CN108982743B - 检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测分析领域，涉及一种检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的方法，包括：(1)将乙酸乙酯、饱和食盐水与样品混合，固液分离，得到液相物；(2)从液相物中分离出有机相；(3)任选地，对有机相除水并除杂，得待测液；(4)用气相色谱‑质谱联用仪检测有机相或者待测液，得检测结果；(5)根据检测结果定性或定量计算样品中葫芦巴内酯；步骤(4)中，检测时气相色谱升温程序为：在55℃～65℃下保持1～3分钟，然后以3℃/分钟～6℃/分钟的速率升至155℃～170℃，保持1～3分钟，然后以17℃/分钟～25℃/分钟速率升温至245℃～255℃，保持8～13分钟。本发明方法检测的准确度高、重复性好。
Description
技术领域
本发明属于检测分析领域，具体涉及一种检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的方法。
背景技术
葫芦巴内酯(CAS 28664-35-9)属于内酯类化合物，具有极强气味，作为特征香味物质存在于葫芦巴籽和独活草中，也是人造枫槭糖浆的主要香味成分之一。葫芦巴内酯广泛存在于糖蜜、陈年朗姆、陈年清酒、白酒、雪莉酒和风干菌菇中，其能够穿透人体屏障，因此，食用含有葫芦巴内酯的食物后，人体的汗液和尿液中会散发枫槭糖浆的味道，此外，患有支链酮酸尿症(Maple Syrup Urine Disease，一种常染色体隐性遗传病)的病人，其体内可自发产生葫芦巴内酯并随尿液代谢。
葫芦巴内酯的沸点为184℃，属于半挥发性成分。目前所报道的检测方法多用于检测葫芦巴提取物中的葫芦巴内酯，而不适用于检测烟草制品或者烟用香精香料中的葫芦巴内酯，主要有如下几个原因：
第一，葫芦巴内酯的香味阈值非常低，空气中仅为0.02ng/L，水中0.3μg/L；为了不影响卷烟的吸味，烟草制品或烟用香精香料中葫芦巴内酯的用量也很少，检测阈值较低，这导致准确测定烟草制品或烟用香精香料中的葫芦巴内酯含量变得较为困难；
第二，不同于饮品、化妆品等检测对象，烟草制品的成分组成非常复杂，含成千上万种成分，如糖、生物碱、氨基酸、多酚、色素等等，复杂成分通过会造成检测干扰，而烟草制品中葫芦巴内酯的检测阈偏偏又很低，这加大了准确测定烟草制品中葫芦巴内酯的难度。
目前还未出现能准确测定烟草制品或烟用香精香料中葫芦巴内酯含量的方法。
发明内容
本发明提供了一种检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的方法，该方法的准确度高、重复性好。在此基础上，本发明还提供了一种试剂盒及其在检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯中的应用。
本发明第一方面涉及一种检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的方法，包括如下步骤：
(1)将乙酸乙酯、饱和食盐水与样品混合，得到混合物；将所述混合物固液分离，得到液相物；
(2)从步骤(1)得到的液相物中分离出有机相(例如分离出上层的有机相)；
(3)任选地，对步骤(2)得到的有机相除水并除杂，得到待测液；
(4)采用气相色谱-质谱联用仪检测步骤(2)得到的有机相或者步骤(3)得到的待测液，得到检测结果；
(5)根据步骤(4)得到的检测结果定性或定量计算样品中的葫芦巴内酯；
步骤(4)中，检测时气相色谱的升温程序为：在55℃～65℃(例如58℃、60℃、63℃)下保持1～3分钟(例如1.5分钟、2分钟、2.5分钟)，然后以3℃/分钟～6℃/分钟(例如4℃/分钟、5℃/分钟)的速率升至155℃～170℃(例如158℃、160℃、165℃、167℃)，保持1～3分钟(例如1.5分钟、2分钟、2.5分钟)，然后以17℃/分钟～25℃/分钟(例如19℃/分钟、20℃/分钟、23℃/分钟)速率升温至245℃～255℃(例如248℃、250℃、253℃)，保持8～13分钟(例如10分钟、11分钟、12分钟)。
本发明第一方面的一些实施方式中，所述饱和食盐水为25℃饱和食盐水。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(4)中，检测时气相色谱采用分流进样，分流比为(8～13):1，优选为(9～11):1，例如10:1。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(3)中，对有机相除水并除杂的方式为：将有机相与无水硫酸钠以及石墨化炭黑和/或C18混合，过滤，得到滤液即为待测液。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(3)中，在涡旋振荡条件下混合。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(3)中添加的石墨化炭黑和/或C18与步骤(1)中样品的质量比例为(0.05～0.3):1，优选为0.1:1、0.15:1、0.2:1、0.25:1。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(1)中，乙酸乙酯与饱和食盐水的体积比为(1～5):1，例如2:1、3:1、4:1。
