CN109134583B

CN109134583B - 利用离子液体从鹅掌柴叶中提取三萜类化合物的方法

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Publication number: CN109134583B
Application number: CN201810851639.9A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 许瑞安; 牛云; 刘绪强
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2038-07-30
Also published as: CN109134583A

Abstract

本发明涉及一种通过离子液体萃取来优化鹅掌柴叶中羽扇豆烷型五环三萜提取工艺，其将干燥的鹅掌柴叶粉末与萃取剂混合后于室温进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体（［BMIM］BF₄、［BMIM］Br、［BMIM］PF₆或［HMIM］PF₆）与70%乙醇混合组成。经试验验证提取所得产物中化合物A（3α‑羟基‑羽扇‑20(29)‑烯‑23,28‑二酸）、和化合物B（3α‑羟基‑羽扇‑20(29)‑烯‑23,28‑二酸28‑O‑α‑L‑鼠李糖基‑(1→4)‑O‑β‑D‑葡萄糖基‑(1→6)‑β‑D‑葡萄糖苷）的总含量为288.03mg/g（n=6）。与传统的提取方法相比，加入离子液体后鹅掌柴叶中两个化合物的总提取率可达28.80%。

Description

利用离子液体从鹅掌柴叶中提取三萜类化合物的方法

技术领域

本发明属于医药或/和保健品技术领域，具体涉及一种利用离子液体结合响应曲面法从鹅掌柴叶中提取两种主要三萜类化合物（化合物A 3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸和化合物B 3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）的方法。

背景技术

鹅掌柴（Scheffleraoctophylla (Lour.) Harms）为五加科鹅掌柴属植物，主要分布在热带和亚热带等地区，在中国，鹅掌柴主要分布在福建、广东、广西、云南等地。药用始载于《岭南草药志》、《生草药性备要》、《岭南采药录》和广州部队《常用中草药手册》均记载其性凉，味苦涩，治流感发热，咽喉肿痛，风湿骨痛，跌打瘀积肿痛。《陆川本草》：驳骨止血，消肿止痛，治风湿骨痛，跌打骨折，伤积肿痛，刀伤出血。广州部队《常用中草药手册》：发汗解表，祛风除湿，治流感发热，咽喉肿痛，风湿骨痛，跌打瘀积肿痛。《广西中草药》：活血祛瘀，清热，治风湿，跌打，烧伤。鹅掌柴叶具有治疗各种疼痛、胃疼、外伤出血等功效。

离子液体(ionic liquid，IL)是一种新型的绿色有机溶剂，又称室温熔盐，由特定的、体积相对较大的、结构不对称的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子组成，具有良好的热稳定性和化学稳定性、粘度范围宽、可调节性和溶解性好等特点。不仅减少了对环境的污染，还能破坏纤维素的结构，从而促进有效成分的溶出，继而提高了提取率。近年来，有文献报道，离子液体应用于中药活性化合物的提取，目前，尚未见有关利用离子液体对鹅掌柴叶中三萜类成分萃取研究的报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用离子液体从鹅掌柴叶中优化提取两种主要三萜类化合物（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸和3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）的方法，该提取方法操作简单，提取效率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用离子液体从鹅掌柴叶中优化提取两种主要三萜类化合物（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸和3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）的方法，其将干燥的鹅掌柴叶粉末与萃取剂混合后于室温（25－30℃）进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与70%乙醇混合组成。

化合物A（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸）和化合物B（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）的化学结构如下所示：

。

具体的，上述提取方法中，所述离子液体为［BMIM］BF₄、［BMIM］Br、［BMIM］PF₆或［HMIM］PF₆；萃取剂中离子液体浓度为0.1~1.0 mol/L（优选0.4~0.8mol/L）。文中如无特殊说明，70%乙醇均指的是体积浓度。

进一步优选的，可以将鹅掌柴叶粉末与萃取剂按照固液比1g：10~100 mL（优选1g：60~80 mL）进行添加，鹅掌柴叶粉末的适宜目数范围在10~100目（优选50~70目）。

