CN112535271B - 一种通过美拉德中间体制备减盐增鲜调味料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过美拉德中间体制备减盐增鲜调味料的方法，采用生物酶解技术分步水解植物蛋白得到小肽，并通过水相美拉德反应制备肽Amadori或Heyns重排产物。本发明所利用的原材料为农产品加工的副产物，来源广、价格低、营养丰富、易于吸收，所采用的水相美拉德反应技术克服了传统有机溶剂制备方法高污染、高成本的弊端，具有绿色安全、成本低廉的优势。本发明采用美拉德中间体替代传统钠盐和味精，用于提高食品咸度与鲜度，同时克服添加钾盐带来的诸多弊端，达到减盐不减咸的“技术减盐”目标。美拉德中间体的浓度为1mg/mL时，可刺激人味觉细胞使口腔分泌唾液中醛甾酮浓度提高10％以上，有效增强人体味觉细胞对咸度的感知程度。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过美拉德中间体制备减盐增鲜调味料的技术，属于食品化学和食品添加剂技术领域。
背景技术
食盐(NaCl)是生活中不可缺少的调味品，摄入过多则带来很多健康问题，减盐已经被全球公认为最具有成本效益的慢性病干预策略之一。受到传统饮食文化等因素的影响，我国居民食盐摄入量居高不下。麦克马斯特大学研究团队对18个国家超过9万人的长期调查发现，中国是唯一的80％社区每日食盐摄入量在12.5克以上的国家，远高于《中国居民膳食指南2016》成人每天食盐摄入量不超6克的标准。通过低钠饮食改善国民健康现状、提高人民生活质量已经刻不容缓。2007年起许多地方政府通过盐勺配发途径“工具减盐”，但因为牺牲口感而收效甚微；以氯化钾和硫酸镁为添加剂的低钠盐已在市场流通，但其成本高、后苦味重，很难为消费者广泛接受，并且钾离子增加心脏负担，对心脏病、肾功能不全、高血钾等病症患者并不适用。此外，鲜味物质也是与食盐同等重要的呈味物质，它作为一种风味增强剂在提升食品风味方面有至关重要的作用。目前我国生产和使用最多的一种食品鲜味剂是L-谷氨酸钠，但是其口感单一，无法赋予食品独特的风味，并且目前越来越多的消费者对谷氨酸钠在高温烹饪过程中的安全性提出质疑。因此以食品工业为依托，创新减盐技术思路、兼顾风味强化，形成“科学减盐、技术减盐”方法，是亟待解决的重要民生问题，也是食品科学研究与工业技术创新的必然要求。
植物蛋白作为农产品加工的副产物，来源广泛且价格低廉，以植物蛋白为原料，通过酶解改性手段将蛋白质转化为小肽，进而与还原糖进行美拉德反应，可以制备出香气浓郁、风味逼真的咸味鲜味香精基料。目前市售的咸味调味品主要是以完全美拉德反应产物为基料的咸味香精，虽然其现制产品特征香气浓郁，但在储藏和食品热加工中香气损失严重、香韵失真，品质难以标准化控制。美拉德中间体是美拉德反应的初级阶段产物，常温下理化性质较稳定，在后续热加工过程中能继续参与美拉德反应，迅速形成新鲜风味，有望取代完全美拉德反应产物用于开发新型的咸味鲜味香精基料。
发明内容
本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用美拉德中间体制备减盐增鲜调味料、实现减盐不减咸的方法。本发明的调味料制备方法简单、操作安全、成本低廉、减盐增鲜效果显著。本发明的技术方案为：
一种通过美拉德中间体制备减盐增鲜调味料的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦面筋蛋白、葵花籽蛋白、玉米蛋白等植物蛋白加水混合成为分散液，固液比为1:5～1:15重量比，调节分散液pH至6～8；
(2)将步骤(1)中所得分散液置于90～100℃条件下处理15～30min，冷却后调节分散液pH至6～8，向分散液中添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶，加酶量为蛋白原料重量的0.8～4％，混合均匀后在50～60℃条件下酶解反应1～6h；
(3)在步骤(2)中所得酶解液中加氨肽酶或风味蛋白酶，加酶量为蛋白原料重量的0.8～4％，混匀后在40～60℃条件下酶解反应2-5h，然后在沸水浴中灭酶10min，冷却至室温并进行固液分离，取清液；
(4)向步骤(3)中所得清液中添加木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖或阿拉伯糖等还原糖，添加量为清液固形物含量的10～30％，以重量比计；
(5)将步骤(4)中所得混合液pH调节至6～9，在70～120℃条件下加热20～160min，得到美拉德中间体溶液。
