡。呈味肽作为复合调味品的重要基料，符合“天然、营养、安全”的食品发展潮流，对于我国调味品及相关食品产业的发展，具有重要的意义。将呈味肽制成肽类调味品不仅可以改善食品品质，且可提高味觉感知度，增进消费者的食欲，并且呈味肽特殊的生理功能还具有药用价值，如亮肽素是由玫瑰链霉菌产生的胰蛋白酶抑剂，口服亮肽素有消炎作用和抗血液凝固的作用。
JPA-2008/247777公开了一系列从酵母抽提物中分离出的多肽物质，并以此厚味多肽复配得到一系列调味料产品，可广泛应用于食品产品中。CN104605306 A通过复配酵母抽提物、奶酪酶解物及已报道的厚味肽，呈现浓厚味特有的味觉特征，在食品领域有较广泛的应用前景；CN104605027A也报道了发酵豆奶中含有一系列结构为r-L-谷氨酰二肽化合物的浓厚味化合物；味之素公司测定了市售酱油中谷缬甘肽（r-Glu-Val-Gly）的含量为0.15-0.61mg/dl，但目前对于酱油中的鲜味基料的研究却较少。
已公开专利CN201410098321《一种酱油风味基料的制备方法》、CN201510330660《一种以酱油渣为主要原料制备风味呈味基料的方法》中均未从分子水平上揭示测定酱油风味基料的主要成分，并进行定量分析，因此，不能为制备高品质酱油提供有力的依据，同时也不能为不同酿造工艺酱油的品质鉴定提供理论依据。CN201510416942《一种白汤酱油中厚味肽的制备方法及其应用》中分离鉴定出厚味肽物质Glu-Gln-Gln-Pro-Glu，但并未定量分析添加该物质的适宜浓度。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种成分明确的酱油鲜味基料及其制备方法，以解决现有技术中酱油品质如何提升的问题，为制备高品质酱油奠定了基础，并且为不同工艺酿造酱油的品质鉴定提供了理论依据。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一种鲜味基料，所述鲜味基料含有2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽。应当说明的是，本发明的鲜味基料不仅可用于对酱油增鲜，还可以用于对其它调味品增鲜，例如鸡精、蚝油等。优选地，环六亮肽分子式为C36H67N6O6；2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸分子式为C11H23N2O3。
优选地，所述2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的质量比为1～3：4；更优选地，所述2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的质量比为1：2。本申请的发明人经多次试验发现，当鲜味基料中2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的质量比为1～3：4时，对佐料（例如酱油）的鲜味增加效果更好， 2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的质量比更优选为1：2。
在第二个方面，本发明提供了一种酱油，所述酱油含有上述的鲜味基料。
优选地，所述酱油中环六亮肽的浓度为382～430 mg/L；更优选地，所述酱油中环六亮肽的浓度为410～420 mg/L；最优选地，所述酱油中环六亮肽的浓度为420 mg/L。本申请的发明人经多次试验发现，当酱油中环六亮肽的浓度为382～430 mg/L时，能显著提高酱油的鲜味强度；而当酱油中环六亮肽的浓度为420mg/L时，酱油的鲜味强度增加最多。
在第三个方面，本发明提供了一种酱油鲜味基料的制备方法，包括如下步骤：
1）取酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥得到冻干粉；
2）将步骤1）所得冻干粉与去离子水配置成溶液，上柱后，用去离子水进行洗脱，收集；采用紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）步骤2）所得的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分通过交联凝胶层析填料分别测量鲜味增强程度，其中，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分；
4）用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入步骤2）收集的P-III组分，并放入恒温摇床中振荡；
5）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸12～36小时、进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，即得所述酱油鲜味基料。其中，所述步骤3）中填料优选葡聚糖凝胶Sephadex G-15。
在第四个方面，本发明提供了一种酱油中鲜味成分的鉴定方法，包括如下步骤：
1）取酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥得到冻干粉；
2）将步骤1）所得冻干粉与去离子水配置成溶液，上柱后，用去离子水进行洗脱，收集；采用紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）步骤2）所得的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分通过交联凝胶层析填料分别测量鲜味增强程度，其中，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分；
4）用色谱柱对步骤2）收集的P-III分离峰组分进行分离，接着通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定，鉴定出P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸。其中，所述步骤3）中填料优选葡聚糖凝胶 Sephadex G-15；步骤4）中色谱柱优选Waters Xbridge Amide色谱柱。