为了获得较好的提取效果，超声萃取时间以10~60 min （优选40~60min）为宜，超声功率为100~500 W。离心转速以7000~9000 r/min（优选3000~8000 r/min）为宜。

本发明采用离子液体-超声波辅助萃取-高效液相色谱法，应用 Design-Expert8.06 统计分析软件，设计 Box-Benhnken4因素3水平的中心组合实验，利用HPLC法同时对鹅掌柴叶中的化合物A（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸）和化合物B（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）进行含量测定，筛取最佳的提取工艺。本发明利用离子液体从鹅掌柴叶中提取两种主要三萜类化合物的方法构思步骤如下：

1）首先选择合适的溶剂来溶解离子液体并确定最佳的萃取剂类型；分别比较甲醇、乙腈、乙酸乙酯、70%乙醇和水来溶解离子液体并对鹅掌柴叶进行提取，筛选出70%乙醇对目标分析物的提取率最好。接着分别比较了［BMIM］BF₄⁄70%乙醇，［BMIM］Br⁄70%乙醇，［BMIM］PF₆⁄70%乙醇，［HMIM］PF₆⁄70%乙醇四种萃取剂对目标分析物的萃取率，最终确定［BMIM］BF₄⁄70%为最佳萃取剂；

2）在步骤1）的基础上，设计提取条件的因素水平，以提取鹅掌柴叶工艺中的不同控制参数为因子，通过单因素分析法来确定响应曲面方法的因素水平；筛选多个提取工艺的控制参数后，选取影响最大的几个控制参数为因子：以固液比（倍）、萃取剂浓度（mol/L）、离心转速（r/min）、粉碎目数（目）为四个因子，进行试验；

3）采用Design-Expert 8.06设计响应曲面试验，通过方差分析并确定化合物A和化合物B的最大提取率以及其对应的因子水平；

4）根据化合物A和化合物B的最大提取率对应的控制参数因子水平，在最优条件下提取鹅掌柴叶中两种主要三萜类化合物，检测提取率（将供试品溶液用高效液相色谱仪在210 nm处检测峰面积，与化合物A和化合物B标准曲线比较，计算化合物A和化合物B的总萃取量）。将实际提取率与传统溶剂检测值相比较，确定离子液体萃取的先进性；

本发明提供了一种利用离子液体结合响应曲面实验法优化提取两种主要三萜类化合物的工艺，应用 Design-Expert8.06 统计分析软件，设计 Box-Benhnken4因素3水平的中心组合实验，利用HPLC法同时对鹅掌柴叶中的化合物A和化合物B进行含量测定，本发明为中药研究者们提供了新的思路和途径，本实验建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为鹅掌柴的综合利用提供实验依据，对鹅掌柴的开发及利用提供了科学依据。此外，本发明提取方法操作简单，提取效率高，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为鹅掌柴叶供试品（a）与混合对照品（b）的HPLC图，1.化合物B 2.化合物A；

图2为不同提取溶剂对两种三萜类化合物萃取率的影响；

图3为萃取剂种类对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图4为粉碎目数对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图5为萃取剂浓度对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图6为超声时间对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图7为固液比对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图8为离心转速对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图9为超声功率对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响；

图10为交互作用对鹅掌柴两种三萜类化合物萃取率的影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

仪器与试剂。

化合物A和化合物B（根据庞素秋等，Chemistry of Natural Compounds, Vol.52, No. 3, May, 2016）从鹅掌柴中分离纯化所得的两个化合物，HPLC检测纯度均大于98%。1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[HMIM]PF6(赛默飞世尔科技公司，美国)、溴化1-丁基-3-甲基咪唑[BMIM]Br(默克股份两合公司，德国)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[BMIM]BF4(默克股份两合公司，德国)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIM]PF6(默克股份两合公司，德国)。乙腈、甲醇(HPLC级)，磷酸(天津市富宇精细化工有限公司)，水为纯净水(杭州娃哈哈百利食品有限公司)。

岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪(日本岛津)：LC-20AT液相色谱输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱数据处理系统；KQ-500DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，江苏)；AB135-S型十万级电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士)。