本发明的有益效果：
(1)植物蛋白通常是农产品加工的副产物，具有来源广泛、价格低廉、营养丰富和易于消化吸收的优势。以植物蛋白为原料，通过酶解改性手段将蛋白质转化为小肽，进而与还原糖进行美拉德反应，得到其Amadori重排产物或Heys重排产物。
(2)国内外普遍采用的技术中，美拉德中间体的制备主要在有机溶剂中完成，通常采用无水甲醇并添加苯甲醛、丙酮等试剂加热回流制备美拉德中间体。这种方法成本高昂、污染严重，只适用于理论研究，无法满足现代化工业生产的需要。本发明所公开的技术方案中采用水作溶剂制备美拉德中间体，绿色安全、成本低廉，可以实现工业化生产。
(3)本发明所公开的技术方案利用美拉德中间体替代传统钠盐和味精，有效提高食品咸度与鲜度，成功弥补工具减盐的收效空白，同时克服添加钾盐带来的诸多弊端，达到食用盐减盐20％不减咸的“技术减盐”目标，满足《健康中国2030规划纲要》的具体要求。
(4)本发明技术方案所涉及的产品主要成分为美拉德中间体Amadori重排产物或Heyns重排产物，理化性质稳定，自身不具备风味与褐变色泽，却能够在食品烹饪的热加工过程中裂解形成风味物质，并且进一步聚合形成色素物质，赋予食品浓郁的香气与诱人的色泽，达到加工风味受控形成的目的，解决以完全美拉德反应产物为主要成分的传统咸味香精风味易损失、产品品质不稳定的问题，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1所述大豆蛋白酶解产物的相对分子质量分布高效液相色谱图；
图2为本发明实施例1所述不同种类样品热反应产物的挥发性风味物质比较；
图3为本发明实施例2所述豌豆蛋白酶解产物的相对分子质量分布高效液相色谱图；
图4为本发明实施例3所述豌豆蛋白酶解产物的相对分子质量分布高效液相色谱图；
图5为本发明实施例4所述豌豆蛋白酶解产物的相对分子质量分布高效液相色谱图；
图6为本发明实施例4所述不同浓度豌豆肽-阿拉伯糖美拉德中间体对口腔分泌醛甾酮含量的影响；
图7为醛甾酮分析标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：
取大豆蛋白10kg加水100kg混合成为分散液，调节分散液pH至6.5，置于95℃条件下处理20min，冷却后调节分散液pH至6.5，向分散液中添加碱性蛋白酶0.2kg，混合均匀后在55℃条件下酶解反应4h。在所得酶解液中加氨肽酶0.1kg，混匀后在60℃条件下酶解反应3h，然后在沸水浴中灭酶10min，冷却至室温并进行离心处理达到固液分离的目的，此时上清液的蛋白酶解产物相对分子质量分布高效液相色谱图见图1，不同相对分子质量肽段的质量分数见表1。在上清液中添加阿拉伯糖1.2kg，将混合液pH调节至7，在80℃条件下加热60min，得到美拉德中间体溶液。采用电子舌分析该美拉德中间体的滋味指标，结果如表2所示，1mg/mL美拉德中间体使减盐20％后的水溶液咸度高于原盐溶液。
表1大豆分离蛋白酶解产物相对分子质量分布
| 相对分子质量 | <200 | 200-500 | 500-1000 | 1000-3000 | 3000-5000 | >5000 |
| 质量分数(％) | 24.37 | 36.76 | 25.17 | 12.56 | 0.93 | 0.22 |
表2大豆肽-阿拉伯糖美拉德中间体滋味指标
| 名称 | 酸味 | 苦味 | 涩味 | 苦味回味 | 涩味回味 | 鲜味 | 丰富性 | 咸味 |
| 盐空白 | -17.51 | 3.15 | -0.35 | -0.52 | 0.07 | 4.21 | 1.1 | 6.05 |
| 中间体 | -40.46 | 7.32 | -0.87 | -0.79 | 0.05 | 10.35 | 1.27 | 6.29 |
分别配制相同浓度的大豆肽-阿拉伯糖混合物、大豆肽-阿拉伯糖美拉德中间体(MRIs)和大豆肽-阿拉伯糖完全美拉德反应产物(MRPs)三种溶液，在110℃下反应2h，采用SPME/GC-MS分析三种样品在热加工过程中形成挥发性风味物质的能力。从图2可知，三种样品在热加工后形成的主要挥发性风味物质包括呋喃类、吡嗪类、醛类、酮类、醇类、含硫类等化合物，其中前两类含量最高。比较分析三者形成的挥发性风味物质总量，在相同浓度下，美拉德中间体在高温下形成的风味物质总量最高，是肽糖混合溶液的1.63倍，是完全美拉德反应产物的1.81倍。说明美拉德中间体风味形成速率比肽糖混合物快，这主要是由于中间体减少了美拉德反应第一阶段所需的反应时间。另外，中间体相比于完全美拉德反应产物能形成更多种类和含量的挥发性风味物质，尤其是呋喃类和吡嗪类的化合物，主要原因是完全美拉德反应产物中的一些风味物质在热加工下发生交联和聚合反应，形成类黑精。由此可见，美拉德中间体在热加工中具有较强的风味形成能力，并可解决完全美拉德反应产物性质不稳定、香气易损失的缺点，有较强的应用价值。