优选地，所述步骤4）中，色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10 mmol/L醋酸铵，流速0.2 ml/min，检测波长为220 nm，柱温为30℃；色谱柱优选Waters Xbridge Amide色谱柱。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明首次公开了能够显著提高酱油鲜味的物质成份为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸，为制备高品质酱油奠定了基础，并且为不同酱油酿造工艺制备的酱油品质鉴定提供了理论依据，同时对酱油进行有效的深加工，从中提取多功能物质，谋求更大的经济价值提供了可能。
附图说明
图1为本发明的鲜味基料的制备和鉴定工艺线路图；
图2 为SJ1-5号不同酱油鲜味基料样品的感官评价雷达图；
图3为KQ1-5号酱油鲜味基料的鲜味及鲜味增强的统计结果图；
图4为正离子模式m/z 679的ESI-MS/MS质谱图（MS）；
图5为正离子模式m/z 679的ESI-MS/MS质谱图（MS/MS）；
图6为推断的[M+H]+ m/z 679离子的质谱裂解途径；
图7为正离子模式m/z 231的ESI-MS/MS质谱图（MS）；
图8为正离子模式m/z 231的ESI-MS/MS质谱图（MS/MS）；
图9为推断的[M+H]+ m/z 231离子的质谱裂解途径。
具体实施方式
本发明提供了一种利用HPLC-MS联用技术从高品质酱油中提取分离制备鲜味基料的方法，制得的鲜味基料可显著提高酱油的鲜味，并且公开了高品质酱油中鲜味基料的主要成分及含量，以解决现有技术中酱油品质如何得以提升的问题，为制备高品质酱油奠定了基础，并且为不同酿造工艺所得酱油的品质鉴定提供了理论依据。
本发明所制得的酱油鲜味基料呈鲜味强度高，具体通过将高品质酱油过分子量为1000Da的超滤膜，取透过液，对透过液进行分离纯化得到一种鲜味基料，并通过HPLC-MS联用技术对鲜味基料成份进行测定得，酱油中鲜味基料的成份为2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的浓度配比为（1～3）:4，环六亮肽在酱油中的浓度为382mg/L～430 mg/L之间能够显著提高酱油的鲜味强度。
在一些实施例中，本发明提供了一种酱油鲜味基料的制备方法，包括以下步骤：
1）首先将高品质酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取 3 mL溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）通过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-15凝胶层析填料分别测得上述冷冻干燥后的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分的鲜味增强程度，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分；
4）将一部分P-III分离峰组分通过HPLC-MS联用技术进一步分析主要为酱油的鲜味成分；
5）然后选用Waters Xbridge Amide色谱柱对一部分P-III分离峰组分进行分离，接着通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定，鉴定P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸；所述的环六亮肽在酱油中的浓度为382mg/L～430 mg/L，能够显著提高酱油的鲜味；所述的2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为（1～3）:4。
6）将剩余的P-III组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-III组分并放入25℃的恒温摇床中振荡12小时；
7）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸12~36小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，得，酱油鲜味基料。本发明中环六亮肽分子式为C36H67N6O6，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸分子式为C11H23N2O3。
在一些实施例中，所述环六亮肽在酱油中的添加浓度为390mg/L～410 mg/L，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为1.5:4；在一些实施例中，所述步骤（5）中Waters Xbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃；在一些实施例中，所述P-III组分的基峰离子的质荷比为200～500，为肽类化合物。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本发明中所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明中酱油鲜味基料的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
1）首先将高品质酱油（高品质酱油为海天金标生抽，公众可通过购买获得，其它实施例相同）依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取 3mL 溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）通过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-15凝胶层析填料分别测得上述冷冻干燥后的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分的鲜味增强程度，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分，P-III组分的基峰离子的质荷比为200～500，为肽类化合物；