实验方法与结果。

2.1鹅掌柴叶中两种主要三萜类化合物含量测定方法的建立。

2.1.1对照品溶液的制备。

精密称取化合物A和化合物B适量，加70%乙醇溶解，制成浓度分别为7.068 mg/mL、0.49 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备。

精密称取鹅掌柴叶样品粉末（过60目筛）50.00 mg，加入1 ml的萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF₄与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体浓度为0.8 mol/L），超声萃取40 min后6000 r/min离心5 min，吸取上层清液，即得供试品溶液（试验中依次改变单一变量萃取剂种类、萃取浓度、固液比、粉碎目数、超声萃取时间、离心转速，各试验均平行3次）。

2.1.3色谱条件和系统适用性实验。

表1 鹅掌柴叶含量测定的色谱条件

精密吸取对照品溶液和供试品溶液，按上述表1的色谱条件进样，进样体积为10 μL，记录色谱图，见图1。在此色谱条件下，样品中化合物A和化合物B的色谱峰与混合对照品出峰时间一致，供试品中化合物A和化合物B的分离度分别为1.015和0.752，表明两种化合物分离度良好。

2.1.4线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品溶液2、5、10、15、20、25、30 μL注入液相色谱仪，按2.1.3项下色谱条件进样测定，记录各组分峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，进样质量（X，μg）为横坐标，作图得回归方程：化合物1：Y=134770X+2456878，r =0.9948；化合物2：Y=336721X+112706，r =0.9997；结果表明，化合物A和化合物B进样量分别在14.136~212.04 μg、0.98~14.7 μg时与峰面积响应值呈良好的线性关系。

2.1.5重复性实验

精确称量鹅掌柴叶样品6份，按上述最优条件制备样品，并按2.1.3项下色谱条件进样10 μL，结果表明化合物A和化合物B的RSD分别为1.74%和1.11%，表明本试验方法重复性好。

2.1.6精密度实验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1.3项下色谱条件连续进样6次，结果化合物1和化合物2的RSD分别为0.49 %和0.73%，表明仪器精密度良好。

2.1.7稳定性实验

精密称取鹅掌柴叶样品1份，按上述最优条件制备样品，并按2.1.3项下色谱条件进样分别在1，3，6，9，12，24 h进样10 μL，结果化合物1和化合物2的RSD分别为1.69%和0.63%，表明供试液中两种化合物在24 h内基本稳定。

2.1.8加样回收试验

称取已知两化合物含量的鹅掌柴样品6份，按优化条件制备供试品溶液，进行测定样品中所含两化合物的含量，再分别加入相当于样品中化合物1和化合物2质量的80%的标准品，按2.1.3项下色谱条件进样10 μL，化合物1和化合物2的平均加样回收率分别为101.69%和98.47%，其RSD值分别为1.88%和0.92%，说明其反应的测试结果的准确度符合要求。

2.2单因素试验

2.2.1提取溶剂（分散剂）、离子液体种类的选择

分别选取70%乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯和水5种溶剂，按照上述2.1.2项下条件制备供试品，并通过2.1.3项色谱条件进行HPLC分析，比较两种目标分析物总含量发现，两种目标分析物的总含量在70%乙醇溶剂中最高，因此选择70%乙醇作为提取溶剂（见图2）。

图3比较了[BMIM]BF₄/70%乙醇，[BMIM]Br/70%乙醇，[BMIM]PF₆/70%乙醇，[HMIM]PF₆/70%乙醇4种萃取剂对目标分析物的萃取结果。结果显示，[BMIM]BF₄/70%乙醇对目标分析物的萃取率最高，这可能与离子液体的自身组成结构有关。故本试验选[BMIM]BF₄/70%乙醇作为萃取剂。

2.2.2粉碎目数的选择

按照上述试验方法，其他试验条件相同，分别考察了粉碎目数为10、40、50、60、70和100目对目标分析物萃取量的影响。如图4显示，随着粉碎目数的增大，萃取量有随之增大的趋势，而当粉碎目数为60目时，对目标分析物的萃取率达到最大。这可能是因为离子液体具有黏性，随着粉末粒度的逐渐减小，样品中的化学成分越易被提取，但若当粉末粒度太小时，又容易被离子液体凝聚成团，反而阻碍其化学成分的释放。