实施例2：
取豌豆蛋白10kg加水90kg混合成为分散液，调节分散液pH至6.5，置于95℃条件下处理20min，冷却后调节分散液pH至6.5，向分散液中添加碱性蛋白酶0.25kg，混合均匀后在55℃条件下酶解反应4h。在所得酶解液中加氨肽酶0.18kg，混匀后在60℃条件下酶解反应3h，然后在沸水浴中灭酶10min，冷却至室温并进行离心处理达到固液分离的目的，此时上清液的蛋白酶解产物相对分子质量分布高效液相色谱图见图3，不同相对分子质量肽段的质量分数见表3。在上清液中添加木糖1.25kg，将混合液pH调节至7，在80℃条件下加热60min，得到美拉德中间体溶液。采用电子舌分析该美拉德中间体的滋味指标，结果如表4所示，1mg/mL美拉德中间体使减盐20％后的水溶液咸度高于原盐溶液。采用双抗体夹心法测定空白样品中醛甾酮含量为89.19ng/L，添加1mg/mL美拉德中间体的调味料所刺激产生的唾液中醛甾酮含量为106.78ng/L，较空白样品提高了19.72％。
表3豌豆分离蛋白酶解产物相对分子质量分布
| 相对分子质量 | <200 | 200-500 | 500-1000 | 1000-3000 | 3000-5000 | >5000 |
| 质量分数(％) | 25.18 | 36.39 | 24.85 | 12.45 | 0.93 | 0.21 |
表4豌豆肽-木糖美拉德中间体滋味指标
| 名称 | 酸味 | 苦味 | 涩味 | 苦味回味 | 涩味回味 | 鲜味 | 丰富性 | 咸味 |
| 盐空白 | -18.38 | 3.15 | -0.41 | 0.09 | 0.02 | 4.25 | 2.9 | 6.12 |
| 中间体 | -41.52 | 7.66 | -1.01 | -0.14 | -0.02 | 10.7 | 3.19 | 6.47 |
实施例3：
取豌豆蛋白10kg加水100kg混合成为分散液，调节分散液pH至6.5，置于95℃条件下处理20min，冷却后调节分散液pH至6.5，向分散液中添加中性蛋白酶0.2kg，混合均匀后在55℃条件下酶解反应4h。在所得酶解液中加氨肽酶0.15kg，混匀后在60℃条件下酶解反应3h，然后在沸水浴中灭酶10min，冷却至室温并进行离心处理达到固液分离的目的，此时上清液的蛋白酶解产物相对分子质量分布高效液相色谱图见图4，不同相对分子质量肽段的质量分数见表5。在上清液中添加葡萄糖1.4kg，将混合液pH调节至7，在80℃条件下加热60min，得到美拉德中间体溶液。采用电子舌分析该美拉德中间体的滋味指标，结果如表6所示，1mg/mL美拉德中间体使减盐20％后的水溶液咸度高于原盐溶液。采用双抗体夹心法测定空白样品中醛甾酮含量为89.19ng/L，添加1mg/mL美拉德中间体的调味料所刺激产生的唾液中醛甾酮含量为114.86ng/L，较空白样品提高了28.78％。
表5豌豆分离蛋白酶解产物相对分子质量分布
| 相对分子质量 | <200 | 200-500 | 500-1000 | 1000-3000 | 3000-5000 | >5000 |
| 质量分数(％) | 25.85 | 36.18 | 24.67 | 12.28 | 0.85 | 0.15 |
表6豌豆肽-葡萄糖美拉德中间体滋味指标
| 名称 | 酸味 | 苦味 | 涩味 | 苦味回味 | 涩味回味 | 鲜味 | 丰富性 | 咸味 |
| 盐空白 | -17.38 | 3.05 | -0.41 | 0.07 | 0.01 | 4.22 | 2.5 | 6.15 |
| 中间体 | -39.85 | 7.48 | -1.38 | -0.16 | -0.03 | 9.97 | 3.2 | 6.43 |
实施例4：
取豌豆蛋白10kg加水150kg混合成为分散液，调节分散液pH至6.5，置于95℃条件下处理20min，冷却后调节分散液pH至6.5，向分散液中添加中性蛋白酶0.3kg，混合均匀后在55℃条件下酶解反应4h。在所得酶解液中加氨肽酶0.25kg，混匀后在60℃条件下酶解反应3h，然后在沸水浴中灭酶10min，冷却至室温并进行离心处理达到固液分离的目的，此时上清液的蛋白酶解产物相对分子质量分布高效液相色谱图见图5，不同相对分子质量肽段的质量分数见表7。在上清液中添加阿拉伯糖2.1kg，将混合液pH调节至7，在80℃条件下加热60min，得到美拉德中间体溶液。采用电子舌分析该美拉德中间体的滋味指标，结果如表8所示，4mg/mL美拉德中间体使减盐20％后的水溶液咸度远高于原盐溶液，4mg/mL美拉德中间体的鲜味值与1％味精/盐溶液相当。采用双抗体夹心法测定不同浓度豌豆肽-阿拉伯糖美拉德中间体对口腔分泌醛甾酮含量的影响，结果如图6所示。空白唾液样品中醛甾酮含量为89.19ng/L，添加6mg/mL美拉德中间体调味料所刺激产生的唾液中醛甾酮含量为128.38ng/L，较空白样品提高了43.94％。