本发明第一方面的一些实施方式中，所述方法包括如下1)至8)中的一项或者多项：
1)步骤(1)中，混合的料液比为1:(10～200)(g/mL)，例如1:20(g/mL)、1:30(g/mL)、1:40(g/mL)、1:50(g/mL)、1:60(g/mL)、1:80(g/mL)、1:100(g/mL)、1:120(g/mL)、1:140(g/mL)、1:160(g/mL)、1:180(g/mL)、1:190(g/mL)；
2)步骤(1)中，混合时间为1～60分钟，例如10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、55分钟；
3)步骤(1)中，在超声条件下混合；
4)步骤(1)中，将混合物固液分离的方式为：将混合物过滤，得到滤液，再对滤液离心，收集液相物；
优选地，离心转速为5000～8000rpm，例如6000rpm、6500rpm、7000rpm、7500rpm；
优选地，离心时间为5～15分钟，例如8分钟、10分钟、12分钟、14分钟；
5)步骤(2)中，分离之前，将步骤(1)得到的液相物静置；
6)步骤(4)中，检测之前，采用PTFE滤膜过滤有机相或者待测液；
优选地，PTFE滤膜的孔径为0.1～0.8μm，例如0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm；
7)步骤(5)中，通过内标法定量；
优选地，内标物为乙酸苯乙酯；
8)所述样品为烟草制品样品和/或烟用香精香料样品；
优选地，所述烟草制品样品为卷烟样品。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(4)中，气相色谱的操作条件包括如下A至F中的一项或者多项：
A.色谱柱为Agilent DB-17ms石英毛细管柱；
B.色谱柱的规格为60m×0.25mm×0.25μm；
C.进样口温度为230℃～280℃，例如240℃、250℃、260℃、270℃；
D.进样量为0.5～6μL，例如1μL、2μL、3μL、4μL、5μL；
E.载气流速为0.3mL/min～4mL/min，例如1mL/min、2mL/min、3mL/min；
F.载体为氦气。
本发明第一方面的一些实施方式中，步骤(4)中，质谱的操作条件包括如下a至k中的一项或者多项：
a.离子源为EI；
b.电子能为50～90eV，例如55eV、60eV、65eV、70eV、75eV、80eV、85eV；
c.传输线温度为250℃～300℃，例如260℃、270℃、280℃、290℃；
d.离子源温度为200℃～260℃，例如210℃、220℃、230℃、240℃、250℃；
e.四级杆温度为120℃～180℃，例如130℃、140℃、150℃、160℃、170℃；
f.溶剂延迟时间为4～15分钟，例如5分钟、7分钟、9分钟、10分钟、12分钟、13分钟、14分钟；
g.采用SCAN和SIM同时扫描；
h.葫芦巴内酯的定量离子(m/z)为83；
i.葫芦巴内酯的定性离子(m/z)为55、83和/或128；
j.乙酸苯乙酯的定量离子(m/z)为104；
k.乙酸苯乙酯的定性离子(m/z)为43、91和/或104。
本发明第二方面涉及一种试剂盒，包含乙酸乙酯、饱和食盐水、无水硫酸钠、孔径为0.1～0.8μm的PTFE滤膜、乙酸苯乙酯和AgilentDB-17ms石英毛细管柱。
本发明第二方面的一些实施方式中，试剂盒还包含石墨化炭黑和/或C18，优选为石墨化炭黑。
本发明第二方面的一些实施方式中，Agilent DB-17ms石英毛细管柱的规格为60m×0.25mm×0.25μm。
本发明第二方面的一些实施方式中，PTFE滤膜孔径为0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm。
本发明第二方面的一些实施方式中，饱和食盐水为25℃饱和食盐水。
本发明第三方面涉及本发明第二方面所述的试剂盒在检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯中的应用；
优选地，所述烟草制品为卷烟。
本发明中，如无特别说明：
术语“烟草制品”是指用烟叶制造而成的嗜好性商品。根据不同类型烟叶特点，应用不同加工制造方法，生产出种类繁多的烟草制品，以满足不同消费者的嗜好要求。其中卷烟占绝大多数。
术语“饱和食盐水”是指一定温度下，一定剂量水里不能继续溶解食盐所形成的饱和溶液。
术语“分流比”是指毛细管气相色谱分析中，进样器出口处进入色谱柱和放空两部份气化样品的流量之比。
术语“烟用香精香料”是指专供各种烟草制品加香矫味使用的添加剂。
本发明取得的有益效果：
本发明方法检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的准确度高、重复性好。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明实施例1中10.0μg/mL标准溶液的总离子流色谱图；
