CN111257490B - 一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，属于分析检测技术领域。所述方法包括以下步骤：样品预处理；样品提取；用双柱串联‑液相色谱‑质谱法对样品进行分离检测；采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析。本发明能同时分析烟叶中13种物质含量，对新烟叶品种的培育有着重要的科研意义，同时对各类烟叶的品质鉴定有着广泛的应用前景。同时检出限低，灵敏度高，对于痕量烟碱成分能有效进行检测鉴定；准确定量范围较大，适合同一种提取方法下，不同种类和不同生长阶段的烟叶中烟碱的分析鉴定。

Description

一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法
技术领域
本发明实施例涉及分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法。
背景技术
在烟叶/烟草成分的检测中，尼古丁(NT)、尼古丁代谢产物(HC、CT、NNT、AT、AB)以及烟草特有的亚硝胺类致癌物质(NNN、NNK、NAT、NAB)为常见的检测目标物。为了降低与吸烟相关的疾病风险，当今许多科研者利用生物转化的方法，开发研究低NT含量的烟叶。最新研究表明，6-HN、2-HN、AK为三种重要的NT代谢物，是研究低NT的关键生物标记物，对新烟叶品种的培育有着重要的科研意义。因此，建立NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、2-HN、6-HN、NNN、NNK、NAT、NAB的同时快速检测方法对烟叶新品种培育和各类烟叶的品质鉴定有着广泛的应用前景。
传统的滴定法、紫外-可见分光光度法、水蒸气测定法可检测烟碱的含量。然而这些方法只能检测出烟碱的总量，且要求的化学反应试剂繁多，测定也易受很多环境因素影响。GC-MS(气相色谱法-质谱联用)的方法被用于检测烟叶中烟碱及一些代谢物，然而其操作方法复杂，稳定性较差。近几年，对NT及其代谢物的检测集中于LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱联用)。然而，大多数方法只检测NT及其手性化合物；或同时检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB、NNN、NNK、NAT、NAB。
如下列举两种常见的烟叶检测方法：
方法一：使用反相LC和WatersBEHC18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)。在35℃柱温条件下进行分离，流动相组成为：A(0.2mmol/L乙酸铵水溶液)B(0.2mmol/L乙酸铵的甲醇溶液)，流速为0.6mL/min。梯度洗脱程序如下：第0-1min，0％流动相B，第1.0-2.1min，流动相B从0％线性增加到60％，然后在接下来的0.9min中，流动相B增加到100％。总运行时间为4min，包括1min的平衡时间(McGuffey,J.E.,Wei,B.,Bernert,J.T.,Morrow,J.C.,Xia,B.,Wang,L.,&Blount,B.C.(2014).ValidationofaLC-MS/MSmethodforquantifyingurinarynicotine,sixnicotinemetabolitesandtheminortobaccoalkaloids--anatabineandanabasine--insmokers'urine.PLoSONE,9(7),e101816.)。该方法可同时检测NT、CT、NNT、AT、AB、二烯烟碱、米喔斯明烟碱，而AK、2-HN、6-HN并未包括在其中。