表7豌豆分离蛋白酶解产物相对分子质量分布
| 相对分子质量 | <200 | 200-500 | 500-1000 | 1000-3000 | 3000-5000 | >5000 |
| 质量分数(％) | 27.95 | 36.17 | 23.68 | 11.42 | 0.68 | 0.10 |
表8豌豆肽-阿拉伯糖美拉德中间体滋味指标
| 名称 | 酸味 | 苦味 | 涩味 | 苦味回味 | 涩味回味 | 鲜味 | 丰富性 | 咸味 |
| 盐空白 | -20.33 | 5.28 | -0.41 | 0.07 | 0.01 | 4.13 | 2.38 | 6.20 |
| 味精空白 | -34.58 | 4.05 | -1.45 | -0.69 | -0.03 | 16.69 | 2.45 | 8.62 |
| 中间体 | -41.87 | 4.13 | -2.60 | -0.74 | -0.00 | 16.70 | 0.88 | 9.77 |
Type I glial-like cell是主要感受咸的味觉细胞，钠离子是通过Type Iglial-like cell细胞中的上皮氯化钠通道(Epithelial sodium channel，ENaC)识别的，ENaC由α、β、γ和δ亚基组成，其中一个亚基表达是由醛甾酮激素调节的，醛甾酮通过激活盐皮质激素受体，控制ENaC对钠离子的保留，改变味蕾的醛甾酮流量可以影响其对盐的敏感性。由图6可知，品尝不同浓度的植物蛋白肽美拉德中间体后，唾液中分泌的醛甾酮含量增加，且随豌豆肽美拉德中间体浓度增加而升高，证实美拉德中间体能够刺激口腔中醛甾酮的分泌，提高人体对盐的敏感性，从而提高咸味感知。
上述实施例中的实验用水为蒸馏水，植物蛋白和还原糖为食品级，高效液相色谱-质谱分析实验所用化学试剂为色谱纯，其余化学试剂均为分析纯。采用高效液相色谱对肽相对分子质量分布特征进行分析，分析条件如下：
色谱柱：TSK gel 12000SWXL(300mm×7.8mm)；流动相：乙腈/水/三氯乙酸＝45/55/0.1(v/v/v)；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测器：紫外检测器(UV)；检测波长：220nm。制作标准曲线的标准品：MW 12384(细胞色素C)，MW 1422(杆菌酶)，MW 451(乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-酪氨酸)，MW189(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)。使用GPC软件处理数据，根据标准曲线方程进行计算，得到样品的相对分子质量分布。
通过INSENT SA402B电子舌对蛋白肽美拉德中间体的滋味特征进行分析。称取一定量的冷冻干燥后的植物蛋白肽美拉德中间体，添加去离子水搅拌溶解，最终配置成不同质量浓度的植物蛋白肽美拉德中间体溶液，供电子舌进行分析与数据采集。
SA-402B味觉分析系统的传感器由味觉传感器、陶瓷参比电极和温度传感器组成，味觉传感器薄膜的电势是根据和参比电极相变化检测而得出。参比溶液为氯化钾和酒石酸的混合溶液，被用来模拟人体口腔中只有唾液时的状态，所有样品均以参比溶液作为对照。通过检测各种滋味物质和人工脂膜之间的静电作用或疏水性相互作用产生的膜电势的变化，实现对5种基本味(酸、涩、苦、咸、鲜)以及其回味的定性定量。电子舌味觉传感器特点及性能如表9所示。
表9电子舌味觉传感器特点及性能
电子舌检测条件如下：清洗时间5min，样品测试时间30s，测量回味30s。传感器在刚开始测定时，感应强度会上下波动，测定1～2次后，传感器响应强度趋于稳定，因此每个样品平行测定5次，选取后3次的响应强度数据用于后续分析。盐空白组为0.5％NaCl水溶液，味精空白组为0.5％NaCl+1％味精水溶液；样品组为含有0.1％中间体及0.4％NaCl的水溶液。