图2为本发明实施例1中葫芦巴内酯的质谱图；
图3为本发明实施例1中的标准工作曲线；
图4为本发明实施例2中待测溶液的总离子流色谱图；
图5为本发明实施例3中待测溶液的总离子流色谱图。
具体实施方式
实施例1葫芦巴内酯定性定量方法的建立
将50mg葫芦巴内酯(纯度为97.5％(W/W))溶解于乙酸乙酯中，配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液。
将220mg乙酸苯乙酯标准品溶于乙酸乙酯中，配制成浓度为2200μg/mL的内标储备溶液。
移取一定体积的标准储备液和内标储备液混合，用乙酸乙酯稀释成葫芦巴内酯浓度分别为1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的7个标准溶液，内标浓度均为2.2μg/mL。
采用气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890A GC–5975C MSD)检测标准溶液。
色谱条件：色谱柱为Agilent DB-17ms石英毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：60℃保持2min，先以4℃/min升温至160℃，保持2min，再以20℃/min升温至250℃，保持10min；载气(He)流速为1.0mL/min；进样口温度为250℃；进样量为1μL；分流进样，分流比为10:1。
质谱条件：离子源：EI；电子能为70eV；传输线温度为280℃；离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；溶剂延迟：10min；采用SCAN和SIM同时扫描，质量扫描范围(m/z)35-250。
其中，葫芦巴内酯浓度为10.0μg/mL的标准溶液的总离子流色谱图如图1所示、葫芦巴内酯的质谱图如图2所示。由此确定，葫芦巴内酯和乙酸苯乙酯选择的离子参数如表1中所示。
表1
以葫芦巴内酯与内标物的选择离子峰面积之比为纵坐标，以对应的葫芦巴内酯与内标物的质量浓度之比为横坐标作图，绘制标准工作曲线(如图3所示)，求得回归方程为y＝0.001403x2+0.1090x–0.1525，r2＝0.999。
实施例2烟用香精中葫芦巴内酯的测定
称取烟用香精0.20g，置于50mL锥形瓶中，加入20mL含有2.2μg/mL内标物乙酸苯乙酯的乙酸乙酯和10mL饱和食盐水，超声混合20分钟，过滤，得到滤液；将得到的滤液以6000rpm转速离心10分钟，静置，取上层的有机相，将有机相用无水硫酸钠干燥，再用0.45μmPTFE滤膜过滤，得到待测溶液。
采用实施例1的气相色谱-质谱联用仪测定待测溶液，检测条件同实施例1，得到的总离子流色谱图如图4所示。将葫芦巴内酯与内标物的选择离子峰面积之比代入实施例1标准工作曲线中，计算得到待测溶液中葫芦巴内酯的质量浓度。然后按照如下的公式计算得到烟用香精中葫芦巴内酯的含量。其中，待测溶液的体积等于乙酸乙酯溶液的体积。
其中，
W表示烟用香精中葫芦巴内酯的含量，mg/g；
C表示待测溶液中葫芦巴内酯的质量浓度，μg/mL；
V表示待测溶液的体积，mL；
m表示烟用香精质量，g。
计算得到，烟用香精中葫芦巴内酯的含量为0.44mg/g。
实施例3烟丝中葫芦巴内酯的测定
从某牌号卷烟中取出烟丝(加香烟丝)，称取1.0g烟丝样品置于50mL锥形瓶中，加20mL含有2.2μg/mL内标物乙酸苯乙酯的乙酸乙酯溶液和10mL饱和食盐水，超声混合20分钟，过滤，得到滤液；将得到的滤液以6000rpm转速离心10分钟，静置，取上层的有机相，向有机相中加入5g无水硫酸钠和150mg石墨化炭黑，在涡旋振荡仪上以2000rpm振荡混合2分钟，再用0.45μm PTFE滤膜过滤，得到待测溶液。
采用实施例1的气相色谱-质谱联用仪测定待测溶液，检测条件同实施例1，得到的总离子流色谱图如图5所示。将葫芦巴内酯与内标物的选择离子峰面积之比代入实施例1标准工作曲线中，计算得到待测溶液中葫芦巴内酯的质量浓度。然后按照实施例2中的公式计算得到加香烟丝中葫芦巴内酯含量。
计算得到，烟丝样品中葫芦巴内酯的含量为0.013mg/g。
实施例4方法的检测限、回收率和精密度
(1)按照实施例1中葫芦巴内酯浓度为1.0μg/mL的标准溶液的3倍信噪比计算，得到葫芦巴内酯的检出限为23.5ng/mL。
(2)采用标准加入法，向不含葫芦巴内酯的烟用香精和卷烟烟丝中添加3个不同水平浓度的葫芦巴内酯进行回收率实验，每个加标水平重复测定6次，求平均值，计算出的回收率和精密度见表2。其中，不含葫芦巴内酯的烟用香精添加葫芦巴内酯后的测定葫芦巴内酯方法同
实施例2，不含葫芦巴内酯的卷烟烟丝添加葫芦巴内酯后的测定葫芦巴内酯方法同实施例3。
(3)采用标准加入法，向上述第(2)项中不含葫芦巴内酯的卷烟烟丝中添加0.1mg/g浓度的葫芦巴内酯，得到样品，按照实施例3方法测定样品中葫芦巴内酯并将石墨化炭黑分别替换为等质量的N-丙基乙二胺和C18，每一方法重复测定6次，求平均值，计算出的回收率见表2。
表2