4）将一部分P-III分离峰组分通过HPLC-MS联用技术进一步分析主要为酱油的鲜味成分；
5）将剩余的P-III组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-III组分并放入25℃的恒温摇床中振荡12小时；
6）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸24小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，得酱油鲜味基料。
本发明中鲜味成分的鉴定方法的一种实施例，包括如下步骤：
（1）取上述步骤2）收集的P-III分离峰组分；
（2）用Waters Xbridge Amide色谱柱对P-III分离峰组分进行分离，WatersXbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃；
（3）通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定（具体的鉴定过程参见实施例9），鉴定P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸；环六亮肽在酱油中的浓度为382mg/L， 2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为1：4。
实施例2
本发明中酱油鲜味基料的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
1）首先将高品质酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取 3mL 溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）通过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-15凝胶层析填料分别测得上述冷冻干燥后的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分的鲜味增强程度，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分，P-III组分的基峰离子的质荷比为200～500，为肽类化合物；
4）将一部分P-III分离峰组分通过HPLC-MS联用技术进一步分析主要为酱油的鲜味成分；
5）将剩余的P-III组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-III组分并放入25℃的恒温摇床中振荡12小时；
6）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸24小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，即得酱油鲜味基料。
本发明中鲜味成分的鉴定方法的一种实施例，包括如下步骤：
（1）取上述步骤2）收集的P-III分离峰组分；
（2）选用Waters Xbridge Amide色谱柱对一部分P-III分离峰组分进行分离，Waters Xbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃；
（3）通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定（具体的鉴定过程参见实施例9），鉴定P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸；环六亮肽在酱油中的浓度为390mg/L，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为1.2：4。
实施例3
本发明中酱油鲜味基料的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
1）首先将高品质酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取 3 mL溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）通过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-15凝胶层析填料分别测得上述冷冻干燥后的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分的鲜味增强程度，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分，P-III组分的基峰离子的质荷比为200～500，为肽类化合物；
4）将一部分P-III分离峰组分通过HPLC-MS联用技术进一步分析主要为酱油的鲜味成分；
5）将剩余的P-III组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-III组分并放入25℃的恒温摇床中振荡12小时；
6）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸24小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，即得酱油鲜味基料。
本发明中鲜味成分的鉴定方法的一种实施例，包括如下步骤：
（1）取上述步骤2）收集的P-III分离峰组分；
（2）用Waters Xbridge Amide色谱柱对一部分P-III分离峰组分进行分离，WatersXbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃；