采用人醛甾酮(ALD)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒测定唾液中醛甾酮的含量。受试者在收集唾液前60min内不进食或刷牙，并在采样前和采样期间保持至少20min的坐姿。在唾液收集前30min先用去离子水漱口，口含样品2min后，收集唾液1min。唾液样品统一使用唾液收集管收集。唾液收集管于3000rpm离心20min，仔细取上清液，收集1mL唾液备用。间隔5min品尝下一个样品且在品尝前用去离子水漱口，消除残留物，重复上述步骤收集唾液样品。使用双抗体夹心法测定样品唾液中的醛甾酮含量。在包被单抗的微孔中分别加入不同浓度的标准品和稀释后的样品，再与辣根过氧化物(HRP)酶标记的醛甾酮抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中醛甾酮呈正相关。用酶标仪在450nm下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中醛甾酮浓度。标准曲线如图7所示。
使用SPME/GC-MS分析样品中挥发性风味物质，条件如下：
SPME条件：取5g待测物于样品瓶中，加入5μL的1,2-二氯苯标准溶液(0.015μg/μL)，以内标法定量。选用DVB/CAR/PMDS萃取头进行取样，通常用于检测香味物质(挥发性和半挥发性C3-C20)。将老化的萃取头置于60℃下吸附30min，然后在250℃下解析5min。
气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为氦气，流速1.8mL/min，无分流进样。起始柱温40℃，3min后以5℃/min升到80℃，后以10℃/min升到160℃，保持0.5min，再以2℃/min升到175℃，最后以10℃/min升到230℃，保持7min。
质谱条件：EI电离源，能量电压70eV，离子源温度250℃，接口温度250℃，发射电流35μA，扫描离子片段范围为35m/z～450m/z。
采用对比待测物和内标的峰面积与质量来计算检出物质的浓度。内标相对响应因子为1，回收率为100％。定量计算公式如下：
式中：Wi是化合物i的浓度(ng/mL)，Ai是化合物i的峰面积，As是内标的峰面积，ms是内标的质量，V是样品的体积，f’是相对校正因子，一般记为1。
Claims (2)
1.一种通过美拉德中间体制备减盐增鲜调味料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）取植物蛋白加水混合成为分散液，固液比为1:5~1:15重量比，调节分散液pH至6~8；
（2）将步骤（1）中所得分散液置于90~100℃条件下处理15~30 min，冷却后调节分散液pH至6~8，向分散液中添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶，加酶量为蛋白原料重量的0.8%~4%，混合均匀后在50~60℃条件下酶解反应1~6 h；
（3）向步骤（2）中所得酶解液中加氨肽酶，加酶量为蛋白原料重量的0.8%~4%，混匀后在40~60℃条件下酶解反应2-5 h，然后在沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温并进行固液分离，取清液；
（4）向步骤（3）中所得清液中添加还原糖，添加量为清液固形物含量的10~30%，以重量比计；
（5）将步骤（4）中所得混合液pH调节至7，在80℃条件下加热60 min，得到美拉德中间体溶液；
所述植物蛋白为大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦面筋蛋白、葵花籽蛋白或玉米蛋白；
所述还原糖为木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖或阿拉伯糖；
步骤（3）所得清液中相对分子质量小于500的蛋白肽的质量分数为50%~80%；步骤（5）所得美拉德中间体溶液为浅黄色或黄色，其主要成分为混合肽的Amadori重排产物或Heyns重排产物；步骤（5）所得美拉德中间体的浓度为1 mg/mL时，可刺激人味觉细胞使口腔分泌唾液中醛甾酮浓度提高10%重量份以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在水中添加0.5%重量比步骤（5）所得美拉德中间体时，可超过0.1%味精所产生的电子舌鲜度值，达到食用盐减盐20%重量份、不降低电子舌咸度值的效果。
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