方法二：使用HPLC色谱柱PhenomenexGemini-NX，C18，110A，(4.6×150mm，5μm)。流动相A为6.5mM乙酸铵(pH＝10.5)，流动相B为乙腈。色谱洗脱程序为：第0-0.02min，流动相B从0％升至3％，并保持到1min；第1-9min，流动相B从3％升至30％，并保持到10.05min；第10.05-10.51min，流动相B从30％升至100％，并保持到11.2min；在11.21min，流动相B从100％降回3％，并保持到13.5min(Li,Y.,Pang,T.,Shi,J.,Lu,X.,Deng,J.,&Lin,Q.(2015).SimultaneousDeterminationofAlkaloidsandTheirRelated Tobacco-SpecificNitrosaminesinTobaccoLeavesUsingLC–MS-MS.J ChromatogrSci,53(10),1730-1736.)。该方法可同时检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB和降烟碱，而AK、2-HN、6-HN并未包括在其中。
现有检测方法只能同时分析NT、CT、HC、NNT、AT、AB、NNN、NNK、NAT、NAB，然而对于尼古丁微生物转化产物AK、2-HN和6-HN与烟碱化合物和N-亚硝胺化合物的同时检测分离未见报道。
因此，开发一种灵敏度高，准确可靠的同时快速检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、2-HN、6-HN、NNN、NNK、NAT、NAB的方法对鉴定烟叶品质，开发研究低尼古丁的烟叶作物；以及分离有益烟碱成分，开发药用成分，辅助神经类疾病治疗有着重要的意义。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，以解决现有技术存在的问题。
烟叶中烟碱的常规检测多集中于几种常见的成分，如烟碱类化合物NT、CT、HC、NNT、AT、AB、和亚硝胺类化合物(NNN、NNK、NAT、NAB)，然而对于尼古丁微生物转化产物AK、2-HN和6-HN的分离尚未见报道。尤其是2-HN和6-HN为同分异构体，因其分子量相同，结构相似，在质谱检测中具有相同的前体离子和产物离子碎片。仅通过质谱的多反应监测(MRM)模式，无法达到鉴定两种化合物的目的。因此，分离AK、2-HN和6-HN，并同时检测NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、2-HN、6-HN、NNN、NNK、NAT、NAB共13种化合物是本发明要解决的问题之一。
现有检测烟碱及其代谢物的方法灵敏度较低。在烟叶新品种培育过程中，一些通过生物转化的尼古丁相关代谢产物浓度较低，因此要求有较低的检出限即高灵敏度。同时，由于烟叶的品种繁多，其烟碱的含量有几倍甚至几百倍的差别。现有的检测方法准确定量范围小，对于烟碱含量较高的品种需要多次稀释，对于烟碱含量低的品种需要浓缩步骤，无法达到同时提取同时检测的目的。因此，降低检出限，提高灵敏度，是痕量烟碱的检测的技术难点；提高准确定量范围，是降低提取检测成本的技术难点。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
本发明提供了一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)样品预处理：将烟叶冷冻干燥磨粉，得到预处理的烟叶；
(2)样品提取：取预处理的烟叶置于收集容器中，加入萃取剂，经过离心，收集上清液，二次提取，经滤膜过滤后的滤液作为样品溶液；
(3)用双柱串联-液相色谱-质谱法对样品进行分离检测；
(4)采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析，计算得到烟叶中13种物质含量；
其中，所述13种物质为：尼古丁(NT)、3-羟基可替宁(HC)、可替宁(CT)、降烟碱(NNT)、安那他品(AT)、假木贼碱(AB)、氨基酮[4-(甲基氨基)-1-(3-吡啶基)1-丁酮](AK)、6-羟基烟碱(6-HN)、2-羟基烟碱(2-HN)、N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)。
进一步地，步骤1中，在-50～-80℃冷冻干燥1～3h，磨粉后过40目筛。冷冻干燥方法进行前处理，既可以最大程度上保证烟叶中烟碱和各类代谢物的稳定性，另一方面，冷冻干燥使烟叶样品易于研磨，使样品更均匀，降低取样偏差。
进一步地，所述萃取剂包括甲酸铵、乙腈和水，重量体积比例为1.0-1.3g：1.0-1.2L：0.8-1.1L。