（3）通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定（具体的鉴定过程参见实施例9），鉴定P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸；环六亮肽在酱油中的浓度为410mg/L，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为1.5：4。
实施例4
本发明中酱油鲜味基料的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
1）首先将高品质酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取3 mL溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）通过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-15凝胶层析填料分别测得上述冷冻干燥后的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分的鲜味增强程度，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分，P-III组分的基峰离子的质荷比为200～500，为肽类化合物；
4）将一部分P-III分离峰组分通过HPLC-MS联用技术进一步分析主要为酱油的鲜味成分；
5）将剩余的P-III组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-III组分并放入25℃的恒温摇床中振荡12小时；
6）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸24小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，即得酱油鲜味基料。
本发明中鲜味成分的鉴定方法的一种实施例，包括如下步骤：
（1）取上述步骤2）收集的P-III分离峰组分；
（2）然后选用Waters Xbridge Amide色谱柱对一部分P-III分离峰组分进行分离，Waters Xbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃；
（3）通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定（具体的鉴定过程参见实施例9），鉴定P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸；环六亮肽在酱油中的浓度为420mg/L，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为1：2。
实施例5
本发明中酱油鲜味基料的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：
1）首先将高品质酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取 4 mL溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）通过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-15凝胶层析填料分别测得上述冷冻干燥后的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分的鲜味增强程度，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分，P-III组分的基峰离子的质荷比为200～500，为肽类化合物；
4）将一部分P-III分离峰组分通过HPLC-MS联用技术进一步分析主要为酱油的鲜味成分；
5）将剩余的P-III组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-III组分并放入23℃的恒温摇床中振荡24小时；
6）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-III组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸36小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，即得酱油鲜味基料。
本发明中鲜味成分的鉴定方法的一种实施例，包括如下步骤：
（1）取上述步骤2）收集的P-III分离峰组分；
（2）用Waters Xbridge Amide色谱柱对一部分P-III分离峰组分进行分离，WatersXbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃；
（3）通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定，鉴定P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸；环六亮肽在酱油中的浓度为430mg/L，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为3：4。
实施例6 （对照组）
1）首先将高品质酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥后并置于干燥器中保存备用；
2）将上述超滤分离所得组分冻干粉与去离子水配置成 20mg/mL 的溶液，取 3 mL溶液上柱后，用去离子水进行洗脱，流速为 1 mL/min，并于每管 2 ml 分管收集；采用UV-2100紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）为了做对照试验，选用Waters Xbridge Amide色谱柱对一部分上述收集的P-II分离峰组分进行分离，Waters Xbridge Amide色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10mmol/L醋酸铵，流速0.2 ml/min，检测波长为220nm，柱温为30℃，接着通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-II组分进行系统的分离鉴定，鉴定P-II组分中环六亮肽在酱油中的浓度为60 mg/L，2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸与环六亮肽在酱油中的浓度比为1：2。