由表2可知，除使用N-丙基乙二胺的方法之外，本发明检测方法的回收率在89％～96％之间，相对偏差不超过4％，符合国家标准GB/T27404-2008中附录F的规定。这说明本发明检测方法的准确度高、重复性好。
而且，与使用N-丙基乙二胺和C18相比，本发明使用石墨化炭黑方法的检测准确度更高。
对比例
将实施例3气相色谱检测中的分流进样分别替换为无分流进样和分流比为20:1进样，其余与实施例3相同。
结果发现：无分流进样检测时，葫芦巴内酯的色谱峰过饱和；分流比为20:1检测时，葫芦巴内酯的色谱峰较小，灵敏度低，不利于检测；而本发明采用分流比为10:1得到的色谱峰灵敏度较高，信号没有过饱和，可以较为准确地测定葫芦巴内酯。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (14)
1.一种检测烟草制品和/或烟用香精香料中葫芦巴内酯的方法，包括如下步骤：
(1)将乙酸乙酯、饱和食盐水与样品混合，得到混合物；将所述混合物固液分离，得到液相物；所述样品为烟草制品和/或烟用香精香料样品；
(2)从步骤(1)得到的液相物中分离出有机相；
(3)任选地，将有机相与无水硫酸钠及石墨化炭黑混合、或者将有机相与无水硫酸钠及C18混合，过滤，得到滤液为待测液；
(4)采用气相色谱-质谱联用仪检测步骤(2)得到的有机相或者步骤(3)得到的待测液，得到检测结果；其中，气相色谱的色谱柱为Agilent DB-17ms石英毛细管柱；气相色谱采用分流进样，分流比为(8～13):1；气相色谱的升温程序为：在60℃下保持2分钟，然后以4℃/分钟的速率升至160℃，保持2分钟，然后以20℃/分钟速率升温至250℃，保持10分钟；质谱的离子源为EI；质谱的传输线温度为250℃～300℃；质谱的四级杆温度为120℃～180℃；质谱采用SCAN和SIM同时扫描；
(5)根据步骤(4)得到的检测结果定性或定量计算样品中的葫芦巴内酯；其中，通过内标法定量，内标物为乙酸苯乙酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，检测时气相色谱的分流比为(9～11):1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，在涡旋振荡条件下混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中石墨化炭黑或C18与步骤(1)中样品的质量比例为(0.05～0.3):1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，乙酸乙酯与饱和食盐水的体积比为(1～5):1。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于如下1)至6)中的一项或者多项：
1)步骤(1)中，混合的料液比为1:(10～200)g/mL；
2)步骤(1)中，混合时间为1～60分钟；
3)步骤(1)中，在超声条件下混合；
4)步骤(1)中，将混合物固液分离的方式为：将混合物过滤，得到滤液，再对滤液离心，收集液相物；
5)步骤(2)中，分离之前，将步骤(1)得到的液相物静置；
6)步骤(4)中，检测之前，采用PTFE滤膜过滤有机相或者待测液。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，第4)项中，离心转速为5000～8000rpm。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，第4)项中，离心时间为5～15分钟。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，第6)项中，PTFE滤膜的孔径为0.1～0.8μm。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述烟草制品样品为卷烟样品。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，步骤(4)中，气相色谱的操作条件包括如下A至E中的一项或者多项：
A.色谱柱的规格为60m×0.25mm×0.25μm；
B.进样口温度为230℃～280℃；
C.进样量为0.5～6μL；
D.载气流速为0.3mL/min～4mL/min；
E.载体为氦气。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，步骤(4)中，质谱的操作条件包括如下a至e中的一项或者多项：
a.电子能为50～90eV；
b.离子源温度为200℃～260℃；
c.溶剂延迟时间为4～15分钟；
d.葫芦巴内酯的定量离子(m/z)为83；
e.葫芦巴内酯的定性离子(m/z)为55、83和/或128。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，乙酸苯乙酯的定量离子(m/z)为104。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，乙酸苯乙酯的定性离子(m/z)为43、91和/或104。
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