乙腈可以破坏植物组织，将各类植物活性成分从组织中释放出来。同时，因为NT和代谢产物是亲水性化合物，水的存在会提高对烟碱一类物质的萃取能力，降低其他物质干扰。甲酸铵的添加时为了破坏烟叶中植物蛋白与烟碱的结合态，从而释放自由态的烟碱成分，提高提取效率。随后的高频超声提取步骤也有助于细胞壁的破碎，而有效地从烟叶基质中分离目标分析物。乙腈和水的萃取溶剂用于第二次萃取，将残留的烟碱成分继续溶出，以达到提高提取率的目的。
进一步地，所述双柱串联-液相色谱-质谱法中，色谱条件为：
色谱柱：以WatersXbridgeAmide3.5μm，2.1×100mm在前、WatersAtlantis T33μm，2.1×50mm在后的顺序进行串联；柱温：30℃；进样器温度：6℃；流速：0.6mL/min；进样量1～10μL；分离时间5.5min；流动相：A为100mM甲酸铵水溶液，B为乙腈；梯度洗脱的条件为：第0～3min，5％～98％流动相B；第3～4min，98％流动相B；第4～4.1min，98％～5％流动相B；第4.1～5.5min，5％流动相B。
进一步地，所述双柱串联-液相色谱-质谱法中，质谱条件为：
Figure BDA0002385739320000041
Figure BDA0002385739320000051
ESI正离子电离模式；涡轮喷射电压4500eV；离子源温度500℃；气帘气10psi；碰撞气(CAD)12psi；雾化气(GS1)60psi，加热器气体(GS2)70psi；多反应监测模式(MRM)。
在该方法中，XbridgeAmide色谱柱与T3色谱柱串联使用，以实现2-HN和6-HN的分离及NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、NNN、NNK、NAT、NAB的同时检测。尽管Amide色谱柱也设计用于极性化合物，使用高比例有机溶剂组成的流动相，达到分离洗脱极性较强的化合物目的。然而在我们的前期研究中，单独使用Amide色谱柱时，NT代谢物如6-HN、2-HN、AK显示出色谱峰峰形差，尤其是AK，伴有严重拖尾的问题，影响检测的灵敏度。另一方面，也无法分离2-HN和6-HN两种组分。而单独使用T3色谱柱，由于2-HN和6-HN极性较强，在色谱柱的保留性较差，因而也无法达到分离的目的。
本发明创新地采用Amide色谱柱和T3色谱柱串联模式：在初始阶段应用Amide色谱柱，同时使用低百分比的有机流动相，目的是有效保留极性NT及其代谢物的目的，实现第一次柱内分离。随着有机流动相百分比的缓慢增加，各组分逐渐从Amide色谱柱分离洗脱下来，继续通过与其串联的T3色谱柱进行第二次洗脱和柱内分离。同时由于T3色谱柱特殊的封端设计，使各组分的峰形得到改善，达到提高灵敏度的目的。综上所述，初始阶段低百分比有机流动相使烟叶各组分在Amide色谱柱有效保留，随着有机流动相比例的缓慢增加，实现第一次柱内分离，随后，有机流动相继续增加到相对较高的比例，各组分从Amide色谱柱洗脱下来，并通过T3色谱柱进行第二次分离，进而达到分离2-HN和6-HN，并同时检测13种包括烟碱、烟碱代谢物及N-亚硝胺类化合物的目的。
进一步地，步骤1中，采用孔径为0.45μm的PTFE膜进行过滤。
本发明实施例具有如下优点：
1、本发明采用两种色谱柱串联能够有效分离烟碱6-HN和2-HN同分异构体，并同时分析6-HN、2-HN、NT、CT、HC、NNT、AT、AB、AK、NNN、NNK、NAT、NAB，对新烟叶品种的培育有着重要的科研意义，同时对各类烟叶的品质鉴定有着广泛的应用前景。
2.灵敏度高(即检出限低)：CT和HC的最低检出限(LOD)为0.02ng/mL，AK、6-HN、NNK、NAB的LOD为0.05ng/mL，2-HN、AB、NNT、AT、NT、NNN、NAT的LOD为0.1ng/mL。因此，本方法的检出限低，灵敏度更高，对于痕量烟碱成分也能有效进行检测鉴定。
3.准确定量范围大：由于烟叶的种类不同，NT及其代谢产物的浓度差异较大。本方法中，AK，CT，6-HN和HC的最低定量浓度(LOQ)为0.1ng/mL，2-HN、AB、NNT、AT、NT、NNN、NAT的LOQ为0.2ng/mL。NT、AK、AB、AT、NNT、6-HN、NNN、NAT的最高定量浓度(ULOQ)为1500ng/mL，2-HN、CT、HC、NNK、NAB的ULOQ为150ng/mL。因此，本方法的准确定量范围较大，适合同一种提取方法下，不同种类和不同生长阶段的烟叶中烟碱的分析鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为2HN标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的2HN的离子流色谱图；