4）将剩余的P-II组分进行收集，首先用无水乙醇将大孔吸附树脂充分溶胀，然后用去离子水洗净无水乙醇，接着加入上述收集的P-II组分并放入25℃的恒温摇床中振荡12小时；
5）依次选择去离子水、20%、45%、70%的乙醇和无水乙醇作为洗脱剂，对已吸附P-II组分并达到饱和的大孔吸附树脂解吸24小时进行洗脱，然后将洗脱后的液体用喷雾干燥机喷干成粉，得酱油鲜味基料。
实施例7 感官评价分析
将对照组（实施例6）、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的酱油鲜味基料由 10个资深的鉴评员（5男5女，年龄在25岁至35岁）组成的鉴评小组进行感官评价，编号依次为SJ-Ⅰ、SJ-Ⅱ，SJ-Ⅲ，SJ-Ⅳ，SJ-Ⅴ，这些成员对五种基本味觉品质十分熟悉。感官评价房间里的温度控制在23 ± 2 ℃。甜味、苦味、酸味、鲜味、咸味评价标准品分别为1%蔗糖溶液，0.08%咖啡因溶液，0.08%柠檬酸溶液，0.35%味精溶液和0.35%食盐溶液。
将上述酱油鲜味基料配成固形物为1%的溶液，品评时取20ml盛放在杯中，搅拌均匀，充分溶解后即可。评品员开始品尝标准味感物质，用小勺将溶液含在口中停留15s（勿咽下），活动口腔，使溶液接触整个舌头，仔细辨别味道，然后吐出溶液，每次品尝完后用清水漱口，需等待1min，再品尝，最后品尝样品溶液。
然后根据甜味、苦味、酸味、鲜味和咸味五种标准味感物质给出相应的分数(五分制)。评分标准：5—非常强，4—强， 3—标准，2—弱，1—很弱， 0—不可鉴别。各组分的甜味、苦味、酸味、鲜味、咸味五个感官指标分析结果采用雷达图进行标识。
感官评价结果如图2所示，结果表明，实施例1～4鲜味基料的鲜味值显著高于对照组。
实施例8 鲜味基料的增鲜效果检测
将上述对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的鲜味基料分别命名为KQ I-V，测得其鲜味（鲜味的评分参见实施例7）和鲜味增强结果如图3所示。
分别将KQ1-5号200mg样品添加到20 mL蒸馏水，形成的1% KQ1-5溶液，鲜味值均与0.35%的味精标准溶液（参见实施例7）接近，样品间无显著区别。由此表明KQ I –V中的键合氨基酸类物质鲜味无显著区别；但是，将 20 mg凝胶层析分离纯化组分添加到20 mL 0.35%味精+0.35%食盐的感官标准溶液中，形成含0.1% 鲜味基料的混合溶液，研究其对味精/食盐体系的鲜味增强效果时，从图3可知，呈现出明显的规律性；KQ-I鲜味增强值最低为5.5±0.41，KQ-V鲜味增强值最高为7.8±0.26，从KQ-I至KQ-V呈递增趋势。
实施例9 环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸的分离鉴定
HPLC-ESI-HRMS实验中，经 HPLC 分离后的P-III组分穿过电喷雾界面进Q-TOF5600高分辨质谱仪，分别在正、负离子两种扫描方式下，进行一级全扫描质谱分析，得到准分子离子的精确质荷比。准分子离子的保留时间、测量分子量值、计算化学式、理论分子量值和相对误差见表1。
表1 酱油呈味部分化合物的准确分子量和计算化学式
| 序号 | 保留时间 （min） | 测量分子量 （m/z） | 计算化学式 | 归属 | 理论分子量 （m/z） | 相对误差 （ppm） |
| 1 | 4.3 | 679.5114 | C36H67N6O6 | [M+H]+ | 679.5117 | 0.3 |
| 2 | 6.8 | 231.1698 | C11H23N2O3 | [M+H]+ | 231.1703 | 2.4 |
（1）环六亮肽分子式为：C36H67N6O6，其鉴定过程如下：
HPLC-ESI-HRMS分析中，根据各准分子离子的精确分子量，计算出了P-III组分中化合物的化学式，但并不知道其分子结构。HPLC-ESI-MS/MS能提供大量与分子结构相关的特征碎片离子，本节深入地研究各化合物的质谱裂解行为，鉴定其化学结构。
1） [M+H]+ m/z 679离子的结构鉴定
准分子离子m/z 679通过在线HPLC-ESI-HRMS正离子模式扫描得到精确的质量数为 m/z 679.5114，对应的元素组成为C36H67N6O6，同时得到精确质量数为 m/z 701.4937（C36H66N6O6Na）的准分子离子（见表1）；表明m/z 679对应该化合物的[M+H]+离子，m/z 701为其加钠离子[M+Na]+，因此该化合物的分子量为678，化学式为（C36H66N6O6）。
负离子扫描模式中未出现对应的m/z 677 [M-H]-离子，说明该化合物中没有羧基、酚羟基等活泼氢。进一步二极管阵列检测器（DAD）数据表明该化合物紫外信号微弱，说明其分子结构中不存在共轭双键体系。由准分子离子m/z 679的选择离子流图可知在Waters Xbridge Amide亲水作用色谱柱分离的中，准分子离子m/z 679的保留时间为4.3min，即正离子扫描模式总离子流图中首个主要色谱峰；表明该化合物具有很强的疏水性，且结构中没有羧基和酚羟基，作为富含键合氨基酸的酱油呈味部分组成物质，因此，该化合物极有可能为非共轭体系疏水性氨基酸构成的环肽。
准分子离子[M+H]+ m/z 679的一级质谱和二级质谱如图4和5所示，二级质谱中[M+H]+ m/z 679碎裂成m/z 661(100)，643(5)，562(5)，452(5)，435(30)，417(3)，336(10)，209(5) 等碎片离子。多肽中酰胺键最不稳定，所以，水解是蛋白质、多肽最常见的化学反应，质谱分析中多肽的酰胺键也最容易断裂发生中性丢失，其次脱水、氨基脱落、羧基脱落反应在氨基酸和多肽的质谱分析也频繁发生。