2.2.3萃取剂浓度的选择

如图5所示，在萃取剂浓度为0.1~1.0 mol/L时，随着萃取剂浓度的增大，目标分析物的萃取率呈增加的趋势，而随着萃取剂浓度的进一步增加，反而呈降低趋势。这可能是因为随着离子液体浓度的增加，溶剂的扩散力降低，很难进入药材内部，不能够充分地提取药材中的成分，而造成萃取率下降。因此，选择0.8mol/L为最佳的萃取剂浓度。

2.2.4超声时间的选择

分别选择10、20、30、40、50、和60 min为超声时间，萃取剂浓度为0.8 mol/L，按照上述试验条件，比较不同超声时间对目标分析物萃取率的影响，结果如图6所示。随着超声时间的延长，对目标分析物的萃取率基本呈现逐渐增加的趋势；当超声时间为40 min时，对目标分析物的萃取率达到最大，然后随着时间的增加，目标分析物的萃取率呈现下降趋势。上述原因可能是因为超声时间过长会破坏离子液体和目标分析物的结构，具体的原因需要进一步的研究。

2.2.5固液比的选择

考察固液比为1:20、1:40、1:50、1:60、1:80和1:100时，离子液体对目标分析物的萃取率。结果如图7所示，当固液比达到1:20时，萃取率达到最大值，当继续增加比例时，萃取率反而下降。这可能是因为离子液体自身结果和物理特性的原因。

2.2.6离心转速的选择

在上述优化的最佳条件下，选择2000、4000、6000、7000、8000和9000 r·min^-1考察离心速度对目标分析物萃取率的影响，如图8所示，萃取率在6000 r·min^-1时达到最大。

2.2.7 超声功率的选择

分别选择100、200、300、500为超声功率，萃取剂浓度为0.8 mol/L，按照上述试验条件，比较不同超声功率对目标分析物萃取率的影响，结果如图9所示。随着超声功率的增大，对目标分析物的萃取率基本呈现逐渐增加的趋势；当超声时间为500W时，对目标分析物的萃取率达到最大。

2.3响应面法优化试验设计

根据 Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以鹅掌柴叶中化合物1和化合物2的总含量为响应值（Y），选取萃取剂浓度（A）、固液比（B）、离心转速（C）、粉碎目数（D）4个因素，采用4因素3水平的响应面分析方法。试验因素与水平设计见表2。

表2 响应面因素水平设计表

为考察各影响因素及其交互作用对提取工艺的影响，利用 Design Expert 8.06软件对表2 中的数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程Y=281.60-2.19A-21.02B-6.35C-5.66D+6.79AB+0.20AC+17.96AD-3.45BC-6.95BD-0.40CD-46.44A²-29.16B²-32.34C²-13.56D²。拟合二次多项式模型的方差分析见表3，模型P<0.0001表明高度显著，可用来进行响应值的预测。模型失拟项不显著，说明回归方程在整个回归空间内的拟合度较好，响应曲面法中，模型系数效应标志着响应值的表现，当一个系数出现正效应时，响应模式随着变量增加而增加；当一个系数具有负效应时，响应模式随着变量的增加而减少。系数的绝对值越高，响应变量的权重越重要。

表3回归方程显著性检验

*** 极显著(P<0. 001),** 高度显著(P<0. 01),* 显著(P<0. 05)

2.3.1响应曲面图分析

响应曲面图如图10所示，表明了自变量的作用和交互作用与响应值之间的关系。在图10中，a和C 图所示，超声时间一定时，随着粉碎目数的增大，响应值呈线性上升；粉碎目数不变时，随着离子液体浓度的增大或超声时间的延长对萃取量的影响不明显。b、d、e、g图所示，当另一个因素确定时，固液比越大，目标分析物的萃取率越大，这可能是当料液比变大时，鹅掌柴与溶剂的接触面积和接触机会也相对变大，能够使有效成分更多的与溶剂接触，更好地溶解，同时溶剂量的增多使有效成分在溶剂中的溶解量增大，能够使更多的目标分析物溶解在溶剂中。f图所示，离心转速和超声时间交互作用对目标分析物的萃取率影响较小。