图2为6-HN标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的6-HN的离子流色谱图；
图3为NNT标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的NNT的离子流色谱图；
图4为NT标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的NT的离子流色谱图；
图5为AT标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的AT的离子流色谱图；
图6为CT标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的CT的离子流色谱图；
图7为HC标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的2HC的离子流色谱图；
图8为AK标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的AK的离子流色谱图；
图9为AB标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的AB的离子流色谱图；
图10为NAB标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的NAB的离子流色谱图；
图11为NNN标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的NNN的离子流色谱图；
图12为NNK标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的NNK的离子流色谱图；
图13为NAT标准品(左)和实施例3的常规烟叶种(TBC)(右)中的NAT的离子流色谱图；
图14为实施例3的常规烟叶种TBC、以及两种基因修饰种RTBC和HRTBC中的AK、AB、NNT、AT、NT的检测结果对比图；
图15为实施例3的常规烟叶种TBC、以及两种基因修饰种RTBC和HRTBC中的CT、2HN、6HN、HC的检测结果对比图；
图16为实施例3的常规烟叶种TBC、以及两种基因修饰种RTBC和HRTBC中的NNN、NNK、NAT、NAB的检测结果对比图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(一)标准曲线的绘制
标准品配制：
1.准确分别称取1mg的AK、6-HN、AB、NNT、AT、NT、NNN和NAT溶解于10mL的乙腈：水(1:1v:v)中，作为母液A(0.1mg/mL)；取100μL母液A用10mL乙腈：水(1:1v:v)稀释，得到母液A’(1.0μg/mL)。
2.准确分别称取1mg的CT、HC、2-HN、NAB和NNK溶解于100mL的乙腈：水(1:1v:v)中作为母液B(0.01mg/mL)；取100μL母液B用10mL乙腈：水(1:1v:v)稀释，得到母液B’(0.1μg/mL)。
3.准确分别称取1mg的AK、CT、6-HN和HC溶于100mL的乙腈：水(1:1v:v)，作为母液C(0.01mg/mL)；取20μL母液C用10mL乙腈：水(1:1v:v)稀释，得到母液C’(0.02μg/mL)。
4.准确分别称取1mg的2-HN、AB、NNT、AT、NT、NNN、NAT、NAB和NNK溶于100mL的乙腈：水(1:1v:v)，作为母液D(0.01mg/mL)；取10μL母液D用10mL乙腈：水(1:1v:v)稀释，得到母液D’(0.01μg/mL)。
5.母液A与母液B各取150μL，定量于10mL的乙腈：水(1:1v:v)，得到STD7浓度。
6.STD7稀释1.5倍制备STD6，STD6稀释2倍制备STD5，稀释液为乙腈：水(1:1v:v)。
7.取10μL母液A与20μL母液B，定量于10mL的乙腈：水(1:1v:v)，得到STD4浓度。
8.取20μL母液A’和200μL母液B’，定量于2mL的乙腈：水(1:1v:v)，得到STD3浓度。
9.STD3稀释10倍，制备STD2，稀释液为乙腈：水(1:1v:v)。
10.取10μL母液C’和40μL母液D’，定量于2mL的乙腈：水(1:1v:v)，得到STD1浓度。
混合标准溶液的配制：标准品配制成7个梯度浓度的混合标准溶液中，溶剂为乙腈：水(1:1v:v)，梯度浓度见表1。
表1
ng/mL STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7
AK 0.1 1 10 100 500 1000 1500
CT 0.1 1 10 20 50 100 150
6-HN 0.1 1 10 100 500 1000 1500
HC 0.1 1 10 20 50 100 150
2-HN 0.2 1 10 20 50 100 150
AB 0.2 1 10 100 500 1000 1500
NNT 0.2 1 10 100 500 1000 1500
AT 0.2 1 10 100 500 1000 1500
NT 0.2 1 10 100 500 1000 1500
NNN 0.2 1 10 100 500 1000 1500
NAT 0.2 1 10 100 500 1000 1500
NAB 0.2 1 10 20 50 100 150
NNK 0.2 1 10 20 50 100 150
注：STD1代表标准溶液第一梯度浓度，依次类推。
7个梯度标准溶液无需提取稀释，直接上机进行测定。
采用双柱串联-液相色谱-质谱法，色谱条件为：
色谱柱：以WatersXbridgeAmide3.5μm，2.1×100mm在前、WatersAtlantis T33μm，2.1×50mm在后的顺序进行串联；柱温：30℃；进样器温度：6℃；流速：0.6mL/min；进样量5μL；分离时间5.5min；流动相：A为100mM甲酸铵水溶液，B为乙腈；梯度洗脱的条件为：第0～3min，5％～98％流动相B；第3～4min，98％流动相B；第4～4.1min，98％～5％流动相B；第4.1～5.5min，5％流动相B。
质谱条件为：
Figure BDA0002385739320000101
ESI正离子电离模式；涡轮喷射电压4500eV；离子源温度500℃；气帘气10psi；碰撞气(CAD)12psi；雾化气(GS1)60psi，加热器气体(GS2)70psi；多反应监测(MRM)；正离子扫描模式。
分别配制系列浓度的混合标准溶液，并进行测定，每个梯度平行测定三次。以目标组分的平均峰面积(Y)与目标组分浓度(X，单位是ng/mL)的关系曲线来确定标准曲线。所有标准曲线均通过最小二乘线性回归分析得出，系数为1/χ2。对于每个计算出的浓度，与理论标准值的偏差表示为精度，精度应为100±15％之间。确定相关性系数R2必须大于或等于0.99。精度和相关性系数的标准参照FDA(美国食品和药物管理局)指南(文件编号：FDA-2013-D-1020，颁发者：药物评估和研究中心)。结果见表2。
表2
Figure BDA0002385739320000111
结果显示，所有成分的精度范围均在100±15％之间，且R2均≥0.99，因此，在以上浓度范围内，该方法具有较好的准确度和可靠性。
灵敏度高(即检出限低)：CT和HC的最低检出限(LOD)为0.02ng/mL，AK、6-HN、NNK、NAB的LOD为0.05ng/mL，2-HN、AB、NNT、AT、NT、NNN、NAT的LOD为0.1ng/mL。因此，本方法的检出限低，灵敏度更高，对于痕量烟碱成分也能有效进行检测。
准确定量范围大：本方法中，AK，CT，6-HN和HC的最低定量浓度(LOQ)为0.1ng/mL，2-HN、AB、NNT、AT、NT、NNN、NAT的LOQ为0.2ng/mL。NT、AK、AB、AT、NNT、6-HN、NNN、NAT的最高定量浓度(ULOQ)为1500ng/mL，2-HN、CT、HC、NNK、NAB的ULOQ为150ng/mL。本方法的准确定量范围较大，适合同一种提取方法下，不同种类和不同生长阶段的烟叶中烟碱的分析鉴定。
实施例2
回收率测定
加标回收率，是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。
本发明中，加标溶液的配制：三个水平，包括高(HQC)，中(MQC)和低(LQC)的混合加标溶液配制在100mM甲酸铵的乙腈：水(1:1v:v)中，具体内容见表3。
表3
ng/mL LQC MQC HQC
AK 20 4000 12000
CT 20 400 1200
6-HN 20 4000 12000
HC 20 400 1200
2-HN 20 400 1200
AB 20 4000 12000
NNT 20 4000 12000
AT 20 4000 12000
NT 20 4000 12000
NNN 20 4000 12000
NAT 20 4000 12000
NAB 20 400 1200
NNK 20 400 1200
首先称取0.1g的烟叶样品(本实施例选用的烟叶样品为在研的超低尼古丁含量的烟叶品种，代码17GH1867，产地美国，弗吉尼亚州，切斯特市)，分别加入1mLHQC，或1mLMQC，或1mLLQC的加标溶液，制备加标烟叶样品，且每个水平有三个平行。然后加入2mL乙腈进行萃取。将试管涡旋2分钟并超声处理5分钟。离心后，收集上清液，并将沉淀物与6mL乙腈：水(1:1v:v)混合，重复超声处理5分钟。将上清液转移至10mL容量瓶中，并用水调节至10mL,用0.45μmPTFE膜过滤备用。
由于大多数NT和代谢产物在烟叶中均具有内源性水平(即烟叶本身含有这些成分，不是绝对空白)，因此需要通过从加标样品的色谱峰面积中减去未加标样品的色谱峰面积，则可获得实际回收到的标准品的峰面积，再根据标准曲线，算出实际回收的加标样品的浓度。实际回收的加标样品浓度与理论加标浓度的百分比即为回收率。如果所有测试样品的回收率均在加标浓度的85％～115％之间，并且相对标准偏差(RSD)在20％之内，则证明方法具有可靠性。
回收率评估由日内(同一天内)回收率和日间(在三个不同的自然天进行试验)回收率两项组成，其评估标准参照FDA(美国食品和药物管理局)指南(文件编号：FDA-2013-D-1020，发行人：药物评估和研究中心)。试验结果见表4。
表4
Figure BDA0002385739320000131
Figure BDA0002385739320000141
结果显示，在LQC水平下，所有分析物的回收率和RSD分别为86.7-106.7％和1.1-10.7％；在MQC水平下，所有分析物的回收率和RSD分别为86.2-114.7％和1.9-9.6％；在HQC水平下，所有分析物的回收率和RSD分别为86.1-114.0％和1.20-9.7％。结果表明，各分析物成分在不同加标水平上的回收率均在85-115％之间，RSD均在±20％以内。结果表明本发明的方法具有足够的准确性和精密度，符合FDA(美国食品和药物管理局)指南(文件编号：FDA-2013-D-1020)。
实施例3
选择三种类型的脱水鲜烟叶，包括常规烟叶种(TBC)和两种基因修饰种RTBC和HRTBC。以上两种基因修饰品种是通过修饰黄连素样酶(BBL)基因家族，抑制BBL的催化作用，进而抑制吡啶生物碱在烟叶中合成，调控尼古丁生物合成途径。
采用本发明的方法分别对TBC、RTBC和HRTBC三种烟叶进行检测，若样品中某些成分含量超出标准曲线范围，则需进一步稀释后再进行测定。结果如下：
TBC样品中，AK、AB、NNT、AT、CT、2HN、6HN、HC、NT、NNN、NNK、NAT和NAB的浓度依次为：103.1(μg/g)、1057.0(μg/g)、261.3(μg/g)、750.3(μg/g)、3.2(μg/g)、1.2(μg/g)、17.6(μg/g)、0.1(μg/g)、42.9(mg/g)、97.2(μg/g)、40.8(μg/g)、10.2(μg/g)和0.0(μg/g)。
RTBC样品中，AK、AB、NNT、AT、CT、2HN、6HN、HC、NT、NNN、NNK、NAT和NAB的浓度依次为：71.7(μg/g)、398.5(μg/g)、123.5(μg/g)、287.4(μg/g)、2.7(μg/g)、1.2(μg/g)、17.9(μg/g)、0.2(μg/g)、15.2(mg/g)、56.1(μg/g)、20.8(μg/g)、9.3(μg/g)和0.0(μg/g)。
HRTBC样品中，AK,AB,NNT,AT,CT,2HN,6HN,HC,NT,NNN,NNK,NAT和NAB的浓度依次为：25.6(μg/g)、167.6(μg/g)、18.3(μg/g)、206.6(μg/g)、2.1(μg/g)、0.6(μg/g)、7.7(μg/g)、0.2(μg/g)、6.1(mg/g)、31.5(μg/g)、17.7(μg/g)、4.4(μg/g)和0.0(μg/g)。
结果显示，尼古丁是烟叶中的主要生物碱，约占总生物碱的90％。尼古丁在普通烟叶(TBC)中的含量高达42.9mg/g，而基因修饰的烟叶RTBC和HRTBC的烟碱含量显着降低，分别为15.2mg/g和6.1mg/g。AB和AT在TBC中的浓度也相对较高，为750.3μg/g和1057.0μg/g。但是，RTBC和HRTBC中的AB分别降低约60％和85％，RTBC和HRTBC中的AT分别降低约62％和72％。与TBC相比，RTBC和HRTBC中NNT的浓度分别降低了53％和93％。此外，RTBC和HRTBC的AK值比TBC低75％和30％。NNN和NNK的浓度在TBC，RTBC和HRTBC中依次降低。NAT在TBC和RTBC中没有显著差异，但是在HRTBC中浓度降低50％。
尼古丁及其代谢物是烟叶生长或固化过程中致癌性物质亚硝胺(TSNA:NNN,NNK,NAT,NAB)的直接前体物质。因此，减少烟叶中尼古丁及其代谢物的水平将使香烟的成瘾性最小化，并降低吸烟者患癌症的风险。本实施例测定了三种类型的烟叶包括常规烟叶种(TBC)和两种基因修饰种低尼古丁(RTBC)和超低尼古丁(HRTBC)中尼古丁及其代谢物的浓度，结果表明，与常规烟叶相比，尼古丁和大部分代谢物在两种基因修饰烟叶(RTBC)和(HRTBC)中含量显著降低，具有较好的安全性，有助于进一步试验和研发推广。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)样品预处理：将烟叶冷冻干燥磨粉，得到预处理的烟叶；
(2)样品提取：取预处理的烟叶置于收集容器中，加入萃取剂，经过离心，收集上清液，二次提取，经滤膜过滤后的滤液作为样品溶液；
(3)用双柱串联-液相色谱-质谱法对样品进行分离检测；
(4)采用样品的峰面积和标准曲线进行定量分析，计算得到烟叶中13种物质含量；
其中，所述13种物质为：尼古丁(NT)、3-羟基可替宁(HC)、可替宁(CT)、降烟碱(NNT)、安那他品(AT)、假木贼碱(AB)、氨基酮[4-(甲基氨基)-1-(3-吡啶基)1-丁酮](AK)、6-羟基烟碱(6-HN)、2-羟基烟碱(2-HN)、N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)；
所述萃取剂包括甲酸铵、乙腈和水，重量体积比例为1.0-1.3g：1.0-1.2L：0.8-1.1L；
所述双柱串联-液相色谱-质谱法中，色谱条件为：
色谱柱：以Waters Xbridge Amide 3.5μm，2.1×100mm在前、Waters Atlantis T33μm，2.1×50mm在后的顺序进行串联；柱温：30℃；进样器温度：6℃；流速：0.6mL/min；进样量1～10μL；分离时间5.5min；流动相：A为100mM甲酸铵水溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件为：第0～3min，5％～98％流动相B；第3～4min，98％流动相B；第4～4.1min，98％～5％流动相B；第4.1～5.5min，5％流动相B。
2.根据权利要求1所述的同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，在-50～-80℃真空冷冻干燥1～3h，磨粉后过40目筛。
3.根据权利要求1所述的同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，所述双柱串联-液相色谱-质谱法中，质谱条件为：
Figure FDA0003793343050000021
ESI正离子电离模式；涡轮喷射电压4500eV；离子源温度500℃；气帘气10psi；碰撞气(CAD)12psi；雾化气(GS1)60psi，加热器气体(GS2)70psi；多反应监测(MRM)。
4.根据权利要求1所述的同时检测烟叶中13种物质含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用孔径为0.45μm的PTFE膜进行过滤。
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