仔细分析上述碎片离子的中性丢失，与非共轭体系疏水性氨基酸——亮氨酸（分子量M = 131）的脱水残基（M = 113）存在很强的关联，即m/z 661([M+H- 18]+)、643([M+H-18-18]+)、562([M+H-18-(113-14)]+)、452([M+H-113- 113-1]+)、435([M+H-18-113-113]+)、417([M+H-18-18-113-113]+)、336([M+H-18-113-113- (113-14)]+)、209([M+H-113-113-113-113]+)，且该化合物的分子量678与化学式（C36H66N6O6）恰为6个亮氨酸脱水残基（C6H11NO，M = 113）之和。同时，氨基酸分析表明酱油呈味部分含有较为丰富的键合型亮氨酸，其中亮氨酸为前八大键合氨基酸之一。因此，初步推断该化合物为环六亮肽。为进一步确证其的结构，下面对准分子离子[M+H]+ m/z 679的串联质谱裂解机理进行详细的分析。
准分子离子[M+H]+ m/z 679的串联质谱推断裂解过程如图6所示。当m/z 679被施加适当的碰撞诱导解离能量时，分子富能，首先发生连续脱水生成m/z 661和643碎片离子。酰胺键a与d断裂将母环分裂成较均匀的两部分，能有效地消耗、分散离子的富余能量，因此大环状的m/z 679、661和643都能断裂a、d酰胺键，分别生成m/z 452、435和209碎片离子。m/z 661在二级质谱中为基峰离子，表明其在质谱离子阱里丰度最大、离子数量最多，因此，以m/z 661为母体发生碎裂的几率也就最大。所以，m/z 661除了酰胺键a与d外，还能以断裂b、c键与b、e键的方式碎裂，分别形成/z 562和336碎片离子。m/z 435在二级质谱中为次强离子，表明其在质谱离子阱里丰度较大、离子数量较多，因此能进一步脱水成m/z 417碎片离子。
综合上述分析可知，以环六亮肽能很好地解析m/z 679在一级质谱中的正负离子信号差别，MS/MS分析中出现的碎片离子与丰度分布，高分辨质谱的离子式拟合，色谱保留行为，及紫外吸收和氨基酸组成分析，因此我们的分析鉴定是可信的。
（2）2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸分子式为C11H23N2O3，其鉴定过程如下：
准分子离子m/z 231通过在线HPLC-ESI-HRMS正离子模式扫描得到对应的元素组成为C11H23N2O3（见表 1），HPLC-ESI-MS/MS二级质谱中碎裂成m/z 213(58), 185(60), 172(10), 132(35), 86(70), 72(100) 等碎片离子，如图7和8。二级质谱中出现亮氨酸m/z132特征离子，表明其结构中存在亮氨酸的羧基端，余下部分的元素组成与缬氨酰相符，因此，推断该化合物为2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸。
具体碎裂过程如图9所示，m/z 231发生麦克拉佛特重排（McLaffertyrearrangement）脱去一分子水生成m/z 213后，进一步脱去羰基形成碎片离子m/z 185。当碎裂发生在m/z 231酰胺键时，一方面酰胺键异裂成m/z 132的亮氨酸正离子，同时出现其加水加钠的加合离子m/z 172，然后发生脱羧反应生成碎片离子m/z 86；另一方面酰胺键异裂中性丢失亮氨酸后，进一步脱去一分子CO形成碎片离子m/z 72。综合上述分析，根据高分辨质谱的离子式拟合，及MS/MS分析中出现的碎片离子与丰度分布，准分子离子[M+H]+ m/z231被鉴定为2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种鲜味基料，其特征在于，所述鲜味基料含有2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽;
所述环六亮肽的结构式如下:
2.根据权利要求1所述的鲜味基料，其特征在于，所述2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的质量比为1～3：4。
3.根据权利要求2所述的鲜味基料，其特征在于，所述2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸和环六亮肽的质量比为1：2。
4.根据权利要求1所述的鲜味基料，其特征在于，所述鲜味基料的鉴定方法包括如下步骤：
1）取酱油依次通过10000 Da、5000 Da和1000 Da孔径的超滤膜微滤，将透过液收集后进行浓缩、冷冻干燥得到冻干粉；
2）将步骤1）所得冻干粉与去离子水配置成溶液，上柱后，用去离子水进行洗脱，收集；采用紫外可见分光光度计在 220 nm 波长检测，得到P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分，合并同一峰下的收集组分，进行浓缩、冷冻干燥后备用；
3）步骤2）所得的P-I、P-II、P-III和P-IV分离峰组分通过交联凝胶层析填料分别测量鲜味增强程度，其中，鲜味增强值最大的分离峰组分为P-III组分；
4）用色谱柱对步骤2）收集的P-III分离峰组分进行分离，接着通过HPLC-ESI-HRMS与HPLC-ESI-MS/MS对P-III组分进行系统的分离鉴定，鉴定出P-III组分中鲜味成分为环六亮肽和2-(2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-4-甲基戊酸。
5.根据权利要求4所述的鲜味基料，其特征在于，所述步骤4）中，色谱柱的洗脱条件为：洗脱液为10 mmol/L醋酸铵，流速0.2 ml/min，检测波长为220 nm，柱温为30℃。
6.一种酱油，其特征在于，所述酱油含有权利要求1～5任一项所述的鲜味基料。
7.根据权利要求6所述的酱油，其特征在于，所述酱油中环六亮肽的浓度为382～430mg/L。
8.根据权利要求7所述的酱油，其特征在于，所述酱油中环六亮肽的浓度为410～420mg/L。
9.根据权利要求7所述的酱油，其特征在于，所述酱油中环六亮肽的浓度为420 mg/L。
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