2.3.2提取工艺参数的优化及模型验证

根据响应面分析，得出鹅掌柴的最佳提取条件：粉碎目数48.26目，萃取剂浓度0.78 mol/L，固液比1:33.11，离心转速5839.93 r/min，由于实际操作的限制，将最佳条件改为：粉碎目数50目，萃取剂浓度0.8mol/L，超声时间40 min，固液比1:30，离心转速6000r/min，测得鹅掌柴中两种三萜化合物的总含量为288.03 mg/g，与模型计算值相差不大，因此采用响应曲面法得到的提取参数准确可靠，具有实际应用价值。

对照例

一种利用离子液体从鹅掌柴叶中提取两种主要三萜类化合物的方法，精密称取干燥的鹅掌柴叶样品粉末（60目）50.00 mg，加入1mL的70%乙醇，于室温超声萃取40 min，超声萃取结束后，6000 r/min离心3 min，吸取上层清液，即得。

经检测可知：上清液中化合物A（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸）和化合物B（3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）的总含量为210.49mg/g (n=3)。

实施例1

一种利用离子液体从鹅掌柴叶中提取两种主要三萜类化合物的方法，其将50.00mg干燥的鹅掌柴叶样品粉末（60目）与1mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF₄与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］BF₄浓度为0.8mol/L。）混合后，于室温超声萃取40min，超声萃取结束后，6000 r/min离心3 min，取上清液即得。

经检测可知：上清液中化合物A和化合物B的总含量288.03mg/g (n=3)。

实施例2

一种利用离子液体从鹅掌柴叶中提取两种主要三萜类化合物的方法，其将50.00mg干燥的鹅掌柴叶（60目）与1 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］Br与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］Br浓度为0.8mol/L。）混合后，于室温超声萃取40 min，超声萃取结束后，6000 r/min离心3 min，取上清液即得。

经检测可知：上清液中化合物A和化合物B的总含量222.86mg/g (n=3)。

实施例3

一种利用离子液体从鹅掌柴叶中提取两种主要三萜类化合物的方法，其将50.00mg干燥的鹅掌柴叶（60目）与1mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［HMIM］PF6与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体［HMIM］PF6浓度为0.8mol/L。）混合后，于室温超声萃取40 min，超声萃取结束后，6000 r/min离心3 min，取上清液即得。

经检测可知：上清液中化合物A和化合物B的总含量219.07mg/g (n=3)。

结论：本发明首次采用离子液体-超声波辅助萃取-高效液相色谱法，以[BMIM]BF4/70%乙醇溶液为萃取剂，粉碎目数为60目，萃取剂浓度为0.8mol/L，超声时间为40 min，固液比为1:20，离心转速6000 r/min，得到鹅掌柴叶中化合物A和化合物B的总含量为萃取率提高了30.91%，可为鹅掌柴叶的开发利用提供理论基础。本发明为中药研究者们提供了新的思路和途径，本发明建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生才产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为鹅掌柴的综合利用提供实验依据。

Claims

1.一种利用离子液体从鹅掌柴叶中提取三萜类化合物的方法，其特征在于，将干燥的鹅掌柴叶粉末与萃取剂混合后于室温进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与70%乙醇混合组成；

所述离子液体为［BMIM］BF₄、［BMIM］Br、［BMIM］PF₆或［HMIM］PF₆；萃取剂中离子液体浓度为0.1~1.0 mol/L；

所述三萜类化合物为3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸和3α-羟基-羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸28-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷。

2.如权利要求1所述利用离子液体从鹅掌柴叶中提取三萜类化合物的方法，其特征在于，鹅掌柴叶粉末与萃取剂按照固液比1g：10~100 mL进行添加，鹅掌柴叶粉末目数在10~100目。

3.如权利要求1至2任一所述利用离子液体从鹅掌柴叶中提取三萜类化合物的方法，其特征在于，超声萃取时间为10~60 min，超声功率为100~500 W。

4.如权利要求3所述利用离子液体从鹅掌柴叶中提取三萜类化合物的方法，其特征在于，离心转速为3000~8000 